Tạo dòng lúa kháng bệnh đạo ôn và có chất lượng gạo tốt bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn và kỹ thuật PCR

26(3): 48-55 T¹p chÝ Sinh häc 9-2004<br /> <br /> <br /> <br /> T¹o dßng lóa kh¸ng bÖnh ®¹o «n vµ cã chÊt l−îng g¹o tèt<br /> b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy bao phÊn vµ kü thuËt PCR<br /> <br /> Phan ThÞ B¶y, §µo ThÞ H¹nh, Qu¸ch ThÞ Liªn,<br /> Lª ThÞ Muéi, NguyÔn §øc Thµnh<br /> ViÖn C«ng nghÖ sinh häc<br /> <br /> Ngoµi c¸c chØ tiªu vÒ n¨ng suÊt vµ chÊt WAB56-125/TÎ tÐp<br /> l−îng, c¸c gièng lóa ®−îc ph¸t triÓn vµ c¶i t¹o<br /> - C¸c måi STS:<br /> cÇn ph¶i cã kh¶ n¨ng chèng chÞu víi s©u bÖnh ,<br /> chèng chÞu víi c¸c ®iÒu kiÖn bÊt lîi cña m«i RG64 lµ måi liªn kÕt víi gien kh¸ng bÖnh<br /> tr−êng vµ thÝch nghi víi nh÷ng ®iÒu kiÖn ngo¹i ®¹o «n Pi-2(t)<br /> c¶nh hÕt søc ®a d¹ng th× míi cã thÓ ph¸t triÓn<br /> ®−îc ë c¸c vïng ®Þa lý kh¸c nhau ®Ó cho n¨ng RG28 lµ måi liªn kÕt víi tÝnh th¬m cña g¹o<br /> suÊt cao vµ chÊt l−îng tèt. RG171 vµ G243 lµ c¸c måi liªn kÕt víi ®é<br /> Trong bµi nµy, chóng t«i giíi thiÖu mét sè bÒn gel<br /> kÕt qu¶ b−íc ®Çu trong quy tr×nh chän dßng lóa Wxa vµ Wxb lµ c¸c måi liªn kÕt víi hµm<br /> kh¸ng bÖnh ®¹o «n b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy l−îng amyloza<br /> bao phÊn kÕt hîp sù trî gióp cña c¸c dÊu ph©n RZ323 lµ måi liªn kÕt víi ®é dµi cña h¹t.<br /> tö.<br /> 2. Ph−¬ng ph¸p<br /> I. ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu Lai gièng b»ng ph−¬ng ph¸p lai cæ ®iÓn.<br /> 1. VËt liÖu Nu«i cÊy bao phÊn: C¸c ®ßng lóa ®−îc lÊy ë<br /> giai ®o¹n cã tai l¸ ®ßng c¸ch tai l¸ thø nhÊt<br /> - Mét sè dßng/gièng lóa kh¸ng bÖnh ®¹o «n chõng 2-5 cm, tuú thuéc c¸c dßng/gièng lóa<br /> Moroberekan-nhËn tõ ViÖn nghiªn cøu lóa kh¸c nhau. §ßng ®−îc lÊy vµo buæi s¸ng tõ 9-<br /> quèc tÕ. C71 vµ TÎ tÐp nhËn tõ ViÖn B¶o vÖ thùc 10h. §ßng ®−îc xö lý l¹nh tr−íc khi ®em cÊy ë<br /> vËt. BR12 lµ dßng lóa kh¸ng bÖnh ®¹o «n míi ®iÒu kiÖn 6-8oC trong thêi gian 2-5 ngµy.<br /> chän t¹o t¹i phßng Di truyÒn tÕ bµo thùc vËt, Khö trïng ®ßng b»ng c¸ch dïng b«ng tÈm<br /> ViÖn C«ng nghÖ sinh häc cån 96o lau kü toµn bé bÒ mÆt ®ßng, sau ®ã t¸ch<br /> bá c¸c líp l¸ vµ bÑ bao bäc bªn ngoµi cïng líp<br /> - Hai gièng lóa cã chÊt l−îng tèt vá máng bªn trong. Chän c¸c hoa cã h¹t phÊn ë<br /> KDML105, WAB56-125 nhËn tõ ViÖn giai ®o¹n ®¬n nh©n, c¾t lÊy c¸c bao phÊn cÊy lªn<br /> nghiªn cøu lóa quèc tÕ m«i tr−êng t¹o m« sÑo. T¹o m« sÑo tõ bao phÊn<br /> lóa trªn m«i tr−êng MT4 (N6 + 2 mg/l 2,4D +10<br /> - Khang d©n lµ gièng lóa cã n¨ng suÊt cao vµ mg/l AgNO3 +0,5 mg/l kinetin +8 g/l th¹ch + 60<br /> chÊt l−îng kh¸ nhËn tõ ViÖn B¶o vÖ thùc vËt g/l ®−êng), trong ®iÒu kiÖn kh«ng chiÕu s¸ng vµ<br /> - C©y F1 cña c¸c cÆp lai: nhiÖt ®é phßng 26-28oC.<br /> Moroberekan/KDM L 105 T¸i sinh c©y tõ m« sÑo nu«i cÊy bao phÊn<br /> trªn m«i tr−êng MSC1 (MS + 1 mg/l BAP + 0,2<br /> Moroberekan/WAB 56-125<br /> mg/l NAA + 100 ml/l n−íc dõa + 30 g/l ®−êng<br /> BR12/WAB56-125 + 8 g/l th¹ch), t¹o rÔ trªn m«i tr−êng MS kh«ng<br /> C71/ KDML105 cã chÊt kÝch thÝch sinh tr−ëng, trong ®iÒu kiÖn<br /> ¸nh s¸ng ®Ìn nª-«ng vµ nhiÖt ®é phßng 28oC.<br /> Khang d©n/Moroberekan<br /> <br /> 48<br />  Trång c©y ra ruéng thÝ nghiÖm, ®¸nh gi¸ c¸c chuÈn hãa chÊt l−îng n«ng s¶n, ViÖn C«ng nghÖ<br /> chØ tiªu n«ng sinh häc theo ph−¬ng ph¸p th«ng sau thu ho¹ch, th¸ng 12 n¨m 2002.<br /> dông cña Trung t©m Kh¶o nghiÖm gièng c©y<br /> trång thuéc Bé N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn n«ng II. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn<br /> th«n.<br /> Ph¶n øng PCR ®−îc tiÕn hµnh nh− sau 1. KÕt qu¶ t¹o m« sÑo vµ t¸i sinh c©y tõ nu«i<br /> cÊy bao phÊn<br /> Hçn hîp ph¶n øng PCR víi c¸c måi STS (25<br /> Trong nu«i cÊy bao phÊn, cã nhiÒu yÕu tè<br /> µl) chøa trong èng Eppendorf (0,5 ml) bao gåm:<br /> ¶nh h−ëng ®Õn kh¶ n¨ng ph¸t triÓn m« sÑo vµ t¸i<br /> n−íc v« trïng 17,4 µl; dung dÞch ®Öm 10 X PCR sinh c©y, nh−ng yÕu tè quan träng nhÊt lµ kiÓu<br /> 2,5 µl; dNTP (5 mM) 0,6 µl; MgCl2 (50 mM) gien ®−a vµo nu«i cÊy.<br /> 0,5 µl; måi (primer) 1 µl ; Taq polymeraza 0,5<br /> C¸c bao phÊn ®| khö trïng ®−îc cÊy lªn m«i<br /> µl; ADN mÉu t¸ch tõ l¸ lóa 2,5 µl ( 0,02 µg/µl). tr−êng MT4; sau 4-6 tuÇn, mét sè bao phÊn b¾t<br /> Ch−¬ng tr×nh ch¹y PCR cho c¸c måi STS: ®Çu ph¸t triÓn thµnh c¸c khèi m« sÑo mµu tr¾ng.<br /> 1) 94oC 4 phót; 2) 40 chu kú (94oC 1 phót, 58oC Khi c¸c khèi m« sÑo ®| lín, ®¹t ®−êng kÝnh<br /> 1 phót 30 gi©y, 72oC 2 phót); 3) 72oC 5 phót. kho¶ng chõng 1-2 mm, chóng ®−îc cÊy chuyÓn<br /> sang c¸c b×nh chøa m«i tr−êng t¸i sinh c©y<br /> §iÖn di vµ ®äc kÕt qu¶ PCR: S¶n phÈm PCR<br /> MSC1. C¸c b×nh m« t¸i sinh c©y ®−îc nu«i<br /> ®−îc kiÓm tra b»ng ph−¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel<br /> trong ®iÒu kiÖn ¸nh s¸ng ®Ìn nª-«ng, nhiÖt ®é<br /> agaroza 1%. MÉu ADN (s¶n phÈm PCR) ®−îc<br /> phßng 26-28oC. Sau 3-4 tuÇn nu«i cÊy, mét sè<br /> trén ®Òu víi ®Öm n¹p mÉu 3X tr−íc khi n¹p mÉu<br /> m« sÑo b¾t ®Çu t¹o chåi, kÕt qu¶ t¹o chåi ®−îc<br /> vµo giÕng. Thêi gian ®iÖn di kho¶ng 2 giê ë ®iÖn<br /> ghi nhËn ë b¶ng 1. C¸c chåi t¸i sinh ®−îc<br /> thÕ 70V. Nhuém ADN b»ng EtBr, trong thêi<br /> chuyÓn sang m«i tr−êng MS kh«ng cã chÊt kÝch<br /> gian 30 phót. Röa gel b»ng n−íc cÊt trong 30<br /> thÝch sinh tr−ëng ®Ó ph¸t triÓn thµnh c©y hoµn<br /> phót. Sau ®ã b¶n gel ®−îc quan s¸t vµ chôp ¶nh<br /> chØnh (l¸, th©n, rÔ). Sau ®ã, c©y hoµn chØnh ®−îc<br /> d−íi ®Ìn tö ngo¹i.<br /> trång ra nhµ kÝnh, tiÕp tôc theo dâi, ®¸nh gi¸ vµ<br /> Ph©n tÝch c¸c chØ tiªu sinh hãa theo ph−¬ng chän dßng nhÞ béi cã c¸c ®Æc ®iÓm nh− mong<br /> ph¸p th«ng dông cña Trung t©m kiÓm tra vµ tiªu muèn.<br /> <br /> B¶ng 1<br /> <br /> KÕt qu¶ t¹o m« sÑo vµ t¸i sinh c©y tõ nu«i cÊy bao phÊn<br /> <br /> Sè m« sÑo h×nh T¸i sinh c©y<br /> CÆp Sè bao phÊn thµnh vµ cÊy Sè m« t¸i sinh Sè m« t¹o c©y Sè m« t¹o c©y<br /> nu«i cÊy chuyÓn c©y xanh b¹ch t¹ng<br /> lai<br /> Sè m« % Sè m« % Sè m« % Sè m« %<br /> 1 750 38 5,1 12 31,5 2 16,6 10 83,4<br /> 2 720 130 18 94 72,3 32 34 62 66<br /> 3 870 285 32,7 44 15,4 15 34 29 66<br /> 4 1050 140 13,3 16 14,4 2 12,5 14 87,5<br /> 5 1870 131 7 59 45 3 5 56 95<br /> 6 2160 248 11 111 44 29 20 82 74<br /> Chó thÝch: thø tù c¸c cÆp lai xem ë trang 1.<br /> <br /> KÕt qu¶ nhËn ®−îc (b¶ng 1) cho thÊy kh¶ trªn m«i tr−êng nu«i cÊy chän läc lµ rÊt kh¸c<br /> n¨ng t¹o m« sÑo cña c¸c dßng c©y lai kh¸c nhau nhau vµ thay ®æi tõ 5,1-32,7%. Tû lÖ t¹o m« sÑo<br /> 49<br /> cao nhÊt ë c©y F1 cña cÆp lai sè 3 (BR12/ quÇn thÓ c©y t¸i sinh còng rÊt kh¸c nhau. Sù<br /> WAB56-125), thÊp nhÊt ë c©y F1 cña cÆp lai sè ph¸t triÓn cña c©y xanh ë m« sÑo cña c©y F1 cña<br /> 1 (Moroberekan/KDML105). cÆp lai sè 2 lµ cao nhÊt, ®¹t tû lÖ 34% vµ chåi rÊt<br /> Sè liÖu ë b¶ng 1 còng cho thÊy kh¶ n¨ng t¸i kháe (h×nh 1), c¸c chåi nµy cã th©n l¸ mµu xanh<br /> sinh c©y tõ m« sÑo cña c¸c dßng c©y lai nãi trªn ®Ëm, trong khi ®ã m« sÑo tõ c©y F1 cña cÆp lai<br /> thay ®æi tõ 14,4-72,3%, cao nhÊt ë c©y F1 cña sè 1 vµ sè 5 ë phÇn lín c¸c b×nh nu«i cÊy toµn<br /> cÆp lai sè 2 (Moroberekan/WAB56-125), thÊp cho c©y b¹ch t¹ng (h×nh 2), tû lÖ c©y xanh thÊp<br /> nhÊt ë c©y F1 cña cÆp lai sè 4 (C71/ nhÊt ë cÆp lai sè 5 (Kh¸ng d©n/Moroberekan),<br /> KDML105). Kh¶ n¨ng ph¸t triÓn c©y xanh trong ®¹t 5%.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> H×nh 1 H×nh 2<br /> <br /> KÕt qu¶ nhËn ®−îc trªn ®©y cho thÊy kiÓu l−íi cã 195 c©y tõ 15 dßng m« sÑo (47%) lµ c©y<br /> gien cã ¶nh h−ëng rÊt lín ®Õn kh¶ n¨ng t¹o m« ®¬n béi vµ 285 c©y tõ 17 dßng m« sÑo (53%) lµ<br /> sÑo vµ t¸i sinh c©y xanh trong nu«i cÊy bao c©y nhÞ béi. Trong sè 17 dßng cho c©y nhÞ béi,<br /> phÊn. C¸c kÕt qu¶ mµ chóng t«i nhËn ®−îc phï cã 12 dßng cã sè l−îng c©y lín vµ c©y sinh<br /> hîp víi c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu tr−íc ®©y cña tr−ëng ph¸t triÓn tèt, 5 dßng kh¸c chØ cã 1-2<br /> Nghiªm Nh− V©n vµ cs. (1996), Ph¹m Ngäc c©y. C¸c c©y t¸i sinh tõ mét khèi m« sÑo ®−îc<br /> L−¬ng vµ cs. (1999), NguyÔn §øc Thµnh vµ cs. tÝnh mét dßng trong qu¸ tr×nh thÝ nghiÖm.<br /> (1999). 12 dßng c©y tõ bao phÊn cã kh¶ n¨ng sinh<br /> Trong thÝ nghiÖm nµy, chóng t«i tËp trung tr−ëng tèt trong nhµ kÝnh cïng c¸c c©y bè mÑ,<br /> nghiªn cøu quÇn thÓ c©y t¸i sinh tõ nu«i cÊy bao c©y F1 cña cÆp lai sè 2 ®−îc lÊy mÉu l¸ ®Ó t¸ch<br /> phÊn cña cÆp lai sè 2; ®©y lµ cÆp lai nhËn ®−îc ADN. Sù ®a d¹ng cña ph©n tö ADN gi÷a c¸c<br /> sè dßng c©y xanh nhiÒu nhÊt trong sè c¸c cÆp lai dßng/gièng lóa ®−îc ph©n tÝch b»ng kü thuËt<br /> kÓ trªn. PCR víi mét sè cÆp måi STS (RG64, RG28,<br /> RG171, Wx1, Wxa, Wxb, G243, RZ323). §iÖn<br /> 2. Kh¶o s¸t tÝnh kh¸ng bÖnh ®¹o «n vµ chÊt<br /> di ®å s¶n phÈm PCR nhËn ®−îc: cã måi RG64<br /> l−îng cña g¹o ë møc ph©n tö cña mét sè cho sù kh¸c nhau gi÷a c©y bè, c©y mÑ, c©y F1<br /> dßng c©y nu«i cÊy bao phÊn vµ c¸c dßng c©y nu«i cÊy bao phÊn (h×nh 3),<br /> Trong 480 c©y t¸i sinh tõ 32 dßng m« sÑo cßn s¶n phÈm PCR cña ADN cña c¸c gièng lóa<br /> nu«i cÊy bao phÊn cña cÆp lai sè 2 trång ra nhµ Moroberekan, WAB56-125, KDML105, TÎ tÐp,<br /> <br /> 50<br /> BR12 víi c¸c måi liªn quan ®Õn chÊt l−îng cña ch−a cã sù ®a h×nh gi÷a c¸c dßng/gièng lóa<br /> h¹t, chØ cho c¸c b¨ng ADN gièng hÖt nhau, (h×nh 4).<br /> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17<br /> <br /> <br /> <br /> <br />