Sinh hóa miễn dịch - Chương 7

Chia sẻ: Nguyễn NHi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:0

Thêm vào BST

Báo xấu

148
lượt xem 39
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tài liệu tham khảo giáo trình Sinh hóa miễn dịch gồm 7 chương - Chương 7 Một số phương pháp phân tích dựa trên miễn dịch

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sinh hóa miễn dịch - Chương 7

CHƯƠNG 7 M TS PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH D A TRÊN MI N D CH Trong nh ng năm g n ñây, có nhi u xét nghi m ñ c hi u và r t nh y d a trên k thu t hoá - mi n d ch ñã ñư c ñưa vào trong xét nghi m y khoa v i m c ñích ch n ñoán ñ có hư ng ñi u tr thích h p, tri n khai vacxin ñ phòng b nh k p th i, tri n khai các bi n pháp v sinh - d ch t h c ñ ngăn ng a lây lan c a m n b nh. Nguyên lý c a chúng ñư c d a trên các ph n ng kháng nguyên - kháng th . Áp d ng nguyên lý này ñ xác ñ nh ñ c t trong th c ph m ñã ñư c th c hi n trong kho ng 20 năm tr l i ñây. Hai nguyên nhân thúc ñ y áp d ng rông rãi phương pháp này là vi c s n xu t ñư c kháng th ñơn dòng và vi c phát tri n c a phương pháp ELISA. Vi c phát tri n ñư c phương pháp ELISA ñã góp ph n quan tr ng ñưa phương pháp phân tích d a trên mi n d ch h c vào ng d ng r ng rãi. 7.1. Ph n ng kháng nguyên và kháng th Kháng nguyên và kháng th ñ c hi u c a nó có ch a c u trúc tương ng b sung, chính vì th nó làm cho ph n quy t ñ nh kháng nguyên kh p r t khít v i v trí g n trên kháng th . T i ñó ch ng ñư c n i v i nhau b ng nh ng liên k t y u gi a các phân t . 7.1.1. Ph n ng thu n ngh ch và h ng s cân b ng
M t v trí c a kháng th ch k t h p v i môt epitop kháng nguyên, ph n ng kháng nguyên kháng th là ph n ng thu t ngh ch và có th bi u di n như sau:. k1 KN + KT KN - KT k2 Trong ñó: k1 là h ng s cân b ng ph n ng thu n. k2 là h ng s cân b ng ph n ng ngh ch. H ng s cân b ng ñư c bi u di n như sau [ KN − KT ] k =1 K= [KN ][KT ] k 2 Ph n ng gi a kháng nguyên và kháng th x y ra dư i tác d ng c a nhi u liên k t (Hình 7.1.) - Liên k t hydro. - liên k t tĩnh ñi n. - Liên k t Van der wals (liên k t gi a các ñám mây ñi n t ). - Liên k t k nư c. - Hình 7.1: L c hút gi a kháng nguyên - kháng th
Nh n bi t ph n ng KN-KT thông qua các ph n ng sau ñây - Ph n ng k t t a. - Ph n ng ngưng k t. - C ñ nh b th . - Ph n ng phát huỳnh quang. - Ph n ng g n enzyme. 7.1.2. Ph n ng k t t a Khi kháng th ñ c hi u ph m ng v i kháng nguyên hoà tan m t n ng ñ nh t ñ nh s xu t hi n k t t a nhìn th y b ng m t thư ng. Ph n ng này dùng ñ phát hi n kháng nguyên hòa tan khi có kháng th ñ c hi u, ho c ñ phát hi n kháng th khi có kháng nguyên hòa tan ñ c hi u Ph n ng t i ưu khi ñ và tương ñ ng v n ng ñ kháng nguyên , kháng th (hinh 7.2) 6.2.3. 6.66.3. Ph n ng ngưng k t. PP +P6' ' Hình 7.2:. ð th bi u di n m c k t t a ph thu c vào t l KT-KN KhikKk Khi t l tương ñ ng s t o màng lư i t t nh t, n u th a kháng th epitop kháng nguyên bão hoà nhưng không liên k t chéo ñư c ñư c v i
nhau thông qua g n v trí k t h p kháng nguyên. N u th a kháng nguyên paratop kháng th bão hoà, nhưng không k t h p ñư c v i nhau thông qua epitop. 7.1.3. Ph n ng ngưng k t ði u ki n x y ra ph n ng là ph i có kháng nguyên h u hình ñó là nh ng kháng nguyên có kích thư c l n như h ng c u, vi sinh v t. Kháng nguyên h u hình có epitop b m t có th liên k t chéo v i các kháng th , t o thành c m và nhìn ñư c b ng m t thư ng. Ph n ng ngưng k t nh y hơn ph n ng k t t a nên ñư c dùng ñ ñ nh tính và bán ñ nh lư ng kháng th trong huy t thanh. Cách ti n hành ph n ng ngưng k t. - Pha loãng kháng th có ñ pha loãng : 1/20; 1/40; 1/80. - Cho kháng nguyên h u hình vào các ng nghi m ch a kháng th trên. - Hi u giá kháng th là ñ pha loãng cao nh t mà v n x y ra ngưng k t Ví d trong ng th 3 có ñ pha loãng cao nh t nhưng v n phát hi n ñư c ph n ng ngưng k t ta nói hi u giá c a hy t thanh là 80. 7.1.4. Ph n ng k t h p b th V nguyên t c kháng nguyên hoà tan có ph n ng v i kháng th do ñó s c ñ nh b th . Còn ngư c l i s có b th t do. Khi h th ng ch th c a các h ng càu nh y c m như h ng c u c u (SRBC) ñư c thêm vào, m c ñ phân hu h ng c u nh y c m (tan h ng c u nh y c m) s t l v i b th t do. Dư vào k t qu xét nghi m ta k t lu n là m u âm tính hoăc dương tính. Bư c 1:Chu n b hai h th ng (hinh 7.3): - H th ng xét nghi m bao g m: Kháng nguyên, kháng th . - H th ng ch th g m: Hông c u c u và kháng th kháng h ng c u c u. - B th
H th ng ch th Hê th ng xét nghi m Hång cÇu Bæ thÓ cõu(SRBC) Kh¸ng thÓ Kh¸ng thÓ kháng- SRBC Kh¸ng nguyªn - Hình 7.4: H th ng xét nghi m và h th ng ch thi Bư c 2: B sung b th vào h th ng xét nghi m (hình 7.5) a) Kháng nguyên không ñ c hi u v i kháng th có b th t do b)Kháng nguyên ñ c hi u v i kháng th không có b th t do (b th c ñ nh) Kh¸ng Kh¸ng thÓ thÓ Kh¸ng Kh¸ng nguyªn nguyªn a b Hình 7.5: Ph n ng kháng nguyên-kháng th có b sung b th
Bư c 3: B sung h th ng ch thi. a) B th t do có ph n ng v i ch th (t o ph c kháng th h ng c u c u- kháng nguyên kháng h ng c u c u- b th ) (hình 7.6a) b) B th c ñ nh không có ph n ng v i ch th (do t o ph c h KN- KT-BT) ( 7.6 b) KT HCC KT, K HCC KN a b Hình 7.6: B sung h th ng ch th Bư c 4: K t qu xét nghi m. a) Ân tính: do không có kháng th c n xét nghi m, nên không có ph c KN- KT-BT. Do ñó b th t do k t h p v i h ng c u nh y c m và x y ra hi n tư ng tan máu (hình 7.7a). b) Dương tính: Có kháng th c n xét nghi m, nên t n t i ph c KN-KT-BT. Do ñó b th c ñ nh s không có s k t h p v i h ng c u nh y c m, k t qu là không có hi n tư ng tan máu (hình 7.7b).
a b Hình 7.7: K t qu xét nghi m ng d ng c a phương pháp: Phương pháp này ñư c ng d ng r ng rãi trong sàng l c lâm sàng. ð c bi t là trong phép th ñ i v i xoán khu n trong bênh giang mai. 7.1.5. Các y u t nh hư n ñ n ph n ng kháng nguyên kháng th - nh hư ng c a kích thư c, n ng ñ c a kháng th . - nh hư ng c a l c ñ y gi a các kháng nguyên. - Tác d ng c a enzyme. - Tác d ng c a các ch t keo. - nh hư ng ñ c tính kháng nguyên. - nh hư ng c a pH, nhi t ñ , th i gian ph n ng. 7.2. K thu t huỳnh quang mi n d ch 7.2.1. Cơ s c a phương pháp Trong k thu t này kháng th ho c kháng nguyên ñư c ñánh d u b ng thu c nhu m huỳnh quang. V nguyên t c: k thu t ñư c d a trên tính ch t c a thu c nhu m khi ñư c kích thích b i b c x có bư c sóng thích h p s phát sáng: - Fluorescein phát quang màu vàng l c. - Rodamin phát quang cho màu ñ da cam.
Kháng th có g n thu c nhu m huỳnh quang g i là g i là kháng th huỳnh quang hay kháng th ñánh d u 7.2.2. Hai phương pháp k thu t huỳnh quang mi n d ch Phương pháp huỳnh quang MD tr c ti p (hình 7.8) M c ñích c a phương pháp: Xác ñ nh vi sinh v t gây b nh trên bênh ph m, Ví d như xác ñ nh Streptococcus pyrogenes t h ng b nh nhân Các bư c ti n hành - C ñ nh tiêu b n trên phi n kính - Ph kháng th huỳnh quang kháng th lên - Cho kháng th huỳnh quang g n v i t bào - R a lo i kháng th không g n v i t bào - Quan sát dư i kính hi n vi huỳnh quang, ch có vi khu n g n ñ c hi u v i kháng th huỳnh quang m i phát sáng và quan sát ñư c Phương pháp huỳnh quang MD gián ti p M c ñích Phương pháp này thư ng dùng xác ñ nh kháng th trong th d ch c a b nh nhân. Ví d xác ñ nh IgG kháng spirochet có trong huy t thanh ho c nư c b t b nh nhân viêm l i. Phương pháp này nh y hơn phương pháp tr c ti p. Các bư c ti n hành. - C ñ nh tiêu b n (kháng nguyên) trên phi n kính. - Cho kháng th huy t thanh b nh nhân ph n ng v i kháng nguyên (vi khu n gây b nh). - Cho kháng th có ñánh d u huỳnh quang ñ kháng th ph n ng ñ c hi u v i ph c h p kháng nguyên-kháng th . - R a nh ng ph n không ph n ng ñ c hi u gi a kháng th huỳnh quang v i ph c h p kháng nguyên- kháng th . - Soi ñ c k t qu b ng ñèn huỳnh quang (ñèn UV).
Hình 6.8. K thu t huỳnh quang mi n d ch tr c ti p Mô ph ng phương pháp huỳnh quang gián ti p Bư c 1:C ñ nh tiêu b n trên phi n kính. Bư c 2: Tráng kính vơí kháng th ñ c hi u ñ t o ph c h p KN-KT.
Bư c 3:Tráng kháng th ñ c hi u v i kháng th có g n v i thu c nhu m huỳnh quang. Bư c 4:Soi ñ c k t qu b ng ñèn hyùnh quang (ñèn UV). 7.3. Thí nghi m mi n d ch phóng x Nguyên t c: V nguyên t c tương t như huỳnh quang mi n d ch, nhưng khác là kháng nguyên ho c kháng th ñ ơc ñánh d u b ng ch t phóng x (126I ). Thí nghi m này do Rosalyn Yalow ñ ngh năm 1960 ñ xác ñ nh n ng ñ insulin trong huy t tương. Nh phát minh này mà bà ñã nh n gi i thư ng Noben năm 1977. Ngày nay phương pháp này ñư c s dung ñ xác ñ nh hoocmon, globulin mi n d ch, kháng nguyên c a virus Các bư c ti n hành. - L y m t lư ng chính xác kháng nguyên có ñánh d u b ng ch t phóng x (ví d 126I ) - Cho lư ng kháng nguyên ñánh d u nói trên tác d ng ñ c hi u v i lư ng kháng th v a ñ . - R a s ch kháng ngyuyên ñánh d u không b t c p v i kháng th . - ðo ñ phóng x c a ph c ch t kháng nguyên ñánh d u - kháng th (A) - Cũng thí nghi m như trên nhưng ñây ta thêm m t lư ng kháng nguyên huy t thanh có nh ng ñ c tính tương t như kháng nguyên ñánh d u. Do c nh tranh mà kháng nguyên này k t h p ñ c hi u v i kháng th , sau ñó lư ng kháng th dư m i k t h p v i kháng nguyên ñánh d u. - R a nh ng kháng nguyên ñánh d u không b t c p v i kháng th - ðo ñ phóng x c a ph c kháng nguyên ñánh d u v i kháng th còn l i (B)
- T giá tr A&B ta tính ñư c n ng ñ c a kháng nguyên huy t thanh c n nghiên c u. 7.4. K thu t ch t h p ph mi n d ch g n enzym (ELISA - Enzyme - Linker Immunosorbent Assay) Nh ng xét nghi m h p ph mi n d ch g n enzyme là k thu t khá nh y và ñơn gi n, cho phép xác ñ nh kháng nguyên ho c kháng th m có n ng ñ r t th p (kho ng 0,1 mg/ml). So v i phương pháp mi n d ch phóng x thì phương pháp này ñơn gi n r ti n an toàn mà v n ñ m b o ñ chính xác. Các xét nghi m ñư c ti n hành trên b n nh a polystyren có 96 gi ng ñáy b ng, th tích m i gi ng kho ng 200 l. Nguyên t c chung c a k thu t ELISA: Nguyên t c chung c a k thu t ELISA là t o liên k t ñ c hi u gi a kháng nguyên và kháng th . S liên k t ñó cho phép xác ñ nh s có m t c a kháng th ho c kháng nguyên. Ngư i ta s d ng kháng th g n c ng h p enzym sau ñó b sung cơ ch t, enzym th y phân cơ ch t t o thành ch t làm thay ñ i màu dung d ch. Tùy thu c vào cư ng ñ màu dung d ch ta suy ra n ng ñ kháng nguyên ho c kháng th c n nghiêm c u. Các enzyme thư ng dùng là: (galactosidase; glucoxydase; akanline phosphotasen,...) Ngoài ra ñ tăng ñ nh y c a phương pháp ngư i ta s d ng h th ng công h p biotin -avidin, biotin -sprept. H th ng c ng h p mi n d ch biotin - avadin. Biotin ( vitaminH) ñư c t ng h p t sinh v t ho c th c v t có tr ng lư ng phân t kho ng 244Da . Biotin có ái l c v i avidin (là ch t có nhi u trong lòng tr ng tr ng). Avidin có 4 v trí trên phân t liên k t v i biotin, và như th biotin d dàng k t h p v i protein: kháng th , enzyme và các lo i kháng nguyên khác. Phương pháp này nó s nâng cao ñ nh y c a xét nghi m ñ c bi t là các xét nghi m mi n d ch mà kháng nguyên trong pha r n. H th ng c ng h p mi n d ch biotin - strept. Ngư i ta cũng tìm th y ch t ho t tính tương t như avidin t x khu n và như v y ta có h th ng c ng h p mi n d ch biotin - strept trong xét nghi m
mi n d ch. H th ng c ng h p mi n d ch biotin - strept (avidin) dùng trong xét nghi m mi n d ch ñ c bi t. vai trò c a avidin và strept avidin có th thay ñ i cho nhau. Ngày nay b kít này ñã ñư c ch t o t các hãng n i ti ng trên th gi i.. Các kháng nguyên ho c kháng th c n xác ñ nh ñư c h p ph tr c ti p ho c gián ti p lên b m t c a gi ng nh a. Sau ñó m t ph ng c a gi ng ñư c bao ph b ng m t lo i ñ m ch a protein, thư ng là gelatin ho c BSA ñ ngăn ng a s liên k t không ñ c hi u ñ i v i b n nh a. Có nhi u k thu t ELISA , dưói ñây s trình bày k thu t ELI AE tóm b t kháng ngyuên và ELISE c nh tranh (hình 7.9). Hình 7.9: K thu t ELI SA 7.5.1. Phương pháp ELI SA tóm b t khánh nguyên (bánh k p) Phương pháp này dùng ñ xác ñ nh nh ng ch t có phân t lư ng l n. v nguyên tác kháng th g n lên ch t mang (thành gi ng). Ngư i ta b sung KN, kháng th th 2 ñ KT2 k t h p v i KN (c n phân tích) d ng bánh k p. Sau ñó r a trôi ph n không b t c p và b sung kháng th c ng h p
enzyme, cơ ch t. Enzyme chuy n cơ ch t thành h p ch t màu ñư c xác ñ nh b ng ph k . T n ng ñ ch t màu ta tính ñư c n ng ñ ch t c n phân tích. Bư c 1: Nh KT1 vào gi ng ñ cho KT1 bám vào thành gi ng (antitoxin). KT1 Bư c 2: Che b n b ng protein Protein Bư c 3: Nh kháng nguyên ñ c hi u (toxin) ñ KN b t c p v i KT1 Kháng nguyên
Bư c 4: B sung KT2 ñ t o ph c h p KT1-KN-KT2 KT2 Bư c 5: sung kháng th c ng h p enzym ñ enzym ( KT.E) ñ l o phúc h p KT1-KN-KT2- KT .E. KH-E Bư c 6: B sung cơ chât ñ enzym th y phân cơ ch t t o thành ch t màu
- Cơ ch t Bư c 7: Enzym chuy n cơ ch t thành h p ch t màu xanh Cơ ch t Màu c a dung d ch có th phát hi n b ng m t ho c ph k , t m t ñ quang ta tính ñư c n ng ñ c a kháng nguyên ( n ng ñ ñ c t ). 7.4.2. Phương pháp ELISA c nh tranh Nguyên t c: C ng h p kháng nguyên và protein (hepten) ñư c c ñ nh trên b m t ch t r n. Cho m t lư ng kháng nguyên t do và kháng th c ng h p enzyme vào. Kháng nguyên c ñ nh và kháng nguyên t do c nh tranh nhau bám vào
kháng th . Lư ng kháng nguyên t do càng nhi u thì kháng th b kháng nguyên c ñ nh gi l i càng ít. Sau khi r a trôi các ch t còn dư, b sung cơ ch t ñ enzyme phân hu thành các h p ch t màu. Màu c a dung d ch có th phát hi n b ng ph k , t m t ñ quang A1, A2 c a m u ch ng và m u nghiên c u ta tính ñư c n ng ñ c a kháng nguyên (n ng ñ ñ c t ) theo công th c A1 − A2 .100;% C= A1 Trong ñó: A1 là m t ñ quang c a m u ch ng. A2 M t ñ quang c a m u nghiên c u. N u C ≥ 50% thì ñư c coi là dương tính. Nh ng test thư ng s d ng: Các enzyme ñư c dùng ñ c bi t nhi u trong nh ng test nhanh như spot test , dip test. Ưu ñi m c a test là ñ s d ng, r ti n nhanh và ñ nh y cao. Tuy nhiên s d ng test thì ngư i nghiên c u c n ph i hi u rõ nghiên c u c mình ñ s d ng test cho thích h p. ng d ng: K thu t này dùng ñ ñ nh tính ho c ñ nh lư ng các ch t có phân t lư ng nh , ñ c t c a n m m c, dư lư ng thu c tr sâu, dư lư ng ch t kháng sinh. Các bư c th c hi n: Bư c 1: G n c ng h p SBA-afatoxi B1(AFB1) (A FB c ñ nh trên protein hapten - SBA) AFB 1 AFB1 BS A BSA AFB1 AFB1 C ng h p protein BSA BSA (BSA) và kháng nguyên (AFB)
Bư c 2: Tráng gi ng b ng protein Protein tráng gi ng AFB AFB 1 1 BS BS A A Bư c 3: Cho ti p c ng h p kháng th g n enzyme vào m u xét nghi m và m u ch ng ñ t o ph c h p KN-.KT.E,KN c ñ nh - KT AFB AFB Kháng th c ng 1 1 h p enzyme BS BS A A M u ch ng không có A FB Trong m u xét nghi m, n u kháng nguyên t do càng nhi u thì kháng th g n v i kháng nguyên c ñ nh càng ít.
AFB B1 1 Kháng th c ng h p enzyme, kháng BS BS nguyên A FB A A M u nghiên c u có có A FB t do Bư c 4: R a trôi nh ng kháng th không b t c p v i kháng nguyên c ñ nh c a m u ch ng và m u nghiên c u. Như v y m u ch ng không có kháng nguyên t do nên kháng th c ng h p b kháng nguyên c ñ nh gi l i nhi u hơn. AF AF AF AF BS BS BS BS M u ñ i ch ng và m u nghiên c u sau khi r a trôi
Bư c 5: B sung cơ ch t. AF AF AF AF Cơ ch t BS BS BS BS Bư c 6:Cơ ch t b enzyme phân hu thành h p ch t có màu xanh AF AF AF AF BS BS BS BS M u ch ng có màu ñ m hơn m u nghiên c u. 7.5. K thu t th m mi n d ch ng d ng: K thu t này dùng nhi u trong chu n ñoán nhi m HIV, nhi m khu n và xác ñ nh kháng th ñơn dòng.
K thu t g m nhi u bư c ñư c t ng h p c a 3 phương pháp chính (ñi n di SDS- Page, wethern bot, ELISE) - ði n di protein trên gel acrylamit ñ tách protein. - Chuy n protein t b ng gel lên màng lai (nitroxenlulose) - Ph huy t thanh ch a kháng th lên màng lai và ti n hành lai - R a nh ng kháng th không b t c p kháng nguyên trên màng lai ( proten) - Thêm kháng kháng th c ng h p enzym ñ kháng th ph n ng v i ph c h p (kháng nguyên - kháng th ). - B sung cơ ch t ñ enzyme th y phân cơ ch t thành dung d ch màu. - Xác ñ nh n ng ñ kháng th trong huy t thanh thông qua vi c ño màu dung d ch b ng ph k . 7.6. Phương pháp s c ký ái l c mi n d ch. Thông thư ng các ñ c t n m m c (AFB1) trong nông s n th c ph m r t th p ( d ng lư ng v t). ð ñ nh lư ng v i ñ chính xác AFB1 ta c n ph i làm giàu m u b ng phương pháp s c ký ái l c mi n d ch. S c ký ái l c mi n d ch ñư c d a trên ph n ng ñ c hi u gi a kháng th và kháng nguyên (AFB1). Phương pháp này không nh ng ch ñ c hi u mà còn ñơn gi n, d th c hi n và không ñ c h i cho ngư i s d ng. Nguyên lý c a s c ký ái l c mi n d ch C t s c ký ái l c mi n d ch ñư c minh ho trên hình 7.10. Trên nh ng h t gel kháng th ñ c hi u v i ch t c n phân tích ñư c g n m t cách b n v ng nhưng không m t ho t tính. Các h t gel này ñư c nh i trong m t c t nh (c t s c ký). Khi cho d ch chi t m u qua các c t này các ch t c n phân tích (kháng nguyên) s b kháng th gi l i. Sau khi toàn b m u ñã qua c t, ta r a c t ñ lo i b nh ng ph n không b t c p ñ c hi u v i kháng th . Sau ñó s d ng dung môi ñ kéo kháng nguyên ra kh i kháng th . Dung d ch thu ñư c, xác ñ nh b ng phương pháp ELISA ho c m t s phương pháp phân tích khác.