Tạo dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae mang dung hợp gen nhằm biểu hiện Reutericin trên bề mặt tế bào

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 196­201<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> TẠO DÒNG NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae  MANG DUNG HỢP GEN <br /> NHẰM BIỂU HIỆN REUTERICIN TRÊN BỀ MẶT TẾ BÀO<br /> <br /> Nguyễn Hiếu Nghĩa, Nguyễn Trí Nhân, Đặng Thị Phương Thảo*<br /> Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG­HCM, *thaodp@hcmus.edu.vn<br /> <br /> TÓM   TẮT:  Reutericin   là   bacteriocin   nhóm   II   dạng   vòng,   bền   nhiệt   có   nguồn   gốc   từ <br /> Lactobacillus reuteri,  được  ứng dụng nhiều trong công  nghiệp thực phẩm. Các chủng  sinh  <br /> bacteriocin có nguồn gốc tự  nhiên biểu hiện peptide này ở  mức độ  thấp, do đó có nhiều chiến  <br /> lược phát triển nhằm tăng sự biểu hiện bacteriocin mục tiêu thông qua kỹ thuật tái tổ  hợp gen. <br /> Trong nhiều chủng chủ biểu hiện protein tái tổ  hợp, nấm men  Saccharomyces cerevisiae được <br /> biết đến như một chủng chủ có giá trị dinh dưỡng cao, được ứng dụng trong công nghiệp thực  <br /> phẩm cũng như  probiotic. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày một cách tiếp cận mới bằng  <br /> chiến lược biểu hiện Reutericin trên bề  mặt tế  bào nấm men Saccharomyces cerevisiae nhằm <br /> hướng tới phát triển tế  bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cho chế  phẩm probiotic trong <br /> chăn nuôi gia súc và nuôi trồng thuỷ hải sản. Gen mã hoá cho Reutericin được dung hợp với với  <br /> gen  α­agglutinin, mã hoá cho  α­Agglutinin trên bề  mặt tế  bào nấm men. Tế  bào nấm men <br /> Saccharomyces cerevisiae W303 tái tổ hợp mang dung hợp gen reutericin­ α­agglutinin cho thấy <br /> khả  năng sinh trưởng trên môi trường khuyết dưỡng tryptophan. Kết quả  quan sát dưới kính <br /> hiển vi huỳnh quang cũng cho thấy Reutericin đã được biểu hiện trên bề mặt tế bào nấm men.  <br /> Như vậy, các kết quả thực nghiệm chứng tỏ chúng tôi đã tạo dòng thành công dòng tế bào nấm <br /> men  Saccharomyces cerevisiae  W303:  reutericin  mang và biểu hiện Reutericin trên bề  mặt tế <br /> bào. <br /> Từ khóa: agglutinin, bacteriocin, bề mặt tế bào, reutericin, nấm men.<br /> <br /> MỞ ĐẦU GRAS   (generally   regarded   as   safe);   nhi ều  <br /> nghiên cứu về  sản xuất bacteriocin tái tổ  hợp <br /> Bacteriocin   là   những   peptide   hay   protein <br /> từ  Saccharomyces   cerevisiae  đã   thành   công <br /> kháng   khuẩn,   được   sinh   tổng   hợp   bởi   vi  <br /> như  Pediocin  , Enterocin L50 . Song song đó, <br /> khuẩn Gram âm hoặc Gram dương . Reutericin <br /> những thành công về  biểu hiện protein tái tổ <br /> là   bacteriocin  nhóm   IIc,   được   sinh   tổng   hợp  <br /> hợp trên bề  mặt tế  bào nấm men bằng dung <br /> bởi  Lactobacillus reuteri  LA6, có trọng lượng <br /> hợp   gen   mục   tiêu   với   gen   mã   hóa   cho   các  <br /> phân tử 5,6kDa, bền nhiệt, tác động vào màng <br /> protein trên màng tế  bào đã mở  ra một hướng <br /> tế   bào   của   tế   bào   vi   khuẩn   mục   tiêu   như <br /> phát   triển   mới   cho   công   nghệ   protein   tái   tổ <br /> Lactobacillus bulgaricus. Bacteriocin được sản <br /> hợp. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng protein như <br /> xuất bởi các vi khuẩn lactic (LAB), được công <br /> FLO1, Cwps và a­/α­agglutinin để  dung hợp, <br /> nhận an toàn trong bảo quản thực phẩm . Biểu <br /> biểu hiện protein mục tiêu lên bề  mặt tế  bào <br /> hiện hàm lượng thấp là nhược điểm của các <br /> nấm   men  .   Trong   nghiên   cứu   này   chúng   tôi <br /> chủng sinh bacteriocin tự  nhiên, do đó nhiều <br /> tiến hành thiết kế  tạo dòng tế  bào nấm men <br /> nghiên   cứu   đã   hướng   đến   biểu   hiện <br /> Saccharomyces cerevisiae tái tổ  hợp dung hợp <br /> bacteriocin  tái   tổ   hợp   trong  các  hệ   thống  tế <br /> gen   bacteriocin   với   α­agglutinin   nhằm   biểu <br /> bào   chủ   khác   nhau   như  Escherichia   coli,  <br /> hiện Reutericin trên bề mặt tế bào nấm men. <br /> Saccharomyces cerevisiae, LAB . <br /> Nấm men  Saccharomyces cerevisiae  được  VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, <br /> nước   uống   và   được   công   nhận   là   an   toàn  Chủng vi sinh vật và plasmid<br /> <br /> <br /> <br /> 196<br />  Chủng  Escherichia   coli  DH5α   [F­,  bằng phương pháp SDS kiềm, sau đó kiểm tra <br /> θ80lacZ∆M15, recA1, endA1, hsdR17 (rk­, mk+),  plasmid   tái   tổ   hợp   bằng   phản   ứng   cắt   với  <br /> phoA,  supE44,   λ­,  thi­1,  gyrA96,   relA1]  enzyme BglII và XhoI và kiểm tra sự hiện diện <br /> (Takara, Nhật) dùng làm tế  bào chủ  để  nhân  của  trình tự  gen trên palsmid bằng PCR với  <br /> bản plasmid. Chủng Saccharomyces cerevisiae  cặp mồi BglII­Rt và XhoI­Rt.<br /> W303 [MATa/MATα  {leu2­3,112 trp1­1 can1­   Chương trình PCR thu nhận và kiểm tra <br /> 100 ura3­1 ade2­1 his3­11,15}] dùng để  biểu  gen  reutericin: 1 chu kỳ: 95oC­5 phút; 30 chu <br /> hiện protein dung hợp lên bề mặt. kỳ: 94oC­45 giây, 55oC­30giây, 72oC­30 giây; 1 <br /> Vector pICAS­1 (PTN. Công nghệ sinh học  chu kỳ  72oC­10 phút. Sản phẩm PCR sau đó <br /> phân tử, Trường Đại học Khoa học tự  nhiên,   được  kiểm tra bằng điện di trên gel agarose <br /> ĐHQG­HCM) được thiết kế  để  làm vector tái  1%.<br /> tổ   hợp   mang   gen  reutericin,  có   kích   thước <br /> 6457bp,  mang  gen  kháng ampicilin  giúp  sàng  Tạo dòng tế  bào nấm men  Saccharomyces  <br /> lọc dòng tế  bào vi khuẩn mang vector, chứa   cerevisiae  W303   mang   vector   tái   tổ   hợp <br /> promoter   GADPH   kiểm   soát   biểu   hiện   bởi  pICAS­reutericin<br /> glucose,   trình   tự   tiết   SSS   (secrection   signal  Vector   pICAS­reutericin  được   biến   nạp <br /> sequence) giúp protein chuyển vị qua màng để  vào tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae <br /> gắn lên vách tế bào. W303 bằng  phương  pháp lithium  acetate  cải <br /> Gen mã hoá cho Reutericin được thiết kế  biên (Gietz and Schiestl, 2007) [6]. Sản phẩm <br /> dựa   trên   trình   tự   gen   tại   ngân   hàng   peptide  biến   nạp   được   sàng   lọc   trên   môi   trường <br /> kháng   khuẩn   (http://bactibase.pfba­lab­ khuyết dưỡng tryptophan (SD­  : leucin 30mg, <br /> tun.org/BAC168), mã số BAC 168 . Histidin   20mg,   Adenin   20mg,   Uracin   20mg, <br /> Yeast   nitrogen   base   6,7g,   Glucose   20g,   nước  <br /> Cấu trúc vector tái tổ hợp pICAS­reutericin<br /> cất đủ 1lit). Các khuẩn lạc mọc được trên môi  <br /> Vector   pICAS­1   được   tách   chiết   bằng  trường   khuyết   dưỡng   tiến   hành   tách   chiết <br /> phương   pháp   SDS  (Sodium   dodecyl   sulfat)  genome (Rose et al., 1990) [9] và PCR kiểm tra <br /> kiềm (Birnboim & Doly, 1979) [2] từ  dòng tế  với cặp mồi BglII­Rt và XhoI­Rt đặc hiệu cho  <br /> bào  Escherichia coli  DH5α/pICAS­1 và được  gen reutericin.<br /> cắt   mở   vòng  bằng  hai   enzyme  cắt   giới   hạn <br /> Vì Reutericin được thiết kế gắn them đuôi <br /> BglII   và  XhoI.   Song   theo   đó,   gen  reutericin <br /> dung   hợp   histinde   cho   mục   đích   nhận   diện <br /> được   đặt   tổng   hợp   được   khuếch   đại   bằng <br /> protein   nên   trên   bề   mặt   tế   bào   nên,   tế   bào <br /> phản  ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen <br /> Saccharomyces   cerevisiae  W303   mang   vector <br /> BglII­Rt   (GGA   AGA   TCT   CCA   TTT   ATT <br /> tái   tổ   hợp   pICAS­reutericin   (Saccharomyces  <br /> GGA TTG CTG ATC) và XhoI­Rt (CCG CTC <br /> cerevisiae  W303:reutericin)  được kiểm tra sự <br /> GAG CGG AGC AGC AGT AGC ACC CAA <br /> biểu hiện Reutericin trên bề  mặt tế  bào bằng  <br /> AG).   Sản   phẩm   cắt   được   điện   di   trên   gel <br /> nhuộm   miễn   dịch   huỳnh   quang   (Tang  et   al., <br /> agarose 1% để kiểm tra.<br /> 2008) [11] với kháng thể  kháng poly­Histidine <br /> Sản phẩm cắt được tinh chế  qua cột EZ­ (GE   Healthcare,   Việt   Nam)   (1:1000)   trong   1  <br /> 10 (Biobasic, Cannada)  và   nối bằng enzyme  giờ ở 25oC, sau đó ủ với kháng thể bậc hai có  <br /> T4 ligase, sau  đó được hóa biến nạp vào tế  gắn   chất   phát   huỳnh   quang   Alexa   488 <br /> bào  Escherichia coli  DH5α  và được sàng lọc  (Invitrogen, Nhật Bản) (1:400) trong 2 giờ   ở <br /> trên   môi   trường   LB  agar  (trypton   1%,   NaCl  25oC. Xem kết quả  dưới kính hiển vi huỳnh <br /> 1%, cao nấm men 0.5%) có chứa kháng sinh  quang Olympus BX41 (Olympus, Hoa Kỳ).<br /> ampicilin  nồng  độ  100  µg/ml.  Thể  biến  nạp <br /> được kiểm tra bằng phản ứng PCR khuẩn lạc   KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN <br /> với   cặp   mồi  BglII­Rt   và   XhoI­Rt.   Bên  cạnh <br /> đó, các khuẩn lạc còn được tách chiết plasmid <br /> <br /> 197<br /> Tối  ưu và thiết kế  dung hợp gen mã hoá  mặt   tế   bào   nấm   men   Saccharomyces  <br /> Reutericin trong biểu hiện protein trên bề  cerevisiae,  và   peptide   tín   hiệu   neo   GPI <br /> mặt tế bào nấm men (glycosyl­phosphatidyl ­ inositol) giúp phân tử <br /> protein  cố   định  trên  màng (hình 1a).  Sau khi <br /> Trong   chiến   lược   biểu   hiện   và   gắn <br /> được sinh tổng hợp trên lưới nội chất nhám,  <br /> Reutericin   trên   bề   mặt   tế   bào   nấm   men, <br /> toàn bộ dung hợp protein này được điều khiển <br /> peptide này được dung hợp với đoạn peptide <br /> tiết ra bề mặt tế bào nấm nhờ hoạt động của <br /> đầu  C   của  α­agglutinin,   một   protein  trên  bề <br /> peptide tín hiệu tiết (SSS) (hình 1b).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình   1.   Chiến   lược   biểu   hiện <br /> trên   bề   mặt   tế   bào   nấm   men <br /> Saccharomyces cerevisiae<br /> <br /> (a):   Cấu   trúc   gen   dung   hợp <br /> protein;<br /> (b)   Con   đường   tiết   protein   ra <br /> ngoài màng tế bào nấm men<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình   2.  Tối   ưu   gen   biểu   hiện <br /> Reutericin   trên   bề   mặt   tế   bào <br /> nấm men S. cerevisiae<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Reutericin   là   peptide   có   nguồn   gốc   từ   vi  tích độ tương thích với bảng mã di truyền của <br /> khuẩn  Lactobacillus reuteri, do vậy, khi phân  nấm men  Saccharomyces cerevisiae  chúng tôi <br /> <br /> <br /> 198<br /> nhận thấy 13/57 codon có độ  tương thích nhỏ  di truyền của  hệ  thống tế  bào chủ  nấm <br /> hơn   50%   và   19/57   codon   có   độ   tương   thích  men. <br /> nhỏ hơn 70% (hình 2a). Kết quả phân tích này  Cấu trúc vector tái tổ hợp pICAS­ reutericin <br /> đưa đến nhận định là rất có thể  gen mã hoá <br /> biểu   hiện   trên   bề   mặt   tế   bào   nấm   men <br /> cho  reutericin  từ  Lactobacillus   reuteri    khó <br /> Saccharomyces cerevisiae  <br /> được nhận diện và biẻu hiện trong nấm men  <br /> Saccaromyces cerevisiae . Vector  pICAS­1  có  kích thước   6457bp,  có <br /> Nhằm tối  ưu gen mã hoá cho peptide này  dùng trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới <br /> trong hệ thống tế bào chủ nấm men, chúng tôi  hạn trong vùng MCS (multiple cloning site) (hình <br /> sử  dụng phần mềm thiết kế  gen Snap Gene   3a) và được thu nhận (hình 3b, giếng 4). Song <br /> 2.6.2 với bộ  thông số  về  codon mã hoá của  song theo đó, vector pICAS­1 được cắt bằng hai <br /> nấm   men  S.   cerevisiae  để   chuyển   đổi   các  enzyme cắt giới hạn BglII và XhoI cho một vạch <br /> codon khó nhận diện và các codon không dịch  có kích thước khoảng 6445bp trên bản điện di  <br /> mã   trên   gen  reutericin  của  Lactobacillus   (hình 3b, giếng 5) và đoạn oligonucletotide có <br /> reuteri thành các codon dịch mã cho cùng acid   chiều dài 12bp (không phát hiện trên bản điện <br /> amin của nấm men. Kết quả phân tích trình tự  di), kích thước   này gần bằng kích thước của <br /> gen trên hình 2b cho thấy, sau khi tối  ưu của   vector pICAS­1 sau khi mở vòng (6457bp). Theo <br /> gen mã hoá cho Reutericin có độ  tương thích  đó, gen  reutericin  được  PCR và cắt  bằng hai <br /> 100% với bảng mã enzyme  BglII và  XhoI, cũng cho một vạch có <br /> kích thước khoảng 200bp như đã thiết kế (hình <br /> 3b, giếng 3). <br /> Gen  reutericin  sau   khi   cắt   được   nối   vào <br /> vector pICAS­1, sản phẩm nối được biến nạp <br /> vào Escherichia coli DH5α, các khuẩn lạc mọc <br /> được trên môi trường LB agar ampicilin tiến  <br /> hành kiểm tra  bằng PCR. Kết  quả  kiểm  tra  <br /> cho thấy một số  khuẩn lạc  E. coli  mang gen <br /> mục tiêu (hình 3c, giếng 4, giếng 6, giếng 8).  <br /> Các   khuẩn   lạc   này  tiếp   tục   được   hoạt   hóa, <br /> tách chiết plasmid và PCR với cặp mồi BglII­<br /> Rt và XhoI­Rt đặc hiệu cho gen reutericin. Kết <br /> quả  điện di cho thấy chúng tôi đã thu được <br /> plasmid tái tổ  hợp mang gen  reutericin  (hình <br /> 3d, giếng 4­6). Gen reutericin  trên các plasmid <br /> tái tổ  hợp được giải trình tự  và kiểm tra sự <br /> đồng khung dịch mã.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 199<br />  Hình 3. Cấu trúc vector tái tổ hợp <br /> pICAS­reutericin<br /> (a):   Cấu   trúc   vector   pICAS­1;   (b):  Thu <br /> nhận gen  reutericin và plasmid pICAS­1. <br /> 1. Thang DNA 1kbp; 2. Chứng âm phản <br /> ứng PCR; 3. Sản phẩm PCR gen sau khi  <br /> cắt; 4. Plasmid tách bằng   phương pháp <br /> SDS   kiềm;   5.   Plasmid   sau   khi   cắt;   (c):  <br /> PCR   khuẩn   lạc  E.coli  DH5α/pICAS­<br /> reutericin. 1. Thang DNA 1kbp; 2. Chứng  <br /> dương phản ứng PCR; 3. Chứng âm phản <br /> ứng PCR; 4­8. Sản phẩm PCR khuẩn lạc  <br /> E.coli DH5α  khác nhau; (d): PCR plasmid <br /> tái tổ  hợp  E.coli  DH5α/pICAS­reutericin. <br /> 1.   Thang   DNA   1kbp;   2.   Chứng   dương  <br /> phản  ứng PCR; 3. Chứng  âm phản  ứng <br /> PCR; 4­6. Sản phẩm PCR plasmid   khác <br /> nhau.<br /> <br /> Tạo dòng tế  bào nấm men  Saccharomyces   năng mã hóa tryptophan và phát triển trên môi <br /> cerevisiae  W303   mang   vector   tái   tổ   hợp  trường   SD­  (hình   4b).   Kết   quả   kiểm   tra   sự <br /> pICAS­reutericin.  hiện diện của gen  reutericin  trên bộ  gen của <br /> nấm men tái tổ  hợp cũng cho thấy các chủng <br /> Vector   tái   tổ   hợp   pICAS­reutericin <br /> nấm   men  này  mang  dung  hợp   gen   mục   tiêu <br /> được biến nạp vào nấm men   Saccharomyces  <br /> (hình 4c,  giếng 5). Bên cạnh đó,  khi  nhuộm  <br /> cerevisiae  W303.   Các   dòng   nấm   men   mang <br /> miễn dịch huỳnh quang với kháng thể  kháng <br /> vector tái tổ  hợp mang dung hợp gen  pICAS­<br /> poly­Histidin trên màng tế  bào Saccharomyces  <br /> reutericin được chọn lọc dựa trên sự phát triển <br /> cerevisiae  W303:  reutericin  cho   tính   hiệu <br /> của chúng trên môi trường SD khuyết dưỡng <br /> huỳnh quang trên màng  ở  pha tối (chiếu ánh <br /> tryptophan   (SD­)   (hình   4a).  Saccharomyces  <br /> sáng  huỳnh  quang  bước   sóng   488   nm)   trong <br /> cerevisiae  W303   đột   biến   gen   tổng   hợp <br /> khi   dòng   tế   bào   đối   chứng  Saccharomyces  <br /> tryptophan,   không   phát   triển   được   trên   môi <br /> cerevisiae W303 không cho tính hiệu này (hình <br /> trường   SD­.   Tuy   nhiên,   khi   chủng   chủ   chủ <br /> 4d). Kết quả  này đã khẳng định Reutericin có <br /> nấm   men   tiếp   nhận   dung   hợp   gen   cấu   trúc <br /> thể  biểu hiện được trên bề  mặt tế  bào nấm <br /> vector   pICAS­reutericin  sẽ   trở   nên   có   khả <br /> men.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 200<br />  Hình 4. Sàng lọc dòng tế bào nấm men mang vector tái tổ hợp pICAS­reutericin<br /> (a): Nguyên tắc sàng lọc trên môi trường khuyết dưỡng; (b): Kết quả  biến nạp vector pICAS­ reutericin <br /> vào tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae W303; (c): Kiểm tra sự hiện diện của dung hợp gen trong  <br /> tế bào nấm men. 1. Thang DNA 100bp; 2. Dung hợp gen; 3. Kết quả phản  ứng PCR với khuôn là DNA bộ <br /> gen của nấm men; 4­9. Kết quả phản ứng PCR với khuôn là DNA bộ gen từ các khuẩn lạc nấm men tái tổ <br /> hợp sàng lọc được trên môi trường SD­; (d): Kiểm tra biểu hiện gen reutericin trên bề  mặt tế  bào bằng <br /> nhuộm miễn dịch huỳnh quang với kháng thể  kháng poly­Histidin. Pha sáng là ánh sáng trắng và pha tối  <br /> ánh sáng huỳnh quang bước sóng 488 nm.<br /> <br /> KẾT LUẬN dòng   tế   bào   nấm   men  Saccharomyces  <br /> cerevisiae  W303   mang   vector   pICAS­<br /> Chúng tôi đã cấu trúc thành công vector tái <br /> reutericin.   Dòng   nấm   men  tái   tổ   hợp  này  là <br /> tổ   hợp   pICAS­reutericin  nhằm   biểu   hiện <br /> nguyên liệu cơ  bản trong các nghiên cứu sâu <br /> Reutericin   dung   hợp   3’α­agglutinin   trên   bề <br /> hơn về  con  đường biểu hiện tiết  Reutericin  <br /> mặt   tế   bào   nấm   men  Saccharomyces  <br /> trên bề mặt tế bào.<br /> cerevisiae. Đồng thời bước đầu sàng lọc được  TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> <br /> ESTABLISHMENT OF Saccharomyces cerevisiae  BEARING FUSION GENE <br /> FOR REUTERICIN EXPRESSION ON CELL SURFACE<br /> <br /> <br /> 201<br />  Nguyen Hieu Nghia, Nguyen Tri Nhan, Dang Thi Phuong Thao<br /> University of Science, VNU, Ho Chi Minh city<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Reutericin is group IIc bacteriocin, heat­labile bacteriocin which is produced by  Lactobacillus reuteri <br /> LA6   and   applied   in   many   food   industries.   The   seminarians   bacteriocin   derived   naturally   in   low   levels.  <br /> Therefore, several different researches have been carried out in order to increase Reutericin expression level <br /> by   recombinant   techniques.   One   among   of   many   host   cells   for   recombinant   protein   expression, <br /> Saccharomyces cerevisiae has been used as a useful host cell which has high nutritional value, applicable in <br /> food   industry   and   probiotic.   Here,   we   show   a   new   strategy   in   which   we   aim   to   express   Reutericin   on <br /> Saccharomyces   cerevisiae  cell   surface   towards   developing   probiotic   for   animal   and   seafood   farming. <br /> Reutericin gene was fused to α­agglutinin, coding for α­Agglutinin on yeast cell surface. The recombinant <br /> Saccharomyces cerevisiae W303 bearing reutericin­  α­agglutinin fusion gene owns the growing capacity on <br /> minus   tryptophan   medium.   Data   of   observation   under   fluorescent   microscopy   also   demonstrate   that   the <br /> recombinant yeast bearing Reutericin on its cell surface.  Taken together, our data strongly showed that we <br /> success on construction a line of Saccharomyces cerevisiae W303:  reutericin which bears Reutericin on its <br /> cell surface.<br /> Keywords: agglutinin, bacteriocin, cell surface, reutericin, yeast.  <br /> <br /> Ngày nhận bài 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 202<br />