Tạo plasmid RNAi tương ứng với gen M2L1 (ID 149958) thuộc họ gen myosin II ở nấm Mucor circinelloides

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mucormycosis là một bệnh nhiễm trùng gây ra bởi nhiều loài nấm thuộc bộ Mucorales. Nấm Mucor circinelloides là một loài vi nấm mô hình được sử dụng cho nghiên cứu về bệnh mucormycosis. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định các đặc điểm kiểu hình của nấm gây bệnh, nhất là tính lưỡng hình, có thể sử dụng làm chỉ thị để đánh giá khả năng gây bệnh của chúng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tạo plasmid RNAi tương ứng với gen M2L1 (ID 149958) thuộc họ gen myosin II ở nấm Mucor circinelloides

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.000111 TẠO PLASMID RNAi TƯƠNG ỨNG VỚI GEN m2l1 (ID 149958) THUỘC HỌ GEN MYOSIN II Ở NẤM Mucor circinelloides Lê Ngọc Mai1, Nguyễn Thu Hà1, Nguyễn Văn Hân1,2, Nguyễn Duy Khánh1,3, Triệu Anh Trung1* Tóm tắt: Mucormycosis là một bệnh nhiễm trùng gây ra bởi nhiều loài nấm thuộc bộ Mucorales. Nấm Mucor circinelloides là một loài vi nấm mô hình được sử dụng cho nghiên cứu về bệnh mucormycosis. Nhiều nghiên cứu đã khẳng định các đặc điểm kiểu hình của nấm gây bệnh, nhất là tính lưỡng hình, có thể sử dụng làm chỉ thị để đánh giá khả năng gây bệnh của chúng. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chứng minh gen mã hóa protein myosin V (ID 51513) liên quan đến kiểu hình và khả năng gây bệnh của nấm Mucor. Từ đó chúng tôi đã phát hiện ra ba họ gen myosin I, II và V trong hệ gen của loài nấm này, các protein trong mỗi họ gen đều có các đặc điểm cấu trúc đặc trưng tương ứng. Để sàng lọc các gen ứng viên thuộc họ myosin II có khả năng liên quan đến kiểu hình và cơ chế gây bệnh của nấm Mucor, chúng tôi sử dụng kỹ thuật RNAi. Một đoạn gen của gen đích m2l1 (ID 149958) đã được phân lập và nhân dòng vào vector plasmid pMAT1812 có chứa hai promoter ngược chiều nhau để tạo plasmid RNAi. Plasmid tái tổ hợp này đã được kiểm tra bằng cách sử dụng các enzyme giới hạn và kỹ thuật giải trình tự gen. Từ khóa: Mucor circinelloides, mucormycosis, myosin, RNAi. 1. MỞ ĐẦU Mucormycosis là một loại bệnh nhiễm trùng cơ hội ở người được gây ra bởi nấm thuộc bộ Mucorales, đây là một loại bệnh hiếm gặp nhưng khả năng tử vong cao, đặc biệt đối với những người bị suy giảm miễn dịch, HIV/ AIDS, tiểu đường hay cấy ghép nội tạng (Brown, 2005; Challa, 2019). Mucormycosis là một trong những bệnh nấm sâu khó điều trị, do bệnh đáp ứng kém với các loại thuốc trị nấm thông thường và chúng ta chưa có các liệu pháp điều trị hiệu quả. Nguyên nhân chủ yếu là do những hiểu biết về cơ chế gây bệnh còn hạn chế. Do đó, những nghiên cứu về cơ chế phân tử của bệnh có ý nghĩa trong việc tạo cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng tạo các liệu pháp điều trị hiệu quả hơn (Lopez-Fernandez et al., 2018). Nấm Mucor circinelloides là một trong số các tác nhân gây bệnh mucormycosis có thể được tìm thấy ngay trong đất cũng như trong rác hữu cơ. Loài nấm này đã và đang được sử dụng làm mô hình cho nhiều nghiên cứu khác nhau, bao gồm cơ chế phân tử của RNAi đã được nghiên cứu kỹ lưỡng (Nicolás et al., 2003), sinh tổng hợp carotene (Torres- Martínez et al., 2012), sinh tổng hợp lipid (Andrade et al., 2014) và mucormycosis (Lee et 1Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2Trường THPT Tuệ Tĩnh, Cẩm Giàng, Hải Dương 3Trường THPT chuyên Hùng Vương, Việt Trì, Phú Thọ *Email: trungta@hnue.edu.vn
896 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM al., 2013). Đặc tính này của nấm M. circinelloides có được là do nó có khả năng sinh trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, dễ thao tác, hệ gen của nấm đã được giải mã và công bố và nó có thể áp dụng được nhiều kĩ thuật sinh học phân tử khác nhau, đặc biệt là kỹ thuật biến nạp gen và các thao tác trên hệ gen. Tính lưỡng hình của nấm là một quá trình trong đó chúng có thể phát triển thành dạng sợi nấm hoặc giống như nấm men, tùy thuộc vào điều kiện môi trường. Sự chuyển tiếp nấm men-dạng sợi này góp phần vào độc lực của nấm. M. circinelloides cũng là một loại nấm lưỡng hình phát triển thành hệ sợi điển hình trong điều kiện hiếu khí và là dạng nấm men trong điều kiện yếm khí/CO2 cao. Sự chuyển đổi giữa hai dạng ở loài nấm này đã được chứng minh là có liên quan đến độc lực của nó, vì pha nấm men không gây bệnh (Lee et al., 2013). Ngoài ra, kích thước của bào tử cũng liên quan đến độc lực của M. circinelloides, trong đó chỉ có các chủng tạo ra bào tử đa nhân lớn mới có khả năng gây bệnh (Li et al., 2011). Những kết quả này cho thấy rằng tính lưỡng hình và các đặc điểm kiểu hình khác có thể được sử dụng làm chỉ thị để đánh giá sơ bộ về độc lực của loài nấm này. Ở nấm M. circinelloides, một protein thuộc họ Myosin V, Mcmyo5 (ID 51513) đã được chứng minh đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của loài nấm này (Trieu et al., 2017). Từ đó chúng tôi đã mở rộng tìm kiếm các protein có trình tự axitt amino tương tự Mcmyo5 và đã phát hiện ra có 3 họ gen Myosin I, Myosin II và Myosin V trong hệ gen của loài nấm này. Các họ protein này có các đặc điểm cấu trúc đặc trưng tương tự như họ protein tương ứng ở các loài khác. Những thông tin này gợi ý rằng các họ protein nói trên cũng tham gia vào cơ chế gây bệnh của nấm Mucor. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu thực nghiệm nào chứng minh nhận định này. Họ protein Myosin II ở loài nấm M. circinelloides có hai gen ID 149958 và ID 136314, chúng tôi đặt tên lần lượt là m2l1 và m2l2. Trong bài báo này, chúng tôi tiến hành thiết kế và xây dựng plasmid RNAi tương ứng với gen m2l1 mã hóa protein ID 149958 thuộc họ Myosin II. Plasmid này sẽ được sử dụng để gây ức chế biểu hiện của gen tương ứng nhằm phục vụ cho nghiên cứu chức năng của gen. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Chủng nấm M. circinelloides R7B (leuA- pyrG+) được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu tại Bộ môn Di truyền học và Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Đại học Murcia, Tây Ban Nha. Tế bào khả biến của chủng vi khuẩn E. coli DH5α được sử dụng để nhân dòng các plasmid tái tổ hợp. Plasmid pMAT1812 có kích thước 9,5 kb với 2 promoter ngược chiều nhau ở 2 phía của vùng MCS giúp phiên mã đoạn gen được nhân dòng tạo thành các đoạn dsRNA. Ngoài ra trên plasmid còn có một đoạn gen carB có kích thước 0,5 kb ở giữa 2 promoter, gen này được sử dụng làm gen báo cáo cho việc câm lặng gen. Gen carB tham gia vào việc sản xuất carotene ở nấm M. circinelloides. Khi biến nạp plasmid vào nấm sẽ tạo ra
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 897 các thể bạch tạng trong điều kiện có ánh sáng, là một dấu hiệu cho thấy plasmid được biểu hiện bình thường (Hình 1A). Hình 1. Cấu trúc, kích thước, vị trí các mồi và các enzyme giới hạn của vector pMAT1812 (A), đoạn gen đích m2l1 (B). 2.2. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA hệ gen và plasmid DNA hệ gen từ chủng R7B đã được tách chiết bằng cách sử dụng Bộ kit i-genomic BYF DNA Extraction Mini Kit, Mã số: 17361 (Intron, Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các plasmid từ các chủng E. coli đã được tách chiết và tinh sạch bằng cách sử dụng DNA-spin Plasmid DNA Purification Kit (Intron; Cat.No 17096) theo hướng dẫn của nhà cung cấp. PCR và điện di PCR đoạn gen 2 kb thuộc gen đích m2l1 theo chương trình: 95 oC (5 phút); 35 chu kì (94 oC - 20 giây, 58 oC - 30 giây, 72 oC - 2 phút 15 giây); kết thúc: 72 oC (10 phút). Cặp mồi được thiết kế có 2 trình tự nhận biết của enzyme XhoI (Hình 1B). Trình tự cặp mồi đã sử dụng trong nghiên cứu để nhân đoạn gen kích thước 2 kb của gen đích m2l1, gồm: M2F-SL1: TTCTCGAGCCTCGTTGACAGCATCACCACA, và M2R-SL1: TTCTCGAGGCTTCCTCTGGGTGCAACACA (đoạn gạch chân là trình tự nhận biết của XhoI). Tất cả các sản phẩm DNA đều được tinh sạch bằng bộ kit MEGAquick-spin plus Fragment DNA Purification Kit (Intron; Cat. No 17289). Các đoạn DNA được kiểm tra kích thước bằng điện di trên gel agarose 1% và quan sát dưới tia UV. Tách dòng di truyền Sản phẩm PCR được xử lí tạo đầu dính bằng enzyme XhoI (Thermo Scienctific), plasmid pMAT 1812 cũng được cắt mở vòng bằng enzyme XhoI. Hai sản phẩm cắt sau khi tinh sạch sẽ được nối với nhau bằng enzyme DNA T4 ligase (Thermo Sciencetific) theo công thức sau: 50 ng vector đã mở vòng, 30 ng DNA đoạn gen, 1 µL 10X T4 DNA ligase buffer, 1U T4 DNA ligase và thêm H2O cho đạt 10 µL. Hỗn hợp được ủ 15’ ở nhiệt độ phòng, sử dụng 5µL hỗn hợp để biến nạp cho 50µL tế bào khả biến. Tế bào E. coli khả biến được chuẩn bị bằng MgCl2 và
898 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM CaCl2 lạnh (Froger & Hall 2007). Plasmid được biến nạp vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42 oC trong 45 giây. Huyền phù tế bào sau biến nạp được nuôi trên môi trường LB agar (Peptone: 10 g/L; NaCl: 10 g/L; Yeast Extract: 5 g/L; Agar: 20 g/L) bổ sung ampicillin 100 µg/mL (LBA), ủ ở 37 oC trong 14-16 h. Sàng lọc plasmid tái tổ hợp Các khuẩn lạc E. coli DH5α mọc trên môi trường LBA sẽ được kiểm tra bằng kỹ thuật colony PCR sử dụng cặp mồi peuka1 (5’-CATGAAGTGTGAGACATTGCG-3’) và PU (5’-GTTGTAAAACGACGGCCAGT-3’) định vị trên vector pMAT1812. Các khuẩn lạc có và không có đoạn gen đích được nhân dòng sẽ lần lượt cho sản phẩm PCR có kích thước 2 kb và 4 kb (Hình 1A và 4B). Plasmid tiềm năng sẽ được kiểm tra bằng enzyme giới hạn và giải trình tự gen. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA và kết quả PCR DNA tổng số được tách chiết từ chủng R7B sử dụng i-genomic BYF DNA Extraction Mini Kit (Intron) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kết quả thu được lượng DNA tổng số có chất lượng tốt cho các phản ứng PCR. DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra bằng máy quang phổ UV-VIS NanoVue Plus (GE Healthcare), nồng độ thu được khoảng 400 ng/µL, tỉ lệ bước sóng 260 nm/280 nm khoảng 1,8-2,0. Các sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% và được tinh sạch sử dụng DNA Purification Kit (Hình 2). Các kết quả phân tích định tính và định lượng sản phẩm tách chiết DNA và PCR cho thấy các bộ kit đang sử dụng đều cho sản phẩm chất lượng đủ tốt để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Hình 2. Kết quả PCR đoạn gen 2 kb từ DNA hệ gen của chủng nấm R7B. M: Thang DNA chuẩn Marker SizerTM-1000 DNA Marker (Intron, Cat.No 24074. 3.2. Kết quả biến nạp gen Đoạn cắt giới hạn XhoI 2,0 kb thu được từ sản phẩm PCR được gắn vào vector pMAT1812 vớitỉ lệ insert/vector ~ 4/1 sử dụng T4 DNA ligase. Hỗn hợp nối được biến nạp và tế bào khả biến chủng E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Kết quả là, chúng tôi đã thu được gần 45 khuẩn lạc trên môi trường LB bổ sung ampicillin. Tỉ lệ gắn đoạn gen vào vector thành công khoảng 10%, dựa trên kết quảtỉ lệ colony PCR dương tính (Hình 3).
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 899 3.3. Kết quả colony PCR Phương pháp colony PCR được chúng tôi áp dụng để sàng lọc nhanh các khuẩn lạc tiềm năng có khả năng mang plasmid tái tổ hợp mong đợi. Kết quả PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Sản phẩm colony PCR thu được các đoạn gen có kích thước 2 kb hoặc 4 kb tương ứng với khuẩn lạc có chứa plasmid rỗng và plasmid có chứa đoạn gen chuyển. Kết quả colony PCR thu được 2 mẫu tiềm năng là mẫu số 9 và 18 (Hình 3). Plasmid số 9 và 18 được đặt tên lần lượt là pAT53 và pAT54. Hình 3. Kết quả colony PCR. M: Thang DNA chuẩn Marker SizerTM-1000 DNA Marker (Intron, Cat.No 24074). Giếng 1 đến 20 là 20 khuẩn lạc được chọn ngẫu nhiên cho phản ứng 3.4. Kết quả kiểm tra plasmid RNAi bằng enzyme giới hạn Hai plasmid pAT53 và pAT54 thu được từ phản ứng colony PCR (Hình 3) được tách chiết và kiểm tra kích thước và cấu trúc bằng các enzyme giới hạn. Cả hai plasmid đều được kiểm tra bằng cách cắt bằng hai enzyme khác nhau, gồm XhoI và PstI (Hình 4). Hình 4. Kết quả kiểm tra plasmid bằng các enzyme giới hạn. M: Thang DNA chuẩn Marker SizerTM-1000 DNA Marker (Intron, Cat.No 24074). (a): plasmid pAT53 và pAT54 được kiểm tra bằng enzyme XhoI (ký hiệu X) và PstI (ký hiệu P). (b): Sơ đồ của plasmid RNAi tái tổ hợp với các vị trí của enzyme giới hạn Theo lí thuyết, đối với plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen m2l1 khi cắt bằng enzyme XhoI thu được 2 băng có kích thước 9,5 kb và 2 kb. Khi cắt bằng enzyme PstI thu được 3 băng có kích thước lần lượt là 6,1kb; 4,4 kb; kb hoặc 2,6 kb; 4,4 kb; 4,5 kb tùy theo chiều hướng của đoạn gen đích được chèn vào vector.
900 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn trên gel agarose đã chứng minh rằng cả 2 plasmid pAT53 và pAT54 đều là các plasmid tái tổ hợp mong đợi. Cả 2 plasmid pAT53 và pAT54 khi cắt kiểm tra bằng enzyme XhoI đều thu được 2 băng có kích thước 9,5 kb và 2 kb. Plasmid pAT53 khi kiểm tra bằng enzyme PstI thu được 3 băng có kích thước là 6,1 kb; 4,4 kb; 1kb. Trong khi đó plasmid pAT54 khi kiểm tra bằng enzyme PstI thu được 3 băng có kích thước là 2,6 kb; 4,4 kb; 4,5 kb. Băng 4,4 kb và 4,5 kb gần nhau đến mức rất khó để phân biệt trên bản gel agarose, tuy nhiên băng còn lại đúng kích thước dự kiến. Kết quả tách dòng di truyền đã được khẳng định lại thông qua việc giải trình tự gen. Như vậy, các plasmid này đều có chứa đoạn gen đích, mặc dù có sự đảo chiều, nhưng đều có thể sử dụng được cho mục đích gây ức chế biểu hiện của gen đích sau này. Kết quả phân tích 2 plasmid pAT53 và pAT54 thu được bằng enzyme giới hạn cho thấy phương pháp colony PCR đã cho kết quả đáng tin cậy. Phương pháp colony PCR nên được áp dụng để sàng lọc các plasmid tái tổ hợp tiềm năng một cách nhanh chóng và tiết kiệm. 3.5. Kết quả giải trình tự gen Để khẳng định kết quả tách dòng di truyền thành công, chúng tôi đã giải trình tự cả hai plasmid pAT53 và pAT54 sử dụng mồi M2F-SL1. Các trình tự thu được và đoạn DNA từ cơ sở dữ liệu gen nấm M. circinelloides được so sánh với nhau bằng cách sử dụng công cụ ClustalW (GenomeNet, Japan, https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw). Kết quả là, các đoạn chèn trong plasmid pAT53 và pAT54 đều có trình tự trùng khớp với trình tự đoạn DNA gốc (Hình 5). Hình 5. Một phần kết quả so sánh trình tự DNA hệ gen của M. circinelloides với trình tự các đoạn chèn của plasmid pAT53 và pAT54 sử dụng đoạn mồi M2F-SL1. Những vị trí đánh dấu * và dấu . tương ứng với các vị trí trùng khớp và có sự khác biệt giữa các trình tự. Kết quả cũng chỉ ra ở một vài vị trí nucleotide có sự khác biệt giữa trình tự DNA trong cơ sở dữ liệu với trình tự của một hoặc hai plasmid. Tuy nhiên, sự khác biệt này có
PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 901 thể do tín hiệu giải trình tự bị lỗi ở hai đầu của gen, hoặc có thể có lỗi xảy ra trong quá trình PCR làm xuất hiện đột biến điểm. Những sự sai khác ở một vài nucleotide này đều không gây ảnh hưởng đáng kể đến kết quả gây ức chế biểu hiện của gen đích sau này. Do đó, hai plasmid pAT53 và pAT54 đều có thể được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 4. KẾT LUẬN Các kết quả nghiên cứu trên đã khẳng định rằng chúng tôi đã thu được hai plasmid tái tổ hợp đạt yêu cầu là pAT53 và pAT54. Các plasmid này đã nhân dòng thành công đoạn gen 2 kb của gen đích m2l1 (ID 149958) vào vector pMAT1812. Các plasmid RNAi này có thể được sử dụng để biến nạp vào chủng nấm kiểu dại R7B để nghiên cứu vai trò của gen m2l1 (ID 149958) ở loài nấm M. circinelloides. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ kinh phí của Bộ Giáo dục và Đào tạo theo đề tài mã số B2019-SPH-562-12. TÀI LIỆU THAM KHẢO Andrade, Grazielle S. S., Ana K. F. Carvalho, Cintia M. Romero, Pedro C. Oliveira, and Heizir F. De Castro, 2014. Mucor Circinelloides Whole-Cells as a Biocatalyst for the Production of Ethyl Esters Based on Babassu Oil. Bioprocess and Biosystems Engineering 37: 2539-2548. Brown, J., 2005. Zygomycosis: An Emerging Fungal Infection. Am J Health Syst Pharm 62 (24): 2593-96. Challa, Sundaram., 2019. Mucormycosis: Pathogenesis and Pathology. Current Fungal Infection Reports 13: 11-20. Froger, Alexandrine, and James E. Hall., 2007. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments (6) e253. Lee, Soo Chan, Alicia Li, Silvia Calo, and Joseph Heitman., 2013. Calcineurin Plays Key Roles in the Dimorphic Transition and Virulence of the Human Pathogenic Zygomycete Mucor Circinelloides. PLoS Pathogens 9 (9): 1003625. Li, Charles H., Maria Cervantes, Deborah J. Springer, Teun Boekhout, Rosa M. Ruiz-Vazquez, Santiago R. Torres-Martinez, Joseph Heitman, and Soo Chan Lee., 2011. Sporangiospore Size Dimorphism Is Linked to Virulence of Mucor Circinelloides. PLoS Pathogens 7 (6): 1002086. Lopez-Fernandez L., Sanchis M., Navarro-Rodriguez P., Nicolas F. E., Silva-Franco F., Guarro J., Garre V., Navarro-Mendoza M. I., Perez-Arques C., Capilla J., 2018. Understanding Mucor Circinelloides Pathogenesis by Comparative Genomics and Phenotypical Studies. Virulence 9 (1): 707-20. Nicolás, Francisco E., Santiago Torres-Martínez, and Rosa M. Ruiz-Vázquez., 2003. Two Classes of Small Antisense RNAs in Fungal RNA Silencing Triggered by Non-Integrative Transgenes. EMBO Journal 22 (15): 3983-91. Torres-Martínez, Santiago, Rosa M. Ruiz-Vázquez, Victoriano Garre, Sergio López-García, Eusebio Navarro, and Ana Vila, 2012. Molecular Tools for Carotenogenesis Analysis in the Zygomycete Mucor Circinelloides. Methods in Molecular Biology.
902 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Trieu, T A, M I Navarro-Mendoza, C Perez-Arques, M Sanchis, J Capilla, P Navarro-Rodriguez, L Lopez-Fernandez, et al., 2017. RNAi-Based Functional Genomics Identifies New Virulence Determinants in Mucormycosis. PLoS Pathogens 13 (1): e1006150. GENERATION OF RNAi PLASMID CORRESPONDING TO m2l1 GENE (ID 149958) BELONGING TO MYOSIN CLASS II IN FUNGUS Mucor circinelloides Le Ngoc Mai1, Nguyen Thu Ha1, Nguyen Van Han1 2, Nguyen Duy Khanh1 3, Trieu Anh Trung1,* Abstract: Mucormycosis is an infection caused by many fungal species of the order Mucorales. Mucor circinelloides is an outstanding model fungus used for the study of mucormycosis. Many studies have confirmed the phenotypic characteristics of pathogenic fungi, especially dimorphism, that can be used as indicators to assess their virulence. Our previous study demonstrated that the gene coding for a protein Myosin class V (ID 51513) is related to the phenotype and pathogenicity of Mucor. We also found three families of myosin classes I, II and V in this Mucor genome, the proteins of each gene family have corresponding structural characteristics. To screen for candidate genes of the myosin II family that are related to the morphology and pathogenesis of Mucor fungus, we use RNAi techniques. A gene fragment of the m2l1 target gene (ID 149958) was isolated and cloned into the vector pMAT1812 containing two opposite promoters to produce RNAi plasmids. These recombinant plasmids were tested using restriction enzymes and DNA sequencing techniques. Keywords: Mucor circinelloides, mucormycosis, myosin, RNAi. 1Hanoi National University of Education 2TueTinh high school, Cam Giang, Hai Duong province 3Hung Vuong gifted high school, Viet Tri, Phu Tho province *Email: trungta@hnue.edu.vn