Tạo chồi in vitro lan đuôi chồn Rhynchostylis retusa

KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> TẠO CHỒI IN VITRO<br /> LAN ĐUÔI CHỒN Rhynchostylis retusa<br /> Hà Thị Tâm Tiến1, Nguyễn Phương Quý2,<br /> Ngô Thị Thu Thủy2, Vũ Xuân Dương1, Lê Thị Mận1<br /> 1<br /> PTN Công nghệ sinh học - Khoa Nông Lâm Ngư<br /> 2<br /> Lớp K9 ĐH Sư phạm sinh - Khoa Khoa học Tự nhiên<br /> <br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tạo chồi in vitro lan Đuôi chồn. Nguyên liệu sử dụng là hạt của quả<br /> lan 8 đến 10 tháng tuổi. Phương pháp khử trùng kép bằng NaOCl 2,5% trong thời gian 5 phút lần 1 và<br /> 10 phút lần 2 thích htợp nhất đối với quả lan đuôi chồn, hiệu quả khử trùng tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt<br /> 82,22%, không độc hại với con người và môi trường. Môi trường phát sinh chồi từ protocorm tốt nhất gồm:<br /> MS + 20 g sucrose + 100 ml nước dừa + 100 g khoai tây + 0,5 g than hoạt tính + 7 g agar + 0,5 mg BAP/l<br /> đạt 2,6 chồi/protocorm, chồi khỏe mạnh, hình thái bình thường, màu xanh cân đối.<br /> Từ khóa: Hạt lan, khử trùng, protocorm, Rhynchostylis retusa, tạo chồi.<br /> <br /> 1. Mở đầu và phát sinh protocorm tốt [4]. Hạt đang phát<br /> Lan đuôi chồn Rhynchostylis retusa là loài lan triển lan Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium<br /> rừng được người chơi lan rất ưa chuộng vì hoa fimbriatum) 3 tháng tuổi, nảy mầm và phát sinh<br /> đẹp và hương thơm. Lan đuôi chồn có thân ngắn, protocorm tốt nhất trong môi trường MS + 100<br /> lá cứng, dài, xếp khít từ phần gốc. Lá có hình chữ ml nước dừa + 10g saccharose + 6g agar/l [5].<br /> V, rộng khoảng 2 cm - 3 cm. Đầu lá chia hai thuỳ, Ngoài việc nhân giống bằng hạt, Lang và cộng sự<br /> nhìn kỹ có gân chạy dọc trên mặt lá, lá xếp khép lại đã tạo cây con thành công bằng sử dụng các đoạn<br /> như lòng thuyền. Hoa nở thành chuỗi với nhiều lá và đầu rễ cây Vanda coerulea trong môi trường<br /> hoa xếp khít nhau, hoa có màu trắng đốm tím, 1/4MS có bổ sung 0,3 mg/l TDZ và 5 mg/l 2,4D<br /> mùi thơm nhẹ, thường ra hoa khoảng tháng 4. Ở [2]. Để chủ động nguồn cây giống chất lượng cao,<br /> vườn Quốc gia Xuân Sơn, lan đuôi chồn sống bám sạch bệnh phục vụ cho công tác bảo tồn các giống<br /> trên những thân cây to. Hiện nay tại Việt Nam các lan có giá trị tại Vườn Quốc gia Xuân Sơn Phú<br /> loại lan rừng bị khai thác quá mức, đang có nguy Thọ. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu về các loại<br /> cơ cạn kiệt. Trong tự nhiên, hạt lan phát triển rất hóa chất khử trùng, phương pháp khử trùng mẫu<br /> kém ngay cả khi đã chín, chúng phụ thuộc vào sự để tạo vật liệu khởi đầu sạch và tìm ra môi trường<br /> nhiễm nấm để nảy mầm và phát triển. Phương thích hợp nhất để nhân giống tạo chồi cho hạt lan<br /> pháp nuôi cấy không cộng sinh được phát triển đuôi chồn.<br /> sau nghiên cứu của Knudson (1922) [1], hạt lan<br /> có thể nảy mầm trong môi trường muối khoáng 2. Phương pháp nghiên cứu<br /> đơn giản có chứa đường. Tiếp sau đó, đã có một 2.1. Nguyên vật liệu<br /> số tác giả nghiên cứu nhân giống bằng hạt các<br /> Quả lan đuôi chồn độ tuổi 8 đến 10 tháng được<br /> loài lan khác nhau. Hạt lan Rhynchostylis retusa<br /> thu hái tự nhiên từ những cây lan khỏe mạnh tại<br /> còn non tạo mô sẹo tốt trong môi trường Vacin<br /> Vườn Quốc gia Xuân Sơn, tỉnh Phú Thọ. Hạt được<br /> and Went (VW) bổ sung 15% nước dừa và phát<br /> sử dụng làm mẫu nuôi cấy.<br /> sinh protocorm trong môi trường Murashige and<br /> Skoog (MS) bổ sung 1 mg/l BA, 1 mg/l NAA và 2.2. Phương pháp nghiên cứu<br /> 15% nước dừa [3] . Hạt lan Kim điệp (Dendrobium 2.2.1. Khử trùng mẫu cấy<br /> chrysotosum) 3 tháng tuổi được khử trùng bằng Quả lan đuôi chồn còn nguyên vẹn được thu<br /> HgCl2 0,1% trong 10 phút cho khả năng nảy mầm hái, rửa sạch bằng dung dịch xà phòng 5% và<br /> Tạp chí Khoa học Công nghệ • Số 1 (1) - 2015 73<br />  KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP<br /> <br /> rửa sạch bằng nước cất nhiều lần trước khi tiến 7 g/l agar, 20 g/l sucrose, bổ sung 10% nước dừa, 100<br /> hành khử trùng trong box cấy. Mẫu quả được xử g/l khoai tây và 0,5g/l than hoạt tính.<br /> lý bằng cồn 70% trong 1 phút sau đó khử trùng 2.2.3. Phát sinh chồi từ protocorm<br /> bề mặt bằng các loại hóa chất khử trùng HgCl2<br /> Các protocorm được cấy lên môi trường MS<br /> (nồng độ 0,01%, 0,05% và 0,1%), H2O2 (nồng độ<br /> cơ bản có bổ sung thêm 7g/l agar, 20 g/l sucrose,<br /> 1%, 5% và 10%) và NaOCl (nồng độ 1%, 2,5% và<br /> 100 g/l khoai tây, 10% nước dừa, 0,5 g/l than hoạt<br /> 5%) trong thời gian 15 phút đối với khử trùng đơn tính và BAP với các nồng độ 0,5; 1,0 và 1,5 mg/l<br /> và 5 phút lần 1, 10 phút lần 2 đối với khử trùng benzylamino purine (BAP) để thăm dò khả năng<br /> kép. Cuối cùng quả được rửa lại 5 lần bằng nước hình thành chồi.<br /> cất vô trùng. Các thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi công thức<br /> 2.2.2. Nảy mầm và phát sinh protocorm bố trí 10 bình tam giác dung tích 250 ml. Kết quả<br /> Hạt lan thu từ quả đã khử trùng được cấy lên môi thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm<br /> trường MS cơ bản (Murashige and Skoog, 1962) có IRRISTART 5.0.<br /> <br /> <br /> 3. Kết quả<br /> 3.1. Sự nảy mầm phát sinh protocorm<br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của hóa chất và nồng độ hóa chất<br /> theo phương pháp khử trùng đơn đến mẫu cấy<br /> Công thức Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%)<br /> CT1 (ĐC) 0,00 100 0,00<br /> CT2 (HgCl2 0,01%) 21,11 65,56 13,33<br /> CT3 (HgCl2 0,05%) 52,22 41,11 6,67<br /> CT4 (HgCl2 0,1%) 92,22 7,78 0,00<br /> CT5 (H2O2 1%) 7,78 92,22 0,00<br /> CT6 (H2O2 5%) 31,11 62,22 6,67<br /> CT7 (H2O2 10%) 37,78 52,22 10,00<br /> CT8 (NaOCl 1%) 24,44 65,56 10,00<br /> CT9 (NaOCl 2,5%) 71,11 28,89 0,00<br /> CT10 (NaOCl 5%) 75,56 21,11 3,33<br /> LSD0,05 0,93<br /> CV% 4,4<br /> <br /> <br /> Các hạt lan ban đầu có màu trắng được nuôi lệ mẫu sống đạt 92,22%. Tiếp đó khử trùng bằng<br /> cấy in vitro sau 2 tuần đã chuyển sang màu nâu NaOCl 2,5% và 5% tỷ lệ mẫu sống đạt 71,11% và<br /> vàng và bắt đầu trương lên. Sau 4 đến 5 tuần hạt 75,56%. Cùng chất khử trùng nhưng ở nồng độ<br /> tiếp tục trương lên có hình cầu màu xanh nhạt, nhỏ hơn hiệu quả khử trùng sẽ kém hơn như khử<br /> bóng, sau đó chuyển sang màu xanh đậm, mọng trùng bằng HgCl2 0,05% tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt<br /> nước. Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy được trình bày 52,22%, tỷ lệ mẫu nhiễm lên đến 41,11%; dùng<br /> trong bảng 1. HgCl2 0,01% tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt 21,11% trong<br /> Số liệu bảng 1 cho thấy, mỗi loại hóa chất khử khi đó tỷ lệ mẫu nhiễm tăng rõ rệt lên đến 65,56%;<br /> trùng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến dùng NaOCl 1% tỷ lệ mẫu nhiễm là 65,56%. Khử<br /> mẫu cấy. Quả lan được khử trùng bằng HgCl2 trùng bằng H2O2 hiệu quả khử trùng kém nhất,<br /> 0,1%, NaOCl 2,5% và NaOCl 5% có tác dụng rõ nồng độ H2O2 khử trùng càng thấp hiệu quả khử<br /> rệt đối với sự nảy mầm và phát sinh protocorm trùng càng kém. H2O2 10% có tỷ lệ mẫu sống đạt<br /> của hạt so với đối chứng. Khử trùng bằng HgCl2 37,78%; H2O2 5% có tỷ lệ mẫu sống 31,11% trong<br /> 0,1% trong 15 phút cho hiệu quả tốt nhất, với tỷ khi dùng H2O2 1% tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt 7,78%.<br /> 74 Tạp chí Khoa học Công nghệ • Số 1 (1) - 2015<br />  KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của hóa chất và nồng độ hóa chất theo phương pháp khử trùng kép đến mẫu cấy<br /> Công thức Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu chết (%)<br /> CT11 (ĐC) 0,00 100 0,00<br /> CT12 (HgCl2 0,01%) 11,11 82,22 6,67<br /> CT13 (HgCl2 0,05%) 47,78 52,22 0,00<br /> CT14 (HgCl2 0,1%) 98,89 1,11 0,00<br /> CT15 (H2O2 1%) 0,00 100 0.00<br /> CT16 (H2O2 5%) 5,56 87,77 6,67<br /> CT17 (H2O2 10%) 32,22 61,11 6,67<br /> CT18 (NaOCl 1%) 12,22 77,78 10,00<br /> CT19 (NaOCl 2,5%) 82,22 14,45 3,33<br /> CT20 (NaOCl 5%) 74,44 5,56 20,00<br /> LSD0,05 0,88<br /> CV% 4,7<br /> <br /> Tương tự phương pháp khử trùng đơn, các hạt H2O2 cho hiệu quả khử trùng thấp nhất số mẫu bị<br /> lan ban đầu có màu trắng được nuôi cấy in vitro nhiễm nhiều tỷ lệ mẫu nhiễm từ 90 - 100%.<br /> sau 2 tuần đã chuyển sang màu nâu vàng. Sau 4 - 5 Như vậy, khử trùng bằng HgCl2 cho hiệu quả<br /> tuần hạt tiếp tục trương lên có hình cầu màu xanh khử trùng cao nhất, tuy nhiên thủy ngân clorua rất<br /> nhạt sau đó chuyển sang màu xanh đậm, mọng độc với con người và môi trường nếu không được<br /> nước. Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy được trình bày xử lý đúng tiêu chuẩn. Vì vậy, chúng tôi đề xuất sử<br /> trong bảng 2. dụng phương pháp khử trùng quả lan bằng NaOCl<br /> Số liệu bảng 2 cho thấy, khử trùng quả lan bằng 2,5% có hiệu quả khử trùng khá cao, an toàn với<br /> HgCl2 0,1% đạt kết quả tốt nhất với tỷ lệ mẫu sống người sử dụng.<br /> đạt 98,89%, tiếp đó khử trùng bằng NaOCl 2,5% Các mẫu sống thu được ở cả hai phương pháp<br /> tỷ lệ mẫu sống đạt 82,22%; dùng NaOCl 5% cho tỷ khử trùng đơn và khử trùng kép có hình thái giống<br /> lệ mẫu sống đạt 74,44%. Các công thức khử trùng nhau. Protocorm dạng hình cầu, màu xanh đậm,<br /> còn lại cho tỷ lệ mẫu sống đạt thấp. Khử trùng bằng mọng nước (Hình 1)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> (a) (b)<br /> Hình 1. Protocorm phát sinh từ hạt lan Đuôi chồn Rhynchostylis retusa<br /> Khử trùng bằng HgCl2 0,1%; (b) Khử trùng bằng NaOCl 2,5%<br /> 3.2. Sự phát sinh chồi sinh trên môi trường có 1,0 và 1,5 mg/l BAP cho số<br /> Kết quả phát sinh chồi từ protocorm sau 8 tuần nuôi chồi /protocorm đạt 2,2 đến 2,3 chồi/protocorm, tuy<br /> cấy (Hình 2) cho thấy, nồng độ BAP có ảnh hưởng rõ nhiên chồi phát triển kém hơn bé hơn so với môi<br /> rệt đến sự phát sinh chồi. Trên môi trường có 0,5 mg/l trường có 0,5 mg/l BAP và ngoài sự phát sinh chồi<br /> BAP cho số chồi/ protocorm cao nhất đạt 2,6 chồi/ một số protocorm còn phát sinh mô sẹo. Môi trường<br /> protocorm, số protocorm bị chết rất ít. Các chồi phát đối chứng không bổ sung BAP cho số chồi/protocorm<br /> triển trên môi trường có 0,5 mg/l BAP sinh trưởng đạt 2,2 chồi/protocorm, các chồi có màu xanh cân đối<br /> mạnh nhất chồi to khỏe, màu xanh cân đối. Chồi phát nhưng nhỏ, số protocorm chết nhiều.<br /> <br /> Tạp chí Khoa học Công nghệ • Số 1 (1) - 2015 75<br />  KHOA HỌC NÔNG - LÂM NGHIỆP<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> (a) (b)<br /> Hình 2. Chồi hoa lan Đuôi chồn Rhynchostylis retusa phát sinh từ protocorm<br /> Môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BAP; (b) Môi trường bổ sung 1,5 mg/l BAP<br /> Kết luận Handbook of Plant cell cuture”, McGraw-Hill, New<br /> Phương pháp khử trùng kép bằng NaOCl 2,5% York, vol 5, pp. 598-633.<br /> trong thời gian 5 phút lần 1 và 10 phút lần 2 đạt hiệu 2. Lang NT, Hang NT (2006), “Using biotechnological<br /> quả khử trùng tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 82,22%, approaches for Vanda orchid improvement”, Omonrice,<br /> 14, pp. 140-143.<br /> không độc hại với con người và môi trường.<br /> 3. Parab GV, Krishnan S (2012), “Rapid in vitro mass<br /> Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 10<br /> multiplication of orchids Aerides maculosa Lindl. and<br /> phút và 15 phút cho hiệu quả khử trùng tốt, tỷ lệ Rhynchostylis retusa (L.) Bl. from immature seed”, Indian<br /> mẫu sống cao đạt 92,22% và 98,89%. Tuy nhiên Journal of Biotechnology, Vol 11, pp. 288-294.<br /> HgCl2 độc hại với con người và môi trường. 4. Nguyễn Văn Song, Phan Hùng Vĩnh, Trương Thị<br /> Môi trường phát sinh chồi từ protocorm tốt nhất Bích Phượng (2011), “Nhân nhanh in vitro lan Kim điệp<br /> gồm: MS + 20 g sucrose + 100 ml nước dừa + 100 (Dendrobium chrysotoxum) - một loài lan rừng có nguy<br /> g khoai tây + 0,5 g than hoạt tính + 7 g agar + 0,5 cơ tuyệt chủng”, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, số 64,<br /> mg BAP/l đạt 2,6 chồi/protocorm, chồi khỏe mạnh, tr. 127-136.<br /> hình thái bình thường, màu xanh cân đối. 5. Nguyễn Thị Sơn, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Ngọc<br /> Lan, Trần Thế Mai (2012), “Nhân giống in vitro loài<br /> Tài liệu tham khảo lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Hoàng Thảo Long<br /> 1. Goh CJ, Ammirato PV, Evans DR, Sharp Nhãn)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, trường Đại học<br /> WR, Bajaj YPS (1990), “Orchids, Monopodials. In: Nông nghiệp Hà Nội, tập 10, số 2, tr. 263-271.<br /> <br /> <br /> <br /> SUMMARY<br /> IN VITRO SHOOT REGENERATION OF RHYNCHOSTYLIS RETUSA<br /> <br /> Ha Thi Tam Tien1, Nguyen Phuong Quy2, Ngo Thi Thu Thuy2, Vu Xuan Duong1, Le Thi Man1<br /> 1<br /> Section for Biotechnology Experiments - Faculty of Agro-forestry and Aquaculture<br /> 2<br /> K9-Graduate course in Biology Pedagogy - Faculty of Natural Sciences<br /> <br /> We carried out in vitro shoot regeneration of Rhynchostylis retusa. The seeds from 8 to 10 months old were<br /> used for propagation. The two-time sterilization treatment by 2.5% NaOCl for 5 minutes and 10 minutes<br /> was much appropriated for fruit of Rhynchostylis retusa with the best sterilization efficiency, alive protocorm<br /> rate being 82.22%, and non-toxic to humans and environment. The best shoot formation medium included<br /> MS + 20 g of sucrose + 100 ml of coconut milk + 100 g of potato + 0.5 g of activated charcoal + 7 g of agar +<br /> 0.5 mg of BAP/l . The rate of shoot induction on this medium attained 2.6 shoots per protocorm. The formed<br /> shoots were strong, green and normal in morphology.<br /> Keywords: orchid seeds, sterilization, protocorm, Rhynchostylis retusa, shoot regeneration.<br /> <br /> <br /> 76 Tạp chí Khoa học Công nghệ • Số 1 (1) - 2015<br />