Tách chiết flavonoid từ nấm hoàng chi Ganoderma colossum và nghiên cứu tác động của nó lên hàm lượng acid nucleic của gan chuột nhắt trắng (Swiss)

TÁCH CHIẾT FLAVONOID TỪ NẤM HOÀNG CHI GANODERMA<br /> COLOSSUM VÀ NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA NÓ LÊN HÀM LƯỢNG<br /> ACID NUCLEIC CỦA GAN CHUỘT NHẮT TRẮNG (SWISS)<br /> ĐOÀN SUY NGHĨ<br /> Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế<br /> Tóm tắt: Nấm Hoàng chi Ganoderma colossum đã được nuôi trồng thành<br /> công tại Khoa Sinh-Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, là một trong 6<br /> loài Linh chi quí. Đã có nhiều tài liệu công bố về các hoạt chất có trong họ<br /> nấm Linh chi Ganodermataceae cùng những tác dụng sinh học của chúng.<br /> Riêng nấm Hoàng chi, hiểu biết về thành phần hóa dược và công dụng của<br /> nó mới chỉ có ít bài báo đã công bố. Đó là lí do để chúng tôi tiến hành tách<br /> chiết, tinh sạch flavonoid có trong nấm Hoàng chi và nghiên cứu tác động<br /> của nó lên hàm lượng acid nucleic, ADN và ARN của mô gan chuột nhắt<br /> trắng (Swiss). Kết quả nghiên cứu thể hiện: Hàm lượng flavonoid tinh sạch<br /> có trong nấm Hoàng chi đạt 3,09 ± 0,11% tính theo trọng lượng khô. Khi<br /> tiêm dịch flavonoid 10% hoặc 20% liều 1ml/con(20g)/ngày, tiêm 3 lần, đã<br /> không làm thay đổi hàm lượng acid nucleic, ADN và ARN của mô gan<br /> chuột nhắt trắng (Swiss). Điều đó chứng tỏ flavonoid là một hoạt chất quí<br /> khi sử dụng không gây ra sự đột biến.<br /> Từ khóa: flavonoid, acid nucleic, ADN, ARN<br /> <br /> 1. MỞ ĐẦU<br /> Nấm Hoàng chi có tên khoa học là Ganoderma colossum đã được nuôi trồng thành công<br /> tại Khoa Sinh-Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế [4]. Nấm Hoàng chi thuộc diện<br /> quí hiếm không chỉ ở Việt Nam mà cả ở Trung Quốc. Nghiên cứu về nấm Hoàng chi<br /> mới chỉ được biết đến qua các tài liệu về thành phần colossolactones [6]; hoạt chất<br /> flavonoid và tác dụng chống oxy hóa [4]; khả năng kháng khuẩn [9]. Ngoài ra có tài liệu<br /> công bố về tác dụng phụ của chế phẩm từ một số loài thuộc họ nấm Linh chi: G.<br /> applanatum, G. lucidum, G. meredithiae [1], còn tác dụng của flavonoid nấm Hoàng chi<br /> lên hàm lượng acid nucleic thì chưa có tài liệu nào đề cập tới. Đó là lí do để chúng tôi<br /> tiến hành: Tách chiết flavonoid từ nấm Hoàng chi Ganoderma colossum và nghiên cứu<br /> tác động của nó lên hàm lượng acid nucleic của mô gan chuột nhắt trắng (Swiss).<br /> 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 2.1. Đối tượng nghiên cứu<br /> - Flavonoid tách từ nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum).<br /> - Mô gan chuột nhắt trắng.<br /> <br /> Tạp chí Khoa học và Giáo dục, Trường Đại học Sư phạm Huế<br /> ISSN 1859-1612, Số 03(39)/2016: tr. 101-107<br /> <br /> 102<br /> <br /> ĐOÀN SUY NGHĨ<br /> <br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> - Phương pháp tách chiết flavonoid toàn phần và flavonoid tinh khiết theo tài liệu [2].<br /> - Phương pháp xác định hàm lượng acid nucleic, ADN, ARN theo theo tài liệu [8].<br /> - Phân lô thí nghiệm: Chuột nhắt trắng (Swiss) 3 tuần tuổi khỏe mạnh, nặng trung bình<br /> 18,5±0,5g cùng thức ăn tổng hợp mua ở Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Chuột được<br /> phân thành các lô:<br /> - Lô đối chứng trước tiêm (ĐCTT): Trước khi tiêm chọn ngẫu nhiên 3 con từ số chuột<br /> chuẩn bị phân lô, thu mẫu gan để xác định hàm lượng acid nucleic, ADN, ARN.<br /> - Lô đối chứng không tiêm 1 (ĐCKT): Nuôi bình thường, không tiêm gì cả, cùng thời<br /> gian với lô tiêm nước cất hay tiêm dịch flavonoid.<br /> - Lô đối chứng 1 (ĐC1) và lô đối chứng 2 (ĐC2): Tiêm nước cất<br /> - Lô thí nghiệm 1 (TN1): Tiêm dịch flavonoid 10%<br /> - Lô thí nghiệm 2 (TN2): Tiêm dịch flavonoid 20%<br /> Chuột mua về nuôi tiếp cho đủ 4 tuần tuổi nặng trung bình 19,5±0,5g trước khi tiêm<br /> nước cất hay dịch flavonoid. Mỗi lô có 10 con. Chế độ nuôi dưỡng chuột ở các lô là như<br /> nhau.<br /> - Cách tiêm: Thời gian tiêm, liều tiêm và số lần tiêm ở các lô ĐC hay TN là giống nhau.<br /> - Thời gian tiêm: Chuột ở các lô ĐC hay TN được tiêm mỗi ngày 1 lần vào 8 giờ sáng.<br /> - Liều tiêm; Chuột ở lô đối chứng 1 (ĐC1), lô đối chứng 2 (ĐC2), tiêm 1ml nước<br /> cất/con (20g)/ngày. Chuột ở lô thí nghiệm 1 (TN1) tiêm 1ml dịch flavonoid 10%/con<br /> (20g)/ngày còn ở lô thí nghiệm 2 (TN2) tiêm 1ml dịch flavonoid 20%/con (20g)/ngày.<br /> - Số lần tiêm: Chuột 5 tuần tuổi sẽ tiêm 3 lần trong 3 ngày liền nhau (thứ 2, thứ 3, thứ 4).<br /> - Thu mẫu gan: Nhóm chuột sau 3 ngày tiêm nước cất (lô ĐC1) hay dịch Flavonoid<br /> (lôTN1) và lô đối chứng không tiêm (ĐCKT)(kể từ sau lần tiêm thứ 3), giải phẫu thu<br /> mẫu gan vào 8 giờ sáng chủ nhật. Nhóm chuột sau 5 ngày tiêm (kể từ sau lần tiêm thứ<br /> 3), ở các lô nói trên, giải phẫu thu mẫu gan vào 8 giờ sáng thứ 3 tuần kế tiếp. Nhóm<br /> chuột sau 7 ngày tiêm (kể từ sau lần tiêm thứ 3), ở các lô nói trên, giải phẫu thu mẫu<br /> gan vào 8 giờ sáng thứ 5 tuần kế tiếp. Mẫu gan có thể tiến hành ngay để xác định hàm<br /> lượng acid nucleic, ADN, ARN. Mẫu gan chưa tiến hành được bảo quản ở 40C của tủ<br /> lạnh. Mẫu gan lấy phân tích là 1g, sau pha loãng bằng acid perchloric HClO4 0,4N. Tiến<br /> hành thứ tự qua các bước: Đồng thể mẫu, li tâm thu dịch nổi (kiểm tra độ tinh sạch) thu<br /> được dịch acid nucleic. Tách riêng ADN, ARN (kiểm tra độ tinh sạch bằng thuốc thử<br /> diphenilamin) để đo hàm lượng ADN, ARN. Dung dịch ADN, ARN tinh sạch đều được<br /> đưa vào máy quang phổ kế tử ngoại, chọn bước sóng thích hợp để đo mật độ quang học.<br /> Áp dụng công thức theo [6] sẽ xác định được hàm lượng ADN, ARN, từ đó tính được<br /> hàm lượng acid nucleic trong mẫu gan chuột nhắt trắng.<br /> <br /> TÁCH CHIẾT FLAVONOID TỪ NẤM HOÀNG CHI GANODERMA COLOSSUM...<br /> <br /> 103<br /> <br /> 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br /> 3.1. Kết quả thu flavonoid toàn phần và flavonoid tinh sạch<br /> - Thu flavonoid toàn phần: Cân chính xác 50g quả thể khô nấm Hoàng chi đem tách<br /> chiết thu flavonoid toàn phần. Đoàn Suy Nghĩ và cộng sự [9] đã áp dụng tách chiết với<br /> các dung môi khác nhau. Cuối cùng, chúng tôi đã xác định được qui trình tách chiết cho<br /> hàm lượng flavonoid cao nhất theo hình 1.<br /> Bột nấm Hoàng chi khô (50g)<br /> 1. Chiết nóng hồi lưu 4h bằng methanol 80%<br /> <br /> Chiết bằng methanol<br /> <br /> 2. Chưng cất thu hồi methanol<br /> <br /> Thu dịch3.chiết<br /> đặc thủy<br /> Cô cách<br /> <br /> Thu được flavonoid thô 1<br /> 4. Thêm nước, chưng cách thủy, lọc<br /> <br /> Thu được flavonoid thô 2 5. Chiết 3 lần bằng ethylacetate,<br /> chưng cất thu hồi dung môi<br /> <br /> Thu flavonoid toàn phần<br /> Hình 1. Sơ đồ tách chiết flavonoid toàn phần từ nấm Hoàng chi<br /> <br /> Kết quả tách chiết flavonoid toàn phần từ nấm Hoàng chi đã thu được hàm lượng đạt<br /> trung bình 7,38 ± 0,20%, tính theo trọng lượng khô [9]. Giá trị flavonoid toàn phần từ<br /> nấm Hoàng chi là cao khi so sánh với lá cây Diếp cá (2,73%) [3], vỏ Bưởi (2,7%) [7],<br /> cây Tiếp cốt thảo (0,95%) [5].<br /> - Thu flavonoid tinh sạch: Flavonoid toàn phần được hòa tan vào dung dịch ethanol<br /> 60% rồi cho tiếp acetate chì 5% theo thể tích 1:1 để kết tủa flavonoid. Lọc lấy tủa, cho<br /> tủa vào dung dịch ethanol 60% theo khối lượng 1:5, khuấy thành dung treo đồng nhất và<br /> thêm vào Na2SO4 5% theo thể tích 1:1 để kết tủa chì. Thu lấy phần dịch ở trên đem<br /> chưng cách thủy đuổi dung môi, thu lấy bột flavonoid tinh sạch có màu trắng ngà, vị rất<br /> đắng. Kết quả xác định hàm lượng flavonoid tinh sạch đạt 3,09 ± 0,11%.<br /> <br /> ĐOÀN SUY NGHĨ<br /> <br /> 104<br /> <br /> 3.2. Kết quả xác định hàm lượng acid nucleic, ADN, ARN mô gan chuột nhắt trắng<br /> Kết quả thu được trình bày ở bảng 1 và bảng 2.<br /> Bảng 1. Hàm lượng acid nucleic, ADN, ARN mô gan chuột nhắt trắng ở các lô tính theo µg/g<br /> Thời gian<br /> trước tiêm<br /> Mẫu<br /> gan<br /> <br /> Thời gian<br /> sau tiêm<br /> <br /> 1<br /> S3NT<br /> 2<br /> Trung bình<br /> S3NT<br /> 3<br /> S5NT<br /> 4<br /> Trung bình<br /> S5NT<br /> 5<br /> S7NT<br /> 6<br /> Trung bình<br /> S7NT<br /> Trung bình cộng<br /> S(3,5,7)NT<br /> Thời gian sau 3,5,7<br /> ngày không tiêm<br /> (S 3,5,7 NKT)<br /> Trung bình cộng<br /> S(3,5,7)NKT<br /> Xác suất độ tin cậy<br /> (P)<br /> <br /> acid nucleic<br /> 1018,75 ± 0,10<br /> Lô TN1<br /> a. nucleic<br /> ADN<br /> 1019,30<br /> 745,00<br /> ±0,12<br /> ±0,05<br /> 1018,50<br /> 745,10<br /> ±0,10<br /> ±0,03<br /> 1018,90<br /> 745,05<br /> ±0,11<br /> ±0,04<br /> 1019,25<br /> 745,05<br /> ±0,15<br /> ±0,03<br /> 1019,11<br /> 745,15<br /> ±0,13<br /> ±0,05<br /> 1019,18<br /> 745,10<br /> ±0,12<br /> ±0,04<br /> 1019,50<br /> 745,10<br /> ±0,10<br /> ±0,02<br /> 1019,30<br /> 745,08<br /> ±0,11<br /> ±0,04<br /> 1019,40<br /> 744,50<br /> ±0,11<br /> ±0,03<br /> 1019,16<br /> 745,08<br /> ±0,11<br /> ±0,03<br /> <br /> Lô ĐCTT1<br /> ADN<br /> 745,06 ± 0,04<br /> <br /> ARN<br /> 273,69 ± 0,15<br /> Lô ĐC1<br /> ARN<br /> a. Nucleic<br /> ADN<br /> ARN<br /> 274,30<br /> 1018,50<br /> 745,20<br /> 273,30<br /> ±0,12<br /> ±0,10<br /> ±0,04<br /> ±0,14<br /> 273,40<br /> 1019,00<br /> 745,00<br /> 274,00<br /> ±0,10<br /> ±012<br /> ±0,02<br /> ±0,12<br /> 273,85<br /> 1018,75<br /> 745,10<br /> 273,65<br /> ±0,11<br /> ±0,11<br /> ±0,03<br /> ±0,13<br /> 274,20<br /> 1019,00<br /> 745,00<br /> 274,00<br /> ±0,12<br /> ±0,13<br /> ±0,05<br /> ±0,13<br /> 273,96<br /> 1019,30<br /> 745,05<br /> 274,25<br /> ±0,14<br /> ±0,11<br /> ±0,03<br /> ±0,11<br /> 274,08<br /> 1019,15<br /> 745,02<br /> 274,13<br /> ±0,13<br /> ±0,12<br /> ±0,04<br /> ±0,12<br /> 274,40<br /> 1019,50<br /> 745,15<br /> 274,35<br /> ±0,11<br /> ±0,13<br /> ±0,02<br /> ±0,10<br /> 274,22<br /> 1019,90<br /> 745,00<br /> 274,90<br /> ±0,13<br /> ±0,11<br /> ±0,04<br /> ±0,12<br /> 275,50<br /> 1019,70<br /> 745,07<br /> 274,63<br /> ±0,12<br /> ±0,12<br /> ±0,03<br /> ±0,11<br /> 274,08<br /> 1019,20<br /> 745,06<br /> 274,14<br /> ±0,12<br /> ±0,11<br /> ±0,,03<br /> ±0,12<br /> Lô ĐCKT1<br /> <br /> acid nucleic<br /> <br /> ADN<br /> <br /> ARN<br /> <br /> 1019,19 ± 0,11<br /> <br /> 745,05±0,05<br /> <br /> 274,14 ± 0,12<br /> <br /> < 0,01<br /> <br /> < 0,001<br /> <br /> < 0,01<br /> <br /> Bảng 2. Hàm lượng acid nucleic, ADN, ARN mô gan chuột nhắt trắng ở các lô tính theo µg/g<br /> Thời gian<br /> trước tiêm<br /> Mẫu<br /> gan<br /> <br /> Thời gian<br /> sau tiêm<br /> <br /> 1<br /> S3NT<br /> <br /> acid nucleic<br /> 1019,16 ± 0,11<br /> Lô TN2<br /> a. nucleic<br /> ADN<br /> 1019,25<br /> 745,25<br /> ±0,11<br /> ±0,03<br /> <br /> Lô ĐCTT2<br /> ADN<br /> 745,07 ± 0,03<br /> ARN<br /> 274,00<br /> ±0,11<br /> <br /> a. nucleic<br /> 1019,00<br /> ±0,12<br /> <br /> ARN<br /> 274,09 ± 0,12<br /> Lô ĐC2<br /> ADN<br /> ARN<br /> 745,00<br /> 274,00<br /> ±0,04<br /> ±0,12<br /> <br /> TÁCH CHIẾT FLAVONOID TỪ NẤM HOÀNG CHI GANODERMA COLOSSUM...<br /> <br /> 2<br /> Trung bình<br /> S3NT<br /> 3<br /> S5NT<br /> 4<br /> Trung bình<br /> S5NT<br /> 5<br /> S7NT<br /> 6<br /> Trung bình<br /> S7NT<br /> Trung bình cộng<br /> S(3,5,7)NT<br /> Thời gian sau 3,5,7<br /> ngày không tiêm<br /> (S 3,5,7 NKT)<br /> Trung bình cộng<br /> S(3,5,7)NKT<br /> Xác suất độ tin cậy<br /> (P)<br /> <br /> 1018,75<br /> ±0,13<br /> 1019,00<br /> ±0,12<br /> 1019,70<br /> ±0,10<br /> 1019,00<br /> ±0,12<br /> 1019,35<br /> ±0,11<br /> 1019,35<br /> ±0,13<br /> 1019,3<br /> ±0,11<br /> 1019,32<br /> ±0,12<br /> 1019,22<br /> ±0,12<br /> <br /> 745,05<br /> ±0,05<br /> 745,15<br /> ±0,04<br /> 745,05<br /> ±0,02<br /> 745,15<br /> ±0,04<br /> 745,1<br /> ±0,03<br /> 745,00<br /> ±0,03<br /> 744,80<br /> ±0,05<br /> 744,90<br /> ±0,04<br /> 745,05<br /> ±0,03<br /> <br /> 273,70<br /> 1019,30<br /> ±0,13<br /> ±0,10<br /> 273,85<br /> 1019,15<br /> ±0,12<br /> ±0,11<br /> 274,65<br /> 1019,00<br /> ±0,12<br /> ±0,13<br /> 273,85<br /> 1019,20<br /> ±0,10<br /> ±0,11<br /> 274,25<br /> 1019,10<br /> ±0,11<br /> ±0,12<br /> 274,35<br /> 1019,40<br /> ±0,13<br /> ±0,10<br /> 274,50<br /> 1019,15<br /> ±0,11<br /> ±0,12<br /> 274,42<br /> 1019,27<br /> ±0.12<br /> ±0,11<br /> 274,17<br /> 1019,17<br /> ±0,11<br /> ±0,11<br /> Lô ĐCKT2<br /> <br /> 105<br /> <br /> 745,20<br /> ±0,02<br /> 745,10<br /> ±0,03<br /> 744,85<br /> ±0,04<br /> 745,15<br /> ±0,02<br /> 745,00<br /> ±0,03<br /> 7450,00<br /> ±0,05<br /> 745,20<br /> ±0,03<br /> 745,10<br /> ±0,04<br /> 745,07<br /> ±0,03<br /> <br /> 274,10<br /> ±0,14<br /> 274,05<br /> ±0,13<br /> 274,15<br /> ±0,15<br /> 274,05<br /> ±0,13<br /> 274,10<br /> ±0,14<br /> 274,40<br /> ±0,11<br /> 273,95<br /> ±0,13<br /> 274,17<br /> ±0,12<br /> 274,10<br /> ±0,12<br /> <br /> acid nucleic<br /> <br /> ADN<br /> <br /> ARN<br /> <br /> 1019,20 ± 0,12<br /> <br /> 745,06 ± 0,04<br /> <br /> 274,14 ± 0,11<br /> <br /> < 0,01<br /> <br /> < 0,001<br /> <br /> < 0,01<br /> <br /> Từ kết quả nghiên cứu trình bày ở bảng 1, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau:<br /> - Ở lô TN1 tiêm flovonoid 10% hay lô ĐC1 tiêm nước cất, giá trị trung bình hàm lượng<br /> acid nucleic, ARN sau 3 ngày tiêm (S3NT), sau 5 ngày tiêm (S5NT), sau 7 ngày tiêm<br /> (S7NT) đều tăng dần (lô TN1 tăng chậm hơn so với lô ĐC1, ĐCKT1) còn hàm lượng<br /> ADN thay đổi rất ít. Để có thể đánh giá flovonoid 10% có tác động lên hàm lượng acid<br /> nucleic, ADN, ARN mô gan chuột nhắt trắng, theo phương pháp xác suất thống kê áp<br /> dụng trong sinh học [10], chúng tôi đã tính trung bình cộng của ba chỉ số trên sau 3, 5, 7<br /> ngày tiêm ở lô TN1 rồi so sánh với ba chỉ số tương ứng ở lô ĐC1, ĐCKT1.<br /> Kết quả so sánh cho thấy: Trung bình cộng hàm lượng acid nucleic hay ARN ở lô TN1<br /> đều thấp hơn so với hàm lượng acid nucleic hay ARN ở lô ĐC1, lô ĐCKT1 với với xác<br /> suất độ tin cậy P < 0,01. Điều này có nghĩa là sự khác biệt về hàm lượng acid nucleic<br /> hay ARN ở lô TN1 so với hàm lượng acid nucleic hay ARN ở lô ĐC1 hay lô ĐCKT1 là<br /> không có thật, với mức ý nghĩa là 0,01. Riêng hàm lượng ADN ở lô TN1 so với hàm<br /> lượng ADN ở lô ĐC1 hay lô ĐCKT1 có sự khác biệt nhỏ, với xác suất độ tin cậy P <<br /> 0,001. Điều này có nghĩa là sự khác biệt về hàm lượng ADN ở lô TN1 so với hàm lượng<br /> ADN ở lô ĐC1 hay lô ĐCKT1 là không có thật, với mức ý nghĩa là 0,001. Loại trừ sai<br /> số khách quan thì hàm lượng acid nucleic, ADN, ARN ở lô TN1, lô ĐC1, lô ĐCKT1 là<br /> như nhau với mức ý nghĩa là 0,001.<br /> <br />