Tạp chí khoa học: Tách dòng cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mô não người Việt Nam

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 4 (2013) 24-28<br /> <br /> Tách dòng cDNA mã hóa cho th th neurokinin-1 t mô não ngư i Vi t Nam<br /> Võ Th Thương Lan1,*, Phan Hà M 1, inh oàn Long1,2<br /> 1<br /> <br /> Phòng thí nghi m tr ng i m Công ngh enzyme-protein, Trư ng i h c Khoa h c t nhiên, 334 Nguy n Trãi, Thanh Xuân, Hà N i, Vi t Nam 2 Khoa Y Dư c, i h c Qu c Gia Hà N i, 144 Xuân Th y, C u Gi y, Hà N i, Vi t Nam<br /> Nh n ngày 08 tháng 8 năm 2013 Ch nh s a ngày 22 tháng 8 năm 2013; ch p nh n ăng ngày 05 tháng 9 năm 2013<br /> <br /> Tóm t t. Th th neurokinin-1 (NK-1R) thu c nhóm các th th xuyên màng liên k t v i G protein (GPCR). NK-1R óng vai trò quy t nh s s ng còn c a các t bào th n kinh, tham gia vào vi c i u hòa các ph n x nôn, các ch c năng v tim m ch, hô h p và i u ch nh các hành vi ph n x . Ái l c liên k t v i ph i t ph thu c vào s a d ng trình t amino acid c a NK-1R. NK1R tái t h p ư c bi u hi n trong h th ng t bào ng v t ư c s d ng sàng l c các ch t i kháng c nh tranh (ch t i v n) v i ph i t trong s n xu t các bi t dư c. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày k t qu phân l p cDNA hoàn ch nh t mô não, trình t nucleotide và trình t amino acid suy di n c a NK-1R c a ngư i Vi t. S sai khác 4 amino acid so v i d li u g c trong Databank không làm nh hư ng n tính xuyên màng c a th th nhưng có th có ái l c liên k t khác nhau v i các lo i ph i t . Do ó, cDNA hoàn ch nh c a ngư i Vi t t o cơ s bi u hi n NK-1R trong t bào ng v t sàng l c dư c li u Vi t Nam. T Khóa: Th th neurokinin-1 (NK-1R), Th th k t c p G-protein (GPCR), Ch t i kháng th th , ngư i Vi t Nam.<br /> <br /> 1. T ng quan∗ Th th neurokinin-1 (NK-1R) thu c nhóm các th th xuyên màng liên k t v i G protein và ư c bi u hi n nhi u nh t não [1]. NK-1R liên k t ch y u v i ch t P ngoài t bào và G protein trong t bào, t ó truy n t i các tín hi u au n và gây áp ng sinh lí cho t bào [2]. NK-1R óng vai trò quy t nh s s ng còn c a các t bào th n kinh, tham gia vào vi c i u<br /> <br /> hòa các ph n x nôn, các ch c năng v tim m ch, hô h p và i u ch nh các hành vi ph n x khác nhau [3]. Ngoài ra, NK-1R còn tham gia vào s bài ti t ư ng ru t, i u ti t mi n d ch hay co bóp c a cơ trơn trong cơ th [4, 5]. c bi t, Rosso và c ng s ã ch ng minh vai trò c a NK-1R liên quan n phát tri n kh i u ác tính [6]. Gen mã hóa cho NK-1R là gen ơn b n. ngư i, gen này n m trên nhi m s c th s 2, có 5 exon. Trình t nucleotide c a gen NK1 ư c Takahashi và c ng s công b năm 1991. Trong 24<br /> <br /> _______<br /> ∗<br /> <br /> Tác gi liên h . T: 84-0988551068 E-mail: vothithuonglan@hus.edu.vn<br /> <br /> V.T.T. Lan và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 4 (2013) 24-28<br /> <br /> 25<br /> <br /> th i gian này, trình t cDNA mã hóa cho th th NK1 ngư i cũng ư c công b b i Hopkins và c ng s [7]. Trình t protein c a th th NK-1R có 407 amino acid c ba i tư ng là ngư i, chu t nhà và chu t ng. Trình t amino acid c a NK-1R ngư i và chu t có tương ng cao 99%, ch sai khác 22 amino acid. S sai khác này không nh hư ng nhi u n liên k t v i ch t P ho c m t s ch t tín hi u khác. Tuy nhiên, ái l c liên k t gi a các d ng NK-1R này v i các lo i thu c ho c dư c li u có s thay i rõ r t [8, 9]. Vì v y, phân l p các gen mã hóa cho NK-1R t các t c ngư i các vùng a lý khác nhau c bi t có ý nghĩa trong nghiên c u ch t i kháng th th . Các ch t i kháng th th là ph i t (có th là các thu c có b n ch t hóa h c khác nhau) liên k t v i th th nhưng không gây ra các ph n ng sinh h c ho c làm gi m hay khóa các ph n ng trung gian c a ch t ch v n. Thu c i kháng th th c nh tranh v i các ph i t n i sinh liên k t v i th th . Tương t như v y, ch t i kháng NK-1R là các h p ch t hay các dư c li u có ái l c liên k t cao v i NK-1R, tranh ch p v trí liên k t c a ch t P và không gây ra các áp ng c a cơ th khi liên k t v i th th này [10]. Vào năm 1980, ch t i kháng v i các ph i t g n th th NK1 u tiên ư c t ng h p thúc y m nh m các nghiên c u v thu c i kháng NK-1R [3]. Hi n nay, các thu c i kháng NK-1R tham gia vào h tr i u tr lâm sàng các b nh ch y u liên quan n th n kinh tr m c m, stress, ch ng au n a u, gi m au, các tri u ch ng c a tâm th n r i lo n th n kinh ho c trong h tr b nh nhân hóa tr li u [8, 9]. M c dù NK-1R và ch t i kháng NK-1R có ng d ng r ng rãi trong lĩnh v c y, dư c, nhưng các nghiên c u v NK-1R Vi t Nam<br /> <br /> v n còn r t ít ho c chưa ư c công b . Nghiên c u này c a chúng tôi trình bày k t qu phân l p cDNA hoàn ch nh mã hóa cho NK-1R t ngư i Vi t Nam nh m m c ích ch ng bi u hi n th th này cho các nghiên c u ti p theo v sàng l c các ch t i kháng t dư c li u Vi t Nam.<br /> <br /> 2. Nguyên li u và phương pháp M u u não sau ph u thu t ư c gi ngay trong nitơ và ư c s d ng tách chi t ARN t ng s b ng PureLink Kit (Invitrogen). Hai µg RNA t ng s ư c dùng làm khuôn trong ph n ng phiên mã ngư c t ng h p cDNA s d ng oligoT và enzyme Reverse Transcriptase (Invitrogen). Ph n ng ư c th c hi n theo quy trình hư ng d n c a Invitrogen. Ph n ng RT-PCR ư c th c hi n khu ch i riêng bi t hai o n 5’ và 3’ c a cDNA b ng các c p m i NK1 F: 5’ CGAAATGGATAACGTCCT CCC 3’ và NK1 R1: 5’ GCCAGCAGATGGCGA AGG 3’ (nhân b n o n 5’), c p m i NK1 F1: 5’ GATCTACTTCCTCCCCCTGC 3’ và NK1 R: 5’ CAAGTCCCAGTGTGAGGGTG 3’ (nhân b n o n 3’). Ph n ng s d ng 5 µl cDNA v i chu trình nhi t l p l i 40 chu kỳ (94oC 5 phút; 60oC 30’’; 72oC 90’’). S n ph m sau ó ư c x lý v i enzyme SmaI và n i v i nhau nh DNA ligase t o nên cDNA hoàn ch nh tách dòng trong vector pJET1.2 và bi n n p vào E. coli DH5. Các ph n ng PCR u s d ng enzyme Pfu Taq polymerase có ho t tính c s a m b o tính chính xác trong quá trình nhân b n.Trình t cDNA ư c xác nh trên máy t ng. Sơ ph n ng ư c trình bày trên Hình 1.<br /> <br /> 26<br /> <br /> V.T.T. Lan và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 4 (2013) 24-28<br /> <br /> Hình 1. Sơ phân l p cDNA th th NK1 s d ng các c p m i nhân b n vùng 5’ và vùng 3’ riêng bi t.<br /> <br /> S n ph m 1,4 kb ư c tinh s ch b ng Kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen), ư c tách dòng trong vector pJet1.2 (Fermentas) và ư c bi n n p vào t bào kh bi n E. coli DH5α. Các khu n l c m c trên môi trư ng th ch LB b sung Ampicillin ư c ch n sàng l c plasmid tái t h p mang cDNA-NK1 b ng PCR (Hình 3).<br /> <br /> 3. K t qu 3.1. Phân l p hai o n 5’ và 3’ c a cDNA mã cho th th NK-1R. S d ng hai c p m i NK1 F/NK1 R1; NK1 F1/NK1 R trong ph n ng PCR, chúng tôi phân l p hai o n NK1- 5’ và NK1- 3’ tương ng v i hai vùng 5’ và 3’ c a NK1, s d ng khuôn là cDNA. K t qu khu ch i hai o n rõ nét có kích thư c như tính toán là 788 bp và 728 ư c trình bày trong Hình 2A. Hai o n NK1-5’ và NK1-3’ ư c c t v i SmaI, ư c tinh s ch b ng Kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen) và ư c n i v i nhau b ng DNA ligase. S n ph m n i ư c s d ng làm khuôn cho ph n ng PCR v i c p m i NK1 F/NK1 R khu ch i o n DNA 1,4 kb tương ng v i cDNA-NK1 hoàn ch nh (Hình 2B).<br /> (A) (B) Hình 3. i n di s n ph m PCR sàng l c khu n l c v i c p m i pJET F/R. Gi ng 45-53: Các khu n l c ư c sàng l c; C: i ch ng âm không có khuôn ADN; M: Thang chu n SY – 500.<br /> <br /> 3.2. Xác nh trình t nucleotide cDNA hoàn ch nh c a th th NK-1R Plasmid tái t h p ư c tách chi t t dòng khu n l c (s 5, 9 – Hình 3) và ư c xác nh trình t trên máy c t ng. K t qu so sánh v i d li u trong Databank cho th y trình t protein suy di n c a th th NK1 phân l p ngư i Vi t Nam có 4 amino acid sai khác so v i trình t trong Databank (Hình 4 và B ng 1).<br /> <br /> Hình 2. i n di s n ph m PCR phân l p NK1-5’ và NK1-3’ (A) và NK1 hoàn ch nh (B). Gi ng 5’: o n NK1-5’; Gi ng 3’: o n NK1-3’; C: i ch ng âm không có khuôn cDNA; Gi ng NK1: cDNA hoàn ch nh c a NK1. M: Thang chu n SY-500.<br /> <br /> Hình 4. So sánh trình t amino acid suy di n c a th th NK1 ngư i Vi t Nam v i trình t g c trong Databank.<br /> <br /> V.T.T. Lan và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 4 (2013) 24-28<br /> <br /> 27<br /> <br /> B ng 1. Sai khác v trình t amino acid gi a th th NK1 c a ngư i Vi t v i trình t protein trên NCBI Acid amin (NM_007053.3) R - Arginine (62) T – Threonine (124) Y – Tyrosine (214) E - Glutamic acid (332) Acid amin (M u ngư i Vi t Nam) G - Glycine A - Alanine G - Glycine<br /> Xác su t Xác su t<br /> <br /> Th th NK-1R (ngân hàng gen NM_007053.3)<br /> <br /> Vùng xuyên màng<br /> <br /> Bên ngoài<br /> <br /> Bên trong<br /> <br /> Th th NK-1R<br /> <br /> ngư i Vi t Nam<br /> <br /> C - Cysteine<br /> <br /> (Chú thích: (62), (124), (214) và (332) là v trí c a các amino acid trong trình t protein g c).<br /> <br /> V trí axit amin<br /> <br /> 4. Th o lu n Khi i chi u nh ng sai khác v acid amin trên c u trúc 2D c a th th NK-1R, chúng tôi nh n th y r ng ba v trí quan tr ng liên quan n ch c năng c a th th [1] u không b thay i. Cho n nay v n chưa có tài li u nào công b v c u trúc 3D c a th th NK-1R. Vì v y, nh ng chuy n ng hay nh ng bi n i c a th th NK-1R khi liên k t v i ch t P cũng như G-protein u chưa ư c bi t rõ [4]. Hi n t i, nh ng thay i trong c u trúc 3D c a th th NK-1R ư c so sánh v i th th GPCR β2adrenergic khi xem xét nh ng bi n i trong quá trình ư c ho t hóa. V i th th NK-1R ngư i Vi t Nam, ch m t amino acid sai khác ư c cho có th liên quan n quá trình ho t hóa th th NK-1R. Tuy nhiên amino acid sai khác này v n là amino acid ưa nư c gi ng như amino acid t i cùng v trí trong trình t g c [7]. S d ng ph n m m TMHMM server 2.0 [11] ki m tra tính xuyên màng c a trình t protein suy di n thu ư c, chúng tôi nh n th y c 4 sai khác amino acid nhi u kh năng không nh hư ng n tính xuyên màng (Hình 5).<br /> <br /> Hình 5. Ki m tra tính xuyên màng c a protein th th NK1 g c (Databank) và protein suy di n c a th th NK1 phân l p t ngư i Vi t Nam b ng ph n m m TMHMM server 2.0 [11].<br /> <br /> 5. K t lu n Chúng tôi ã phân l p ư c cDNA hoàn ch nh mã hóa cho th th NK1 ngư i Vi t Nam. Trình t amino acid suy di n cho th y có 4 sai khác so v i trình t g c trong Databank. Tuy nhiên phân tích mô ph ng cho th y s sai khác này có l không nh hư ng n tính xuyên màng c a th th mà chúng tôi phân l p ư c. cDNA hoàn ch nh s ư c bi u hi n trong t bào ng v t nuôi c y, xây d ng h th ng th thu c m i nh m sàng l c các ch t i kháng t ngu n dư c li u nư c ta.<br /> <br /> L i c m ơn Chúng tôi trân tr ng c m ơn s tài tr c a B Khoa h c và Công ngh Vi t Nam cho tài T-PTNT .2011-G/04 th c hi n nghiên c u này.<br /> <br /> 28<br /> <br /> V.T.T. Lan và nnk. /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 4 (2013) 24-28<br /> <br /> Tài li u tham kh o<br /> [1] T.A. Almeida, J. Rojo, P.M. Nieto, F.M. Pinto, M. Hernandez, J.D. Martín, M.L. Candenas. Tachykinins and tachykinin receptors: structure and activity relationships. Bentham Science Publishers 11 (2004), 2045. E.W. Greeno, P. Mantyh, G.M. Vercellotti, C.F. Moldow. Functional neuroklnin 1 receptors for substance P are expressed by human vascular endothelium. The Journal of Experimental Medicine 177 (1993), 1269. L. Quartara, C.A Maggi. The tachykinin NK1 receptor. Part I: Ligands and mechanisms of cellular activation. Neuropeptides 31(1997), 537. J. InHae, H.J. Tae. Differential roles of exoloop 1 of the human follicle – stimulating hormone receptor in hormone binding and receptor activation. J. Biological Chemistry 270 (1995), 15970. T. Kincy-Cain, K.L. Bost. Increased susceptibility of mice to Salmonella infection following in vivo treatment with the substance<br /> <br /> [2]<br /> <br /> [3]<br /> <br /> [4]<br /> <br /> [5]<br /> <br /> P antagonist, spantide II. The Journal of Immunology 157 (1996), 255. [6] M. Rosso, M. Munoz, M. Berger. The Role of Neurokinin-1 Receptor in the Microenvironment of Inflammation and Cancer. The Scientific World Journal (2012), Doi:10.1100/2012/381434 [7] B. Hopkins, S.J. Powell, P. Danks, I. Briggs, A. Graham. Isolation and characterization of the human lung NK-1R cDNA. Biochemical and Biophysical Research Comm. 180 (1991), 1110. [8] I. Marriott, K.L. Bost. Subtance P. University of North Carolina, (2001), DOI: 10.1006/rwcy.2001.13005. [9] M.P. Rogers, L. Blackburn, MS, et al. Use of Neurokinin – 1 receptor antagonists in patients receiving moderately or highly emetogenic chemotherapy. Clinical Journal of Oncology Nursing 14 (2010), 500. [10] M.J.N Rupnipak, M.S Kramer. Substance P and related tachykinins. Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress 8 (2002), 169. [11] http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/<br /> <br /> Isolation of full Length cDNA Encoding NK1 Receptor from Vietnamese Brain Tissue<br /> Võ Th Thương Lan1, Phan Hà M 1, inh oàn Long1,2<br /> 1<br /> <br /> Key Lab for Enzyme-Protein Technology, VNU University of Science, 334 Nguy n Trãi, Thanh Xuân, Hanoi, Vietnam 2 School of Medicine and Pharmacy, Vietnam National University, 144 Xuân Th y, C u Gi y, Hanoi, Vietnam<br /> <br /> Abstracts: The NK1 receptor (NK-1R) is a member of family 1 of G-protein coupled receptors (GPCR). NK-1R is widely distributed in both the central and peripheral nervous system. It plays an important role in pain and inflammation, and mediating chemotherapy-induced nausea and vomiting. High affinity of receptor - ligands and receptor activation are associated with the diverse and differential roles of the amino acids of NK1 receptors. The recombinant NK-1R has been used for pharmacological studies and in methods of screening candidate compounds for the ability to antagonize the binding of specific ligands to NK-1R. In this study, we isolated full length cDNA encoding NK-1R from Vietnamese brain tissue. Nucleotide sequencing and deduced peptide sequence revealed 4 different amino acids as compared to that presented in databank and that these variant acids did not appear to influence transmembrane domains. However, these variants might alter the affinity interaction between NK-1R and its ligands. Recombinant NK1R corresponding to cDNA isolated from Vietnamese people expressed in mammalian cells would be useful for pharmacological studiesn and in screening candidate compounds extracted from Vietnamese herbal medicines. Keywords: Neurokinin-1 receptor (NK-1R), G-Protein coupled receptor, antagonist, Vietnamese.<br /> <br />