Sự tăng trưởng và tích lũy lignan của cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus (Schum. & Thonn.)) nuôi cấy quang tự dưỡng dưới ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng

TAP CHI SINH HOC 2014, 36(2): 203­209<br /> Sự tăng trưởng và tích lũy lignan của cây diệp hạ châu đắng<br />  DOI: 10.15625/0866­7160.2014­X<br /> <br /> <br /> <br /> SỰ TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY LIGNAN CỦA CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG <br /> (Phyllanthus amarus (Schum. & Thonn.)) NUÔI CẤY QUANG TỰ DƯỠNG DƯỚI <br /> ẢNH HƯỞNG CỦA CƯỜNG ĐỘ ÁNH SÁNG VÀ THỜI GIAN CHIẾU SÁNG<br /> <br /> Phạm Minh Duy, Nguyễn Thị Quỳnh*<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *qtnguyen_vn@yahoo.com<br /> <br /> TÓM TẮT: Cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng là hai  trong số những yếu tố quan trọng <br /> đối với sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp của thực vật nuôi cấy  in vitro, nhất là trong <br /> điều kiện nuôi cấy quang tự  dưỡng (môi trường không đường, không vitamin). Đốt thân cây  <br /> diệp hạ châu đắng mang một lá được nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng trong hộp Magenta GA­<br /> 7 (V = 370 ml) có hai lỗ trao đổi khí (Φ = 1 cm) ở nắp hộp được dán màng Millipore (Φ = 0,45  <br /> µm). Thí nghiệm được tiến hành với ba mức cường độ  ánh sáng (80, 120 hay 160 µmol m ­2 s­1) <br /> kết hợp với ba mức thời gian chiếu sáng (8, 12 hay 16 giờ/ngày) trong điều kiện nhiệt độ 25 ±  <br /> 2oC và ẩm độ  tương đối 50% ± 10%. Môi trường nuôi cấy là môi trường MS gồm thành phần  <br /> khoáng đa lượng giảm 1/2 không bổ sung đường và vitamin.  Ở  ngày thứ  40, cây diệp hạ  châu  <br /> đắng tăng trưởng tốt hơn khi được nuôi cấy trong các điều kiện cường độ ánh sáng cao hơn và  <br /> thời gian chiếu sáng dài hơn. Cây diệp hạ châu đắng có gia tăng khối lượng tươi, gia tăng khối  <br /> lượng khô, đường kính thân và chiều cao cây lớn nhất khi được nuôi cấy ở  cường độ  ánh sáng  <br /> 160   μmol   m­2  s­1  và   thời   gian   chiếu   sáng   16   giờ/ngày.   Tuy   nhiên,   hàm   lượng   phyllanthin, <br /> hypophyllanthin và niranthin cao nhất khi cây diệp hạ châu đắng được nuôi cấy dưới cường độ <br /> ánh sáng 80 µmol m­2 s­1 và thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày.<br /> Từ khóa: Phyllanthus amarus, cường độ ánh sáng, lignan, quang tự dưỡng, thời gian chiếu sáng.<br /> <br /> MỞ ĐẦU lượng cây thuốc không ổn định và không đảm <br /> Nhu cầu về  các loại thuốc với nguồn gốc   bảo độ sạch.<br /> tự nhiên có khả năng chữa trị những loại bệnh  Để   đảm   bảo   tính   đồng   nhất   về   mặt   di  <br /> nguy hiểm đang ngày càng tăng cao trên thế  truyền, nhân giống vô tính là biện pháp hữu  <br /> giới.   Cây   diệp   hạ   châu   đắng   (Phyllanthus   hiệu nhất, cho phép nhân nhanh các giống cây <br /> amarus (Schum. & Thonn.)) là loài dược thảo  trồng, trong đó có các cây dùng làm dược liệu.  <br /> mọc rất phổ  biến  ở  những vùng nhiệt đới và  Việc sử dụng phương pháp nhân giống vô tính <br /> cận nhiệt đới, trong đó có Việt Nam. Loài cây  in vitro còn đảm bảo độ  tinh sạch và  ổn định <br /> này chứa nhiều hợp chất thứ cấp, trong đó có  của   sản   phẩm,   do   trong   suốt   quá   trình   nuôi <br /> các lignan như  phyllanthin, hypophyllanthin và  cấy, thực vật không bị ảnh hưởng bởi sự thay  <br /> niranthin.   Cây  Phyllanthus  amarus  có   nhiều  đổi của thời tiết cũng như  sâu bệnh. Một số <br /> công dụng trong chữa trị  bệnh như   giảm đau  nghiên cứu về  nuôi cấy mô cây diệp hạ  châu <br /> [6], hạ  huyết áp [20], tăng loại thải axít uric  đắng đã được thực hiện ở trong và ngoài nước  <br /> [14], bảo vệ  tế  bào gan [2, 12] và đặc biệt là  [17, 21]. Tuy nhiên, việc nhân giống vô tính in <br /> khả  năng  ức chế  vi rút HBV [5, 19].  Ở  Việt  vitro  theo   phương   pháp   truyền   thống   (môi <br /> Nam, cây diệp hạ  châu đắng đã được  trồng  trường   có   đường,   vitamin   và   chất   điều   hòa <br /> làm nguyên liệu với diện tích lớn tại một số  sinh trưởng thực vật) còn nhiều hạn chế  đối <br /> vùng ở Phú Yên và Lâm Đồng. Tuy nhiên, việc  với sự  tăng trưởng, thay đổi hình thái và sinh  <br /> trồng cây thuốc trong tự nhiên thường gặp các  lý của thực vật, cũng như  tỷ  lệ  sống của cây <br /> vấn đề về sâu bệnh hay thời tiết dẫn đến chất   in vitro khi đưa ra vườn ươm [9]. Bên cạnh đó, <br /> những yếu tố  vật lý (ánh sáng, nhiệt độ,  ẩm <br /> <br /> <br /> 203<br />  Pham Minh Duy, Nguyen Thi Quynh<br /> <br /> độ, CO2) của môi trường nuôi cấy lại ít được  độ  phòng nuôi cây trung bình 25 ± 2oC và  ẩm <br /> quan   tâm   nghiên   cứu,   mặc   dù   đây   là   những   độ  tương đối trung bình 50 ± 10%. Thời gian  <br /> yếu tố  quan trọng đối với sự  quang hợp của   nuôi cấy 40 ngày.<br /> cây in vitro. Phương pháp vi nhân giống quang  Vào ngày kết thúc thí nghiệm, các chỉ tiêu <br /> tự dưỡng (môi trường nuôi cấy không đường,  tăng trưởng (gia tăng khối lượng tươi và khô, <br /> không   vitamin)   được   tập   trung   nghiên   cứu  chiều cao cây, hàm lượng chlorophyll a + b) và <br /> trong   thời   gian  gần  đây   đã   chứng   minh   ảnh  hàm   lượng   một   số   hợp   chất   lignan  <br /> hưởng của các yếu tố  này đến khả  năng tăng  (phyllanthin,  hypophyllanthin,  niranthin)   được <br /> trưởng và chất lượng của nhiều loài thực vật   xác định. Hiệu suất quang hợp thuần được đo <br /> trong giai đoạn nuôi cấy in vitro [10]. trong thời gian nuôi cấy  ở  các ngày 20, 30, 40 <br /> Trong bài này, sự  tăng trưởng và tích lũy  bằng máy sắc ký khí GC 2010 (Shimadzu Co., <br /> một số hợp chất lignan chính của cây diệp hạ  Nhật Bản) theo phương pháp của Fujiwara et <br /> châu đắng nuôi cấy  in vitro  quang tự  dưỡng  al. (1987) [4].<br /> dưới  ảnh hưởng của cường  độ  ánh sáng và  Hàm lượng các lignan được đo bằng máy <br /> thời   gian   chiếu   sáng   được   trình   bày   nhằm  sắc   ký   lỏng   hiệu   năng   cao   Agilent   1200 <br /> chứng minh vai trò của ánh sáng đối với khả  (Agilent Co., Hoa Kỳ), với cột Zorbax SBC18  <br /> năng tự  dưỡng và tích lũy hợp chất thứ  cấp  (Agilent   Co.,   Hoa   Kỳ),   pha   động   methanol: <br /> của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro. nước theo tỷ lệ 6 : 4, đầu dò DAD, bước sóng <br /> 280   nm.   Các   lignan   chuẩn  chiết   tách  từ   cây <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> diệp hạ  châu đắng trồng ngoài tự  nhiên (độ <br /> Mẫu nuôi cấy là đốt thân cây diệp hạ châu  tinh khiết 98%) được cung cấp bởi phòng Hóa  <br /> đắng in vitro mang một cành lá với khối lượng  hợp chất tự  nhiên, Viện Công nghệ  hóa học, <br /> tươi trung bình là 27 mg/mẫu và khối lượng   Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam.<br /> khô   trung   bình   3,7   mg/mẫu.   Đốt   thân   được  Các số  liệu được xử  lý thống kê ANOVA  <br /> nuôi   cấy  trong  các  hộp   Magenta  GA­7  (V  =  và   phân   hạng   theo   Duncan’s   Multiple   Range <br /> 370 ml, Sigma Co., Hoa Kỳ) trên môi trường  Test   bằng   phần   mềm   MSTATC   phiên   bản <br /> MS [13] với thành phần khoáng đa lượng giảm  2.10   (Trường   đại   học   bang   Michigan,   Hoa  <br /> 1/2, bổ  sung KNO3  200 mg/l và KH2PO4  200  Kỳ).<br /> mg/l. Nắp hộp Magenta có đục hai lỗ  (Φ  = 1  <br /> cm),   được   dán   màng   Millipore   (Nihon  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Millipore Ltd., Nhật Bản) với đường kính lỗ <br /> màng 0,45 µm để giúp trao đổi khí. Số lần trao   Sự tăng trưởng của cây diệp hạ châu đắng <br /> đổi khí của hộp đo được là 3,97 lần/giờ  theo  nuôi cấy quang tự dưỡng dưới  ảnh hưởng <br /> phương pháp của Kozai et al. (1986) [8]. Mỗi   của cường độ  ánh sáng và thời gian chiếu <br /> hộp chứa 55 ml môi trường ở ngày đầu tiên và   sáng<br /> bổ  sung  15  ml  vào  ngày  thứ   27.  Giá  thể   sử  Cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng <br /> dụng là perlite (Công ty CellGreen, Thuận An,   có tác động rõ rệt lên sự  tăng trưởng của cây <br /> Bình  Dương).   pH   của  môi   trường   trước   khi  diệp hạ  châu đắng nuôi cấy in vitro quang tự <br /> khử trùng là 5,8. Môi trường được khử trùng ở  dưỡng. Gia tăng khối lượng tươi và gia tăng <br /> 1 atm, 121oC trong 20 phút. khối  lượng  khô  của  cây  diệp hạ   châu đắng <br /> Thí nghiệm được bố trí theo kiểu 2 yếu tố  đều tăng khi tăng cường độ  ánh sáng và thời <br /> với ba mức cường độ  ánh sáng:  80, 120 hay  gian chiếu sáng (bảng 1, hình 1). Vào ngày thứ <br /> 160   µmol   m­2  s­1  và   ba   mức   thời   gian   chiếu  40, cây diệp hạ  châu đắng nuôi cấy  ở  cường  <br /> sáng: 8, 12 hay 16 giờ/ngày. Thí nghiệm gồm 9  độ ánh sáng 160 μmol m­2 s­1 và thời gian chiếu <br /> công thức, được lặp lại 3 lần. Mỗi công thức  sáng 16 giờ/ngày có gia tăng khối lượng tươi <br /> có 3 hộp, mỗi hộp có 4 mẫu đốt thân. Nhiệt   và gia tăng khối lượng khô lớn nhất (tương  <br /> <br /> <br /> 204<br />  Sự tăng trưởng và tích lũy lignan của cây diệp hạ châu đắng<br /> <br /> ứng là 624 mg/cây và 63,6 mg/cây). Chiều cao  <br /> của  cây  ở   công thức  này  cũng đạt   cao  nhất <br /> trong các công thức (133 mm). Trong khi đó, <br /> cây diệp hạ  châu đắng tăng trưởng kém nhất <br /> dưới điều kiện chiếu sáng 8 giờ/ngày ở cường <br /> độ  ánh sáng 80 μmol m­2 s­1, với gia tăng khối <br /> lượng tươi và gia tăng khối lượng khô thấp <br /> nhất   trong   các   công   thức   (tương   ứng   106 <br /> mg/cây và 9,7 mg/cây). Các kết quả này tương  <br /> tự  kết quả  của Nguyen et al. (1999) [15] khi  <br /> nghiên cứu trên cây cà phê (Coffea arabusta). <br /> Cây có khối lượng khô và diện tích lá lớn hơn  <br /> dưới cường độ ánh sáng cao (350 µmol m ­2 s­1) <br /> so với cường độ ánh sáng thấp (150 µmol m­2 s­<br /> 1<br /> ) khi nuôi cấy ở điều kiện nồng độ CO2 bằng <br /> nồng độ  trong không khí. Kitaya et al. (1998)  <br /> [7] khi trồng cây rau diếp dưới các cường độ <br /> ánh   sáng   và   thời   gian   chiếu   sáng   khác   nhau <br /> cũng ghi nhận cây có khối lượng khô tăng lên <br /> khi tăng cường độ ánh sáng từ 100 µmol m­2 s­1 <br /> lên 300 µmol m­2  s­1 và thời gian chiếu sáng từ <br /> 16 giờ/ngày lên 24 giờ/ngày. Cui et al. (2000)  <br /> [3]   cũng   nhận   thấy   sự   gia   tăng   cả   về   khối <br /> lượng tươi và khối lượng khô của cây Sinh địa  <br /> (Rehmannia   glutinosa)   khi   cây   được   trồng  Hình 1.  Cây diệp hạ  châu đắng nuôi cấy  in <br /> dưới cường độ  ánh sáng tăng dần từ  70 µmol  vitro  quang   tự   dưỡng   dưới   ảnh   hưởng   của <br /> m­2 s­1 lên 140 µmol m­2 s­1. cường   độ   ánh   sáng   và   thời   gian   chiếu   sáng <br /> khác nhau vào ngày thứ 40<br /> Các số   ở  bên trái đại diện cho cường độ  ánh sáng  <br /> 80, 120 hay 160 μmol m­2  s­1. Các số  bên phải đại <br /> diện   cho   thời   gian   chiếu   sáng   8,   12   hay   16 <br /> giờ/ngày.<br /> <br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy <br /> có sự mất cân đối rõ rệt giữa thân lá và bộ rễ <br /> của  cây diệp hạ  châu đắng nuôi cấy  ở  thời <br /> gian chiếu sáng 8 giờ/ngày. Tỷ  lệ  khối lượng <br /> tươi thân lá/rễ ở những công thức có thời gian <br /> chiếu   sáng   8   giờ/ngày   rất   cao   (hình   2),   thể <br /> hiện bộ  rễ  của những cây này rất kém phát <br /> triển. Điều này cho thấy, khi được cung cấp ít <br /> ánh sáng, cây diệp hạ  châu đắng không tổng <br /> hợp đủ  chất dinh dưỡng để  phát triển bộ  rễ.  <br /> Ngược lại, bộ rễ phát triển kém lại không thể <br /> hấp thu đủ  nước và chất khoáng để  cung cấp <br /> cho   cây,   khiến   cho   sự   tăng   trưởng   của   cây <br /> chậm hơn so với các công thức khác.<br /> <br /> <br /> 205<br />  Pham Minh Duy, Nguyen Thi Quynh<br /> <br /> Khi so sánh sự tăng trưởng của những cây  độ  thoáng khí của bình hay tăng nồng độ  CO2 <br /> diệp hạ  châu đắng nuôi cấy quang tự  dưỡng  của phòng nuôi, việc kéo dài thời gian chiếu  <br /> với cùng mức năng lượng ánh sáng được cung  sáng và áp dụng cường độ  ánh sáng phù hợp <br /> cấp trong một ngày, chúng tôi ghi nhận  thấy,  sẽ  giúp cây nuôi cấy  in vitro  tận dụng năng <br /> cây được nuôi cấy  ở  thời gian chiếu sáng dài  lượng do ánh sáng mang lại tốt hơn cho hoạt  <br /> hơn và cường độ  ánh sáng thấp hơn có hiệu  động quang hợp.<br /> quả  thu nhận ánh sáng và tăng trưởng tốt hơn   Cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng <br /> so với cây nuôi cấy  ở  cường độ  ánh sáng cao   cũng có tác động lên hàm lượng chlorophyll a <br /> và thời gian chiếu sáng ngắn. Các công thức có  + b của lá cây diệp hạ châu đắng. Ở cùng mức <br /> thời gian chiếu sáng dài như  80­12, 80­16 và  thời gian chiếu sáng, hàm lượng chlorophyll a  <br /> 120­16 (mức năng lượng ánh sáng trong ngày  + b giảm có ý nghĩa về mặt thống kê khi tăng <br /> tương  ứng 3,46, 4,61 và 6,91 mol m­2  ngày­1)  cường độ  ánh sáng (bảng 1). Điều này có thể <br /> đều có gia tăng khối lượng khô/cây cao hơn so  là do khi nuôi cấy cây trong điều kiện quang <br /> với các công thức, bao gồm 120­8, 160­8 và  tự dưỡng dưới cường độ  ánh sáng cao, cây bị <br /> 160­12,   có   cùng   mức   năng   lượng   cung   cấp  thiếu hụt CO2, dẫn đến hiện tượng quang  ức  <br /> trong   ngày   tương   ứng   nhưng   với   thời   gian   chế làm phá hủy một phần chlorophyll trong lá <br /> chiếu sáng ngắn hơn (bảng 1).   Kết quả  này  [1]. Hiện tượng này có thể  được khắc phục  <br /> tương tự  như  kết quả  mà  Kozai et al. (1995)  bằng cách  tăng nồng độ  CO2 trong bình nuôi <br /> [11] và  Niu et al. (1996) [16]  đã chứng minh  cây thông qua việc gia tăng nồng độ CO2 trong <br /> trên cây khoai tây. Các tác giả  đều ghi nhận  phòng nuôi  cấy hoặc  sử  dụng  các  hệ  thống <br /> khi nuôi cấy  ở  cùng một mức năng lượng ánh  nuôi cấy bơm khí trực tiếp với số lần trao đổi <br /> sáng trong một ngày, cây khoai tây nuôi cấy in  khí lớn hơn.<br /> vitro  quang tự  dưỡng  ở  thời gian chiếu sáng <br /> dài hơn và cường độ  ánh sáng thấp hơn cho   18<br /> Tỷ lệ KLT thân lá/rễ<br /> 12%<br /> % chất khô<br /> khối   lượng   khô   lớn   hơn.   Điều   này   có   thể  15 10%<br /> được lý giải là do trong điều kiện nuôi cấy in <br /> Tỷ lệ KLT thân lá/rễ<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 12 8%<br /> vitro,   khi   cây   được   cung   cấp   ánh   sáng   có <br /> <br /> <br /> <br /> % chất khô<br /> cường   độ   cao,   quang   hợp   của   cây   diễn   ra   9 6%<br /> <br /> <br /> mạnh, cây nhanh chóng sử dụng hết CO 2 trong  6 4%<br /> <br /> bình nuôi cây. Khi đó, sự  khuếch tán CO 2 qua  3 2%<br /> <br /> lỗ   trao   đổi   khí   của   bình   không   kịp   bù   đắp  0 0%<br /> <br /> lượng CO2  trong  bình mất  đi  do quang hợp,   80-8 120-8 160-8 80-12 120-12 160-12<br /> <br /> Nghiệm thức<br /> 80-16 120-16 160-16 Công thức<br /> <br /> gây nên tình trạng thiếu hụt CO2, hoạt động  Hình 2. Tỷ lệ khối lượng tươi thân lá/rễ và % <br /> quang hợp bị  giới hạn và cây  in vitro  không  chất khô của cây diệp hạ  châu đắng nuôi cấy <br /> thể tận dụng tối đa lượng ánh sáng được cung  in vitro  dưới   ảnh  hưởng  của  cường  độ  ánh <br /> cấp.   Để   giảm   sự   thiếu   hụt   CO 2,   việc   tăng  sáng và thời gian chiếu sáng vào ngày thứ 40.<br /> thêm   độ   thoáng   khí   của   bình   nuôi   cây   hoặc <br /> Các số   ở  bên trái đại diện cho cường độ  ánh sáng  <br /> tăng thêm nồng độ CO2 của phòng nuôi cây sẽ <br /> 80, 120 hay 160 μmol m­2  s­1. Các số  bên phải đại <br /> cho phép cây tận dụng hiệu quả  hơn lượng  diện   cho   thời   gian   chiếu   sáng   8,   12   hay   16 <br /> ánh sáng được cung cấp. Khi áp dụng vào thực  giờ/ngày.<br /> tế  sản xuất, nếu không có điều kiện gia tăng <br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng lên gia tăng khối lượng tươi  <br /> (GTKLT), gia tăng khối lượng khô (GTKLK), chiều cao cây, hàm lượng chlorophyll a + b ở ngày <br /> thứ 40 và hiệu suất quang hợp thuần các ngày 20, 30, 40 của cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy  in <br /> vitro quang tự dưỡng <br /> <br /> <br /> 206<br />  Sự tăng trưởng và tích lũy lignan của cây diệp hạ châu đắng<br /> <br /> <br /> Hàm  Hiệu suất quang hợp thuần <br /> GTKLT  GTKLK  l ượng chl  (µmol h­1/cây)<br /> Tên công  Chiều cao <br /> cả cây  cả cây  a + b <br /> thứcx cây (mm)<br /> (mg/cây) (mg/cây) (mg/g lá  Ngày  20 Ngày 30 Ngày 40<br /> khô)<br />      80­8     106 ey     9,7 f     36 e 25,7 b   2,33 cd   3,08 c   3,31 e<br />    120­8     119 e     9,9 f     36 e 24,6 c   3,04 abc   2,97 c   3,82 d<br />    160­8     136 e   11,1 f     50 d 23,6 d   3,07 abc   2,92 c   4,34 bc<br />      80­12     365 d   30,4 e   118 bc 28,6 a   1,70 d   3,03 c   4,90 a<br />    120­12     443 c   40,7 d   127 ab 28,8 a   2,65 bc   4,56 a   5,17 a<br />    160­12     506 b   40,9 d   115 bc 24,6 c   3,80 a   4,44 a   5,17 a<br />      80­16     456 c   46,4 c   113 c 23,7 d   3,39 ab   3,83 b   4,02 cd<br />    120­16     506 b   53,8 b   114 bc 22,5 e   3,13 abc   4,26 ab   4,30 bc<br />    160­16     624 a   63,6 a   133 a 20,6 f   3,06 abc   4,39 a   4,46 b<br /> ANOVAz<br /> CĐAS (A) ** ** ** ** ** ** **<br /> TGCS (B) ** ** ** ** * ** **<br /> A x B ** ** ** NS ** ** **<br /> NS, *, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa  ở  mức p ≤ 0,05 hoặc 0,01;   y  Các trị số  có chữ  cái <br /> z <br /> <br /> giống nhau trên cùng một cột thì không có sự  khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple  <br /> Range Test; x  Các số   ở  bên trái đại diện cho cường độ  ánh sáng 80, 120 và 160 μmol m ­2 s­1. Các số  bên <br /> phải đại diện cho thời gian chiếu sáng 8, 12 và 16 giờ/ngày.<br /> Hiệu   suất   quang   hợp   thuần,   P n,   của   cây  Theo   Sambogin   et   al.   (1986)   [18],   cường   độ <br /> diệp hạ châu đắng ở tất cả các công thức vào  ánh sáng cao có thể làm gia tăng nhiệt độ ở lá <br /> ngày thứ  40 đều cao hơn so với cây  ở  cùng  và dẫn đến sự gia tăng cường độ hô hấp trong  <br /> công thức vào ngày thứ 20 (bảng 1). Điều này  giai đoạn tối, làm giảm độ dẫn của tế bào nhu <br /> chứng tỏ  cây diệp hạ  châu đắng có sự  tăng  mô diệp lục (mesophyll conductance) và giảm <br /> trưởng theo thời gian. Vào ngày thứ  40, hiệu  Pn  của   cây   cà   phê   chè  Coffea   arabica.   Hiệu <br /> suất quang hợp thuần của cây diệp hạ  châu  suất quang hợp thuần của cây diệp hạ  châu <br /> đắng tăng khi tăng cường độ  ánh sáng  ở  cùng  đắng  ở  các công thức có thời gian chiếu sáng <br /> điều   kiện   thời   gian   chiếu   sáng.   Đồng   thời,  16 giờ/ngày tuy thấp hơn, nhưng gia tăng khối  <br /> hiệu suất quang hợp thuần của cây nuôi cấy ở  lượng tươi và khô của cây ở các công thức này <br /> các   công   thức   có   thời   gian   chiếu   sáng   12  vẫn   cao   hơn   (bảng   1),   điều   này   được   giải <br /> giờ/ngày cao hơn một cách rõ rệt so với các  thích do thời gian xảy ra quang hợp kéo dài, vì  <br /> công thức có thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày.  vậy,   lượng   vật   chất   cây   tổng   hợp   được   từ <br /> Tuy   nhiên,   ở   cùng   điều   kiện   cường   độ   ánh  quang   hợp  vẫn  nhiều  hơn   so  với   cây   ở   các <br /> sáng, hiệu suất quang hợp thuần của cây diệp   công thức với cùng cường độ  ánh sáng nhưng <br /> hạ   châu   đắng   ở   các   công   thức   có   thời   gian   có thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày.<br /> chiếu sáng 16 giờ/ngày lại thấp hơn so với cây  Sự thay đổi hàm lượng các hợp chất lignan <br /> ở  thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày (bảng 1).   chính   (phyllanthin,   hypophyllanthin   và <br /> Kết   quả   này   tương   ứng   với   sự   giảm   hàm <br /> niranthin) của cây diệp hạ  châu đắng khi <br /> lượng chlorophyll tổng số  a + b vào ngày thứ <br /> thay  đổi  cường  độ  ánh  sáng và  thời  gian  <br /> 40 của các công thức có thời gian chiếu sáng <br /> 16 giờ/ngày (bảng 1). Nguyen et al. (1999) [15]   chiếu sáng<br /> đã chứng minh Pn trên cây cà phê arabusta nuôi  Khi khảo sát hàm lượng một số  hợp chất  <br /> cấy quang tự  dưỡng giảm khi tăng cường độ  lignan   chính   (bao   gồm   phyllanthin, <br /> ánh sáng trong điều kiện nồng độ  CO2  thấp.  hypophyllanthin   và   niranthin)   trong   cây   diệp <br /> <br /> <br /> 207<br />  Pham Minh Duy, Nguyen Thi Quynh<br /> <br /> hạ  châu đắng vào ngày thứ 40, chúng tôi nhận  nhất, nhưng nếu tính sản lượng phyllanthin, <br /> thấy, hàm lượng các hợp chất này cũng thay   hypophyllanthin và niranthin tạo ra trong một  <br /> đổi dưới tác động của cường độ  ánh sáng và  bình   nuôi   cây   (mỗi   bình   4   mẫu),   điều   kiện <br /> thời gian chiếu sáng, tuy nhiên, sự thay đổi này  cường   độ   ánh   sáng   160  μmol   m­2  s­1  và   thời <br /> không theo khuynh hướng tăng dần theo mức  gian   chiếu   sáng   16   giờ/ngày   vẫn   cho   sản <br /> năng lượng ánh sáng cung cấp. Hàm lượng các  lượng   hypophyllanthin   và   niranthin   cao   nhất <br /> hợp   chất   phyllanthin,   hypophyllanthin   và  (tương ứng 0,91 và 1,59 mg/bình). <br /> niranthin tính trên gram thân lá khô đều đạt cao  KẾT LUẬN<br /> nhất   ở   công  thức  có   cường   độ   ánh  sáng  80 <br /> μmol  m­2  s­1  với   thời   gian   chiếu   sáng   12  Cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng<br /> giờ/ngày (tương  ứng 5,56; 7,07 và 10,97 mg/g <br /> thân   lá   khô)   và   thấp   nhất   ở   công   thức   có <br /> cường độ  ánh sáng 160 μmol m­2  s­1  với thời <br /> gian chiếu sáng 8 giờ/ngày (tương  ứng 1,78; <br /> 2,34 và 2,42 mg/g thân lá khô) (hình 3).  Điều <br /> này cho thấy, ánh sáng không chỉ  tác động lên <br /> sự   tích  lũy  lignan  ở   cây  diệp  hạ   châu  đắng <br /> một   cách   gián   tiếp   thông   qua   quang   hợp   và <br /> tổng hợp vật chất, mà còn tác động một cách <br /> trực tiếp thông qua các cơ chế khác trên cây và  <br /> cần có những nghiên cứu sâu hơn để tìm ra cơ <br /> chế   tác   động   của   ánh   sáng   lên   sự   tích   lũy <br /> lignan  ở  cây diệp hạ  châu đắng nuôi cấy  in <br /> vitro.<br /> 14<br /> Phyllanthin<br /> 12 Hypophyllanthin<br /> Hàm lượng lignan (mg/g khô)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 10 Niranthin<br /> <br /> <br /> 8<br /> <br /> 6<br /> <br /> 4<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0<br /> 80-8 120-8 160-8 80-12 120-12 160-12 80-16 120-16 160-16<br /> <br /> Nghiệm thức<br /> Công thức<br /> <br /> Hình 3. Hàm lượng các hợp chất lignan (mg/g <br /> thân lá khô) của cây diệp hạ  châu đắng nuôi <br /> cấy  in vitro  dưới  ảnh hưởng của cường  độ <br /> ánh sáng và thời gian chiếu sáng vào ngày thứ <br /> 40.<br /> Các số  ở  bên trái đại diện cho cường độ  ánh sáng  <br /> 80, 120 hay 160 μmol m­2  s­1. Các số  bên phải đại <br /> diện   cho   thời   gian   chiếu   sáng   8,   12   hay   16 <br /> giờ/ngày.<br /> <br /> Hàm lượng phyllanthin, hypophyllanthin và <br /> niranthin   tính   trên   gram   thân   lá   khô   của   cây <br /> diệp hạ  châu đắng  ở  công thức 80­12 đạt cao <br /> <br /> <br /> 208<br />  Sự tăng trưởng và tích lũy lignan của cây diệp hạ châu đắng<br /> <br /> có tác động rõ rệt lên sự  tăng trưởng của   5. Huang R. L., Huang Y. L., Ou J. C., Chen C. <br /> cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy in vitro quang  C., Hsu  F. L., Chang C., 2003. Screening of <br /> tự  dưỡng. Điều kiện cường độ  ánh sáng 160  25   compounds   isolated   from  Phyllanthus <br /> μmol   m­2  s­1  và   thời   gian   chiếu   sáng   16  species for anti­human hepatitis B virus  in <br /> giờ/ngày   giúp   cây   diệp   hạ   châu   đắng   tăng  vitro. Phytother. Res., 17(5): 449­453.<br /> trưởng tốt nhất. Ánh sáng cũng làm thay đổi   6. Kassuya C. A., Silvestre A., Menezes­de­Lima <br /> sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong cây diệp hạ  O. Jr., Marotta D. M., Rehder V. L., Calixto J. <br /> châu   đắng   nuôi   cấy  in   vitro.   Hàm   lượng  B., 2006. Antiinflammatory and antiallodynic <br /> phyllanthin,   hypophyllanthin   và   niranthin   cao  actions  of  the  lignan  niranthin isolated from <br /> nhất khi cây nuôi cấy dưới cường độ ánh sáng  Phyllanthus amarus. Evidence for interaction <br /> 80   µmol   m­2  s­1  và   thời   gian   chiếu   sáng   12  with platelet activating factor receptor. Eur. J. <br /> giờ/ngày. Pharmacol., 546(1­3): 182­188.<br /> Lời cảm  ơn: Đề  tài được hỗ  trợ  kinh phí từ  7. Kitaya Y., Shibuya T., Kozai T., Kubota C., <br /> Sở  Khoa học và Công nghệ  tp. Hồ  Chí Minh  1998.   Effects   of   light   intensity   and   air <br /> (2010­2012), cùng với sự hỗ trợ về trang thiết   velocity   on   air   temperature,   water   vapor <br /> bị từ phòng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam  pressure,   and   CO2  concentration   inside   a <br /> về Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học  plant   canopy   under   an   artificial   lighting <br /> nhiệt đới, Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam   condition.   Life   Supp.   &   Biosph.   Sci.,   5: <br /> và sự  hỗ  trợ  về  hạt giống diệp hạ  châu đắng  199­203.<br /> từ   Trung   tâm   Nghiên   cứu   Dược   liệu   Miền <br /> Trung. 8. Kozai T., Fujiwara K., Watanabe I., 1986. <br /> Effects   of   stoppers   and   vessels   on   gas <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO exchange   rates   between­inside   and  outside <br /> 1. Alves   P.   L.   C.   A.,   Magalhaes   A.   C.   N.,  of   vessels   closed   with   stoppers.   J.   Agr. <br /> Barja   P.   R.,   2002.  The   phenomenon   of  Meteorol., 42: 119­127.<br /> photoinhibition   of   photosynthesis   and   its  9. Kozai   T.,   Kubota   C.,   2005a.  Concept, <br /> importance in reforestation.  The Bot. Rev.,  definition,   ventilation  methods,   advantages <br /> 68(2): 193­208.  and disadvantages.  In: Kozai T., Afreen F., <br /> 2. Chirdchupunseree H., Pramyothin P.,  2010.  Zobayed   S.   M.   A.   (eds.)   Photoautotrophic <br /> Protective activity of phyllanthin in ethanol­ (sugar­free medium) micropropagation as a <br /> treated primary culture of rat hepatocytes. J.  new   micropropagation   and   transplant <br /> Ethnopharmacol., 218(1): 172­176. production   system.   Springer,   The <br /> Netherlands, 19­30.<br /> 3. Cui Y. Y., Hahn E. J., Kozai T., Paek K. Y., <br /> 2000.   Number   of   air   exchanges,   sucrose  10. Kozai T., Kubota C., 2005b.  In vitro  aerial <br /> concentration,   photosynthetic   photon   flux,  environments   and   their   effects   on   growth <br /> and   differences   in   photoperiod   and   dark  and   development   of   plants.   In:   Kozai   T., <br /> period   temperatures   affect   growth   of  Afreen   F.,   Zobayed   S.   M.   A.   (eds.) <br /> Rehmannia   glutinosa  plantlets  in   vitro.  Photoautotrophic   (sugar­free   medium) <br /> Plant Cell Tiss. Org. Cult., 62: 219­226. micropropagation   as   a   new <br /> micropropagation and transplant production <br /> 4. Fujiwara K., Kozai T., Watanabe I., 1987. <br /> system. Springer, The Netherlands, 31­51.<br /> Measurements   of   carbon   dioxide   gas <br /> concentration   in   closed   vessels   containing  11. Kozai T., Watanabe K., Jeong B.R., 1995. <br /> tissue culture plantlets and estimates of net  Stem   elongation   and   growth   of  Solanum <br /> photosynthesis rates of the plantlets. J. Agri.  tuberosum  L.  in   vitro  in   response   to <br /> Meteorol., 43(1): 21­30. photosynthetic photon flux, photoperiod and <br /> <br /> <br /> <br /> 209<br />  Pham Minh Duy, Nguyen Thi Quynh<br /> <br /> difference   in   photoperiod  and   dark   period  17. Ravindhran   R.,   Antoine   Lebel   L., <br /> temperatures. Sci. Hort., 64(1­2): 1­9. Ignacimuthu S., 2006. Micropropagation of <br /> 12. Krithika   R.,   Mohankumar   R.,   Verma   R.J.,  Phyllanthus   amarus  Schum   and   Thom   by <br /> Shrivastav   P.S.,   Mohamad   I.L.,  meristem   culture.   In:   S.   J   William   (ed.) <br /> Gunasekaran   P.,   Narasimhan   S.,   2009.  Biodiversity:   Life   to   our   mother   earth, <br /> Isolation, characterization and antioxidative  Loyola   College,   Chennai,   Tamil   Nadu, <br /> effect   of   phyllanthin   against   CCl 4­induced  India, 295­300.<br /> toxicity   in   HepG2   cell   line.  Chem.   Biol.  18. Sambogin   K.,   Yasuda   T.,   Yaniaguchi   T., <br /> Interact., 181(3): 351­358. 1986.   Effect   of   shading  on   photosynthesis <br /> 13. Murashige   T.,   Skoog   F.,   1962.   A   revised  of coffea arabica. Jpn. J. Trop. Agr., 30(3): <br /> medium   for   rapid   growth   and   bio­assays  149­152.<br /> with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant,  19. Thyagarajan   S.   P.,   Thiruneelakantan   K., <br /> 15(3): 473­497. Subramanian S.,   Sundaravelu T.,  1982.  In <br /> 14. Murugaiyaha  V.,   Chan   K.   L.,   2009.  vitro inactivation of HBsAg by Eclipta alba <br /> Mechanisms   of   antihyperuricemic   effect   of  (Hassk.) and Phyllanthus niruri (Linn.). Ind. <br /> Phyllanthus niruri and its lignan constituents.  J. Med. Res., 76: 124­130.<br /> J. Ethnopharmacol., 124(2): 233­239. 20. Ueno H., Horie S., Nishi Y., Shogawa H., <br /> 15. Nguyen T. Q., Kozai T., Niu G., Nguyen V.  Kawasaki   M.,   Suzuki   S.,   Hayashi   T., <br /> U.,   1999.   Photosynthetic   characteristics   of  Arisawa   M.,   Shimizu   M.,   Yoshizaki   M., <br /> coffee (Coffea arabusta) plantlets in vitro in  1988. Chemical and pharmaceutical studies <br /> response   to   different   CO2  concentrations  on medicinal plants in Paraguay. Geraniin, <br /> and   light   intensities.   Plant   Cell   Tiss.   Org.  an angiotensin­converting enzyme inhibitor <br /> Cult., 55: 133­139. from  ‘paraparai  mi,’  Phyllanthus  niruri.  J. <br /> 16. Niu   G.,   Kozai   T.,   Mikami   H.,   1996.  Nat. Prod., 51(2): 357­359.<br /> Simulation of the effects of photoperiod and  21. Vũ Văn Vụ, Lê Xuân Thám, Nguyễn Thị <br /> light   intensity   on   the   growth   of   potato  Nụ, 1999. Nghiên cứu nhân giống  in vitro <br /> plantlets   cultured   photoautotrophically  in  và   thành   phần   khoáng   cây   diệp   hạ   châu <br /> vitro. Acta Hort., 440: 622­627. Phyllathus   amarus  bằng   phân   tích   kích <br /> hoạt Neutron kết hợp. Tạp chí Dược học, <br /> 6: 6­9.<br /> <br /> GROWTH AND LIGNAN ACCUMULATION OF Phyllanthus amarus (Schum. & Thonn.) <br /> CULTURED IN VITRO PHOTOAUTOTROPHICALLY AS AFFECTED BY LIGHT <br /> INTENSITY AND PHOTOPERIOD<br /> <br /> Pham Minh Duy, Nguyen Thi Quynh<br /> Institute of Tropical Biology, VAST<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Light   intensity   and   photoperiod   are   two   important   factors   to   the   growth   and   secondary   metabolite <br /> accumulation of  in vitro  plants, especially under photoautotrophic micropropagation. Internodal  segments <br /> carrying 1 leaf of in vitro Phyllanthus amarus plants were used as explants. Four explants were put on MS <br /> medium with half strength macro elements and without sugar and vitamins, in a Magenta box­type vessel (V  <br /> = 370 ml). There were two holes (Ф = 1 cm) covered by Millipore membranes (Ф = 0.45 µm) on the vessel <br /> <br /> <br /> 210<br />  Sự tăng trưởng và tích lũy lignan của cây diệp hạ châu đắng<br /> <br /> lid. Perlite was used as supporting material. The experiment was carried out with 3 different light intensities  <br /> (80, 120 or 160 µmol m­2 s­1) in combination with 3 levels of photoperiod (8, 12 or 16 hours per day), under <br /> room temperature of 25 ± 2oC and relative humidity of 50%. On day 40,  Phyllanthus amarus  plants grew <br /> better under higher PPF and longer photoperiod. Increased fresh weight and dry weight, stem diameter and  <br /> shoot lenght of in vitro plants were the highest under the PPF of 160 μmol m­2  s­1 and the photoperiod of 16 <br /> hours per day. Phyllanthin, hypophyllanthin and niranthin contents were the largest when plants were cultured <br /> under the PPF of 80 µmol m­2 s­1 and the photoperiod of 12 hours per day.<br /> Keywords: Phyllanthus amarus, light intensity, lignan, photoautotrophic, photoperiod.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 5­6­2013<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 211<br />