Sàng lọc vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 kháng CD20

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> SÀNG LỌC HỆ VECTOR BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ<br /> scFv-CH2 KHÁNG CD20<br /> Trần Minh Đạo*; Phạm Thu Thùy*; Lê Quang Huấn**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: lựa chọn được vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 và kháng thể tạo ra có khả<br /> năng liên kết với kháng nguyên CD20. Phương pháp: nghiên cứu sử dụng phương pháp cắt,<br /> gắn gen anti-CD20Fa vào 3 vector biểu hiện pET28a, pET30GB1, MPB; biến nạp, tách ADN<br /> plasmid và phương pháp biểu hiện protein (kháng thể) được tiến hành theo Sambrook và CS<br /> (2001), phương pháp ELISA và Western blot. Kết quả: gen anti-CD20Fa đã gắn vào 3 vector và<br /> 3 vector đều có khả năng biểu hiện scFv-CH2. Tuy nhiên, vector pET28a biểu hiện kháng thể<br /> scFv-CH2 và kháng thể có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng hợp cao nhất so với 2 vector<br /> pET28a và pET30GB1. Kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với kháng nguyên<br /> CD20 thương mại và CD20 biểu hiện trên tế lympho B ác tính dòng Raji. Kết luận: cả 3 vector<br /> pET28a, pET30GB1 và MPB có khả năng biểu hiện scFv-CH2. Tuy nhiên, vector pET28a được<br /> lựa chọn làm vector biểu hiện scFv-CH2. Kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết với<br /> kháng nguyên CD20 thương mại và CD20 biểu hiện trên tế lympho B ác tính dòng Raji.<br /> * Tõ khãa: Sàng lọc vector; Kháng thể scFv-CH2; Kháng CD20.<br /> <br /> Screening Vector System Expressed Anti-CD20 scFv-CH2 Antibody<br /> Summary<br /> Objectives: To screen vector expressing anti- CD20 scFv-CH2 antibody and this antibody can<br /> associate with anti-CD20 the best. Methods: Using the methods of cutting, ligating anti-CD20Fa<br /> gene to 3 expression vector pET28a, pET30GB1, MPB; transformation, plasmid DNA extraction<br /> and protein expression methods (antibody) were carried out according to Sambrook et al (2001)<br /> and ELISA, Western blot method. Results: The anti-CD20Fa gene attached to three vectors and<br /> 3 vectors have the ability to express scFv-CH2. However, the vector pET28a expressed scFvCH2 antibody the best compared to the 2 vector MPB and pET30GB1. scFv-CH2 antibody can<br /> associate with trade antigen CD20 and CD20 expression on malignant B lymphocytes (Raji).<br /> Conclusions: 3 vectors pET28a, pET30GB1 and MPB have the ability to express scFv-CH2.<br /> However, pET28a vector is selected as the expression vector scFv-C H 2. This antibody<br /> potentially associated with trade antigen CD20 and CD20 expression on malignant B<br /> lymphocytes (Raji).<br /> * Key words: Vector screening; scFv-CH2 antibody; Anti-CD20.<br /> * Bệnh viện 19.8<br /> ** Viện Công nghệ Sinh học<br /> Người phản hồi (Corresponding): Trần Minh Đạo (daohuy2003@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 26/12/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 13/01/2015<br /> Ngày bài báo được đăng: 02/03/2015<br /> <br /> 150<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Kháng thể scFv đã khắc phục được một số<br /> nhược điểm của kháng thể đơn dòng, như<br /> hạn chế tối đa hiện tượng HAMA (mAb có<br /> nguồn gốc từ chuột khi vào cơ thể do không<br /> <br /> - Lựa chọn vector biểu hiện kháng thể<br /> scFv-CH2 kháng CD20.<br /> - Xác định khả năng liên kết của kháng thể<br /> scFv-CH2 với CD20.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> <br /> NGHIÊN<br /> <br /> CỨU<br /> <br /> tương hợp với hệ miễn dịch của người, khiến<br /> cơ thể sinh ra kháng thể chống lại nó) và kích<br /> <br /> 1. Vật liệu nghiờn cứu.<br /> <br /> thước nhỏ của scFv thuận lợi khi thâm nhập<br /> <br /> - Chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3),<br /> biểu<br /> <br /> hiện<br /> <br /> vào các mô đích [5, 6]. Tuy nhiên, scFv lại có<br /> <br /> vector<br /> <br /> hạn chế như khả năng liên kết với kháng<br /> <br /> (Novagen) và vector MPB do Phòng Công<br /> <br /> nguyên và tính nhạy yếu trong phản ứng hóa<br /> <br /> nghệ Tế bào động vật cung cấp. Các mồi Fa<br /> <br /> miễn dịch (ELISA) [8]. scFv có gắn thêm vùng<br /> <br /> và CHR được thiết kế để khuếch đại đoạn gen<br /> <br /> hằng định kháng thể Fc (CH1, CH2, CH3) đã<br /> <br /> anti-CD20Fa mã hóa kháng thể scFv-CH2<br /> <br /> khắc phục được hạn chế này, tăng độ bền<br /> <br /> chứa trình tự nhận biết của enzym giới hạn<br /> <br /> của kháng thể và Fc có vai trò quan trọng<br /> <br /> BamHI và XhoI có trình tự cụ thể như sau:<br /> <br /> trong việc giết chết tế bào trực tiếp thông qua<br /> <br /> pET28a,<br /> <br /> pET30GB1<br /> <br /> Fa: ATGGGAGCCTGGATCCGTATTATCTC<br /> <br /> cơ chế gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể<br /> <br /> BamHI<br /> <br /> (CDC), hoạt hóa tế bào miễn dịch, giết chết tế<br /> <br /> CHR: CAATAGGTGCCTCGAGTGCTTTATAG<br /> <br /> XhoI<br /> <br /> bào thông qua cơ chế ADCC và gây chết tế<br /> bào theo chương trình [10].<br /> CD20 là kháng nguyên xuất hiện trên 90%<br /> tế bào lympho B ác tính và xuất hiện khoảng<br /> 85 - 90% ở bệnh nhân lympho bào nonHodgkin không dễ dàng bị đồng hóa hay biến<br /> dạng khi gắn với kháng thể [3]. CD20 là đích<br /> tiềm năng trong liệu pháp điều trị các bệnh liên<br /> quan đến tế bào lympho B ác tính [2, 7].<br /> Hiện nay có một số hệ vector biểu hiện<br /> protein (hay kháng thể) ở E. coli như: hệ<br /> vector pET, pDEST, pASK-IBA… Tuy nhiên, phụ<br /> thuộc vào protein đích để lựa chọn hệ vector,<br /> trong đó hệ pET được sử dụng phổ biến nhất<br /> trong biểu hiện protein ở E. coli và với cùng<br /> một gen đích thì mỗi vector cũng biểu hiện ở<br /> mức độ khác nhau. Vì vậy, nghiên cứu này<br /> được tiến hành nhằm:<br /> 151<br /> <br /> Enzym BamHI, XhoI và T4-ligase (New<br /> England Biolabs). Môi trường nuôi cấy E. coli<br /> LB (tryptone, NaCl, cao nấm men và agar đối<br /> với môi trường thạch) và các hóa chất khác<br /> sử dụng trong sinh học phân tử và công nghệ<br /> gen.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Phương pháp cắt, gắn sản phẩm PCR vào<br /> vector biểu hiện pET28a, pET30GB1, MPB;<br /> biến nạp, tách ADN plasmid phương pháp<br /> biểu hiện protein được tiến hành theo<br /> Sambrook và CS (2001) [9]. Phản ứng<br /> Western blot xác định hoạt tính liên kết của<br /> kháng thể scFv-CH2 tạo ra với kháng thể cộng<br /> hợp kháng đuôi histidine. Phản ứng ELISA<br /> xác định hoạt tính liên kết của kháng thể<br /> scFv-CH2 tạo ra với CD20 thương mại (SB) và<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> CD20 trên dòng tế bào lympho B ác tính dòng<br /> Raji do Học viện Quân y cung cấp.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Nhân dòng các vector biểu hiện scFvCH2.<br /> 3 vector (pET28a, pET30GB1; MBP) biểu<br /> hiện được lựa chọn để gắn gen anti-CD20Fa<br /> mã hóa kháng thể scFv-CH2, 3 vector này đã<br /> có sẵn 2 đoạn trình tự gen mã hóa cho 6<br /> histidine ở hai đầu của gen đích sau khi gắn<br /> vào, rất thuận tiện cho việc thu nhận, tinh<br /> sạch và nhận biết kháng thể scFv-CH2.<br /> Gen anti-CD20Fa được tinh sạch và thôi gel<br /> theo kit (Hãng QIAGEN), sau đó cắt bằng<br /> BamHI và XhoI. Các vector pET28a,<br /> pET30GB1 và MBP cũng được cắt bằng<br /> BamHI và XhoI. Tạo vector tái tổ hợp bằng<br /> cách đem gắn gen anti-CD20Fa vào 3 vector<br /> cùng xử lý với BamHI và XhoI. Các vector này<br /> được biến nạp vào chủng DH5α nhân lên<br /> lượng lớn.<br /> Sử dụng PCR để chọn dòng từ các khuẩn<br /> lạc, chọn 6 khuẩn lạc (mỗi vector tái tổ hợp<br /> lấy 2 khuẩn lạc) để PCR với các cặp mồi<br /> tương ứng (pET28a: T7F/R; pET30GB1:<br /> T7F/R; MBP: Fa/C H R). Khuẩn lạc nào chứa<br /> plasmid tái tổ hợp (pET28a/anti-CD20Fa) và<br /> pET30GB1/anti-CD20Fa), sản phẩm PCR từ<br /> khuẩn lạc đó cho kích thước gần 200 bp của<br /> mồi T7 cộng với kích thước gen anti-CD20Fa<br /> khoảng 1.000 bp xấp xỉ 1.200 bp. Khuẩn lạc<br /> chứa plasmid tái tổ hợp (MBP/anti-CD20Fa),<br /> sản phẩm PCR từ khuẩn lạc đó cho kích<br /> thước bằng với kích thước gen anti-CD20Fa<br /> khoảng 1.000 bp.<br /> <br /> 152<br /> <br /> Hình 1: Ảnh điện di sản phẩm PCR gen<br /> anti-CD20Fa gắn vào các vector biểu hiện<br /> M: marker ADN; 1, 2: 2 khuẩn lạc chứa<br /> vector MBP; 3, 4: 2 khuẩn lạc chứa vector<br /> pET30GB1; 5, 6: 2 khuẩn lạc chứa vector<br /> pET28a.<br /> Hai khuẩn lạc chứa vector MBP (đường<br /> chạy số 1, 2) có băng kích thước khoảng<br /> 1.000 bp, 2 khuẩn lạc chứa vector pET30GB1<br /> (đường chạy số 3, 4) và 2 khuẩn lạc chứa<br /> vector pET28a (đường chạy số 5, 6) cùng có<br /> băng kích thước ~ 1.200 bp. Kết quả này phù<br /> hợp với tính toán trên lý thuyết. Như vậy, gen<br /> anti-CD20Fa đã gắn vào các vector biểu hiện<br /> (pET28a, pET30GB1 và MBP).<br /> 2. Biểu hiện kháng thể scFv-CH2 trong hệ<br /> vector.<br /> 3 plasmid tái tổ hợp (pET28a/antiCD20Fa,<br /> pET30GB1/anti-CD20Fa<br /> và<br /> MBP/anti-CD20Fa) được biến nạp vào tế<br /> bào E. coli BL21, nuôi biểu hiện ở 37oC trong<br /> 4 giờ có bổ sung Ka (50 µg/ml) và chất cảm<br /> ứng IPTG (0,5 mM).<br /> Các mẫu cảm ứng IPTG (đường chạy số 2;<br /> 4; 6) xuất hiện một băng protein mới có kích<br /> thước tương ứng (pET28a: ~ 43 kDa;<br /> pET30GB1: ~ 50 kDa; MBP: ~ 85 kDa), còn ở<br /> mẫu không cảm ứng (đường chạy số 1; 3; 5)<br /> không thấy xuất hiện<br /> các băng này. Các<br /> băng protein xuất hiện mới này khả năng là<br /> protein tái tổ hợp đích cần biểu hiện. Như vậy,<br /> các vector tái tổ hợp đều có khả năng biểu<br /> hiện kháng thể tái tổ hợp đích.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> Theo thiết kế, scFv-CH2 tái tổ hợp gắn<br /> thêm 6 histidine ở 2 đầu. Dựa vào đặc điểm<br /> này, có thể xác định hoạt tính liên kết của<br /> kháng thể scFv-CH2 tạo ra với kháng thể cộng<br /> hợp kháng đuôi histidie.<br /> Vector pET28a (đường số 1) và vector<br /> pET30GB1 (đường số 2) xuất hiện băng kích<br /> thước nằm trong khoảng 40 - 55 kDa. Tuy<br /> nhiên, kích thước protein của đường số 1 (~<br /> 43 kDa) thấp hơn và xuất hiện đậm hơn<br /> đường số 2 (~ 50 kDa), vector MBP (đường<br /> số 3, 4) không xuất hiện băng kích thước ~ 85<br /> kDa theo tính toán lý thuyết.<br /> <br /> Hình 2: Ảnh điện di biểu hiện gen mã hóa<br /> scFv-CH2 trong 3 vector.<br /> M: marker; pET28a (1: Trước cảm ứng; 2:<br /> Sau cảm ứng) pET30GB1 (3: Trước cảm ứng;<br /> 4: Sau cảm ứng) MBP (5: Trước cảm ứng; 6:<br /> Sau cảm ứng).<br /> 2. Chọn vector biểu hiện scFv-CH2.<br /> Các vector đều có khả năng biểu hiện<br /> protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, để lựa chọn<br /> vector biểu hiện kháng thể scFv-CH2 có hàm<br /> lượng cao nhất, cần tiến hành phản ứng<br /> Western blot.<br /> <br /> Như vậy, kháng thể tái tổ hợp từ vector<br /> pET28a có hoạt tính liên kết với kháng thể<br /> cộng hợp cao nhất so với 2 vector MBP,<br /> pET30GB1. Mặt khác, kháng thể tạo ra từ<br /> pET28a không gắn đoạn protein dung hợp<br /> nên sau khi tinh sạch protein này không phải<br /> loại bỏ phần protein dung hợp mà vẫn tiến<br /> hành ngay nghiên cứu về chẩn đoán bệnh.<br /> Sau khi sơ bộ kiểm tra khả năng biểu hiện<br /> và xác định hoạt tính của kháng thể bằng<br /> phản ứng Western blot, chúng tôi thấy vector<br /> tái tổ hợp pET28a/anti-CD20Fa biểu hiện tốt<br /> và có hoạt tính liên kết với kháng thể cộng<br /> hợp cao nhất so với 2 vector pET30GB1/antiCD20Fa và MBP/anti-CD20Fa. Vì vậy,<br /> pET28a được lựa chọn làm vector biểu hiện<br /> gen anti-CD20Fa.<br /> * Xác định khả năng liên kết của scFv-CH2<br /> với CD20:<br /> <br /> Hình 3: Hình ảnh Western blot của<br /> kháng thể scFv-CH2 ở 3 vector biểu hiện.<br /> M: Marker protein; 1: pET28a;<br /> pET30GB1; 3, 4: MBP.<br /> 153<br /> <br /> 2:<br /> <br /> Một số nhà khoa học đã sử dụng phương<br /> pháp ELISA để xác định khả năng liên kết của<br /> kháng thể kháng CD20 tạo ra với CD20 trên<br /> tế bào lympho B<br /> ác tính dòng Raji hay<br /> dòng Daudi như Anna [1], Geng [4] và Fang<br /> [2].<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2015<br /> <br /> Tương tự, chúng tôi xác định khả năng liên<br /> kết của kháng thể scFv-CH2 tạo ra với CD20<br /> bằng ELISA cạnh tranh. Phản ứng ELISA<br /> gồm scFv-C H 2, kháng nguyên CD20 tái tổ<br /> hợp thương mại (SB) và tế bào ung thư máu<br /> dòng lympho B có biểu hiện CD20 (Raji) do<br /> Học viện Quân y cung cấp.<br /> <br /> A<br /> Giá trị OD<br /> <br /> B<br /> Hình 4: Hình ảnh các tế bào lympho B và kết<br /> quả ELISA xác định khả năng liên kết của<br /> kháng thể scFv-CH2 với CD20.<br /> A: Hình ảnh các tế bào lympho B biểu hiện<br /> CD20 ác tính dưới kính hiển vi điện tử (độ<br /> phóng đại 400 lần).<br /> B: Biểu đồ kết quả ELISA xác định khả<br /> năng liên kết của kháng thể scFv-CH2 với<br /> 154<br /> <br /> kháng nguyên CD20 thương mại và CD20 trên<br /> tế bào lympho B (Raji). TN1 - TN6: Thí<br /> nghiệm 1 - thí nghiệm 6.<br /> Kết quả ELISA cạnh tranh cho thấy, thí<br /> nghiệm 2 và 6 không có kháng thể scFv-CH2<br /> xuất hiện màu và có giá trị OD450nm tương ứng là<br /> 0,185 và 0,165. Các thí nghiệm 1, 5 (TN1, TN5)<br /> có kháng thể scFv-CH2 không xuất hiện màu<br /> (OD450nm tương ứng là 0,059 và 0,06) và 2 thí<br /> nghiệm đối chứng (TN3 và TN4) cũng không<br /> xuất hiện màu (OD450nm tương ứng là 0,056 và<br /> 0,061) thấp hơn nhiều thí nghiệm 2 và 6. Như<br /> vậy, qua phản ứng ELISA có thể khẳng định<br /> kháng thể scFv-CH2 tạo ra có khả năng liên kết<br /> đặc hiệu với kháng nguyên CD20 thương<br /> mại và CD20 trên tế bào lympho B ác tính dòng<br /> Raji.<br /> Kết quả của chúng tôi tương tự nghiên cứu<br /> của Anna, Geng và Fang đã tạo được kháng<br /> thể tái tổ hợp dạng scFv-Fc và scFv-LDP<br /> kháng CD20, kháng thể này có hoạt tính liên<br /> kết với CD20. Tuy nhiên, ở nghiên cứu này,<br /> gen mã hóa scFv được tách dòng từ ARN của<br /> tủy gà đã gây miễn dịch với CD20, gen mã<br /> hóa scFv-CH2 được gắn vào vector biểu hiện<br /> pET28a. ScFv-CH2 có khối lượng ~ 43 kDa<br /> được biểu hiện ở E. coli (BL21), tinh sạch trên<br /> cột sắc ký ái lực Ni2+, có khả năng liên kết với<br /> CD20 thương mại (SB) và CD20 trên dòng tế<br /> bào Raji.<br /> KẾT LUẬN<br /> Gen anti-CD20Fa mã hóa cho kháng thể<br /> scFv-CH2 đã gắn vào 3 vector biểu hiện. Cả<br /> 3 vector biểu hiện pET28a, pET30GB1 và<br /> MBP có khả năng biểu hiện kháng thể scFvCH2. Vector pET28a được lựa chọn làm vector<br /> biểu hiện scFv-CH2.<br /> <br />