Thăm dò cơ chế hạ Glucose huyết của phân đoạn N-Hexan rễ cây Chóc máu nam trên tế bào cơ vân C2C12

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

11
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là thăm dò khả năng gây độc tế bào CaC13 của PĐ; đánh giá tác dụng tăng thu nhận glucose trên tế bào cơ vân CaCl2 của PE; đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của các chất chiết tách được từ PĐ. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thăm dò cơ chế hạ Glucose huyết của phân đoạn N-Hexan rễ cây Chóc máu nam trên tế bào cơ vân C2C12

TH M DÒ C ơ CHÉ HẠ GLUCOSE HUYẾT CỦA PHÂN ĐOẠN N-HEXAN RẺ CÂY CHÓC MÁU NAM TRÊN TẾ BÀO c ơ VÂN C2C12 ThS. Trần T h ị T hùy L ỉn h *; ThS. N guyễn Thu Hằng* H ư ớn g dẫn: TS. Trần Thị O anh** TÓM TẮT Đái tháo đường là rối loạn chuyển hóa dẫn đến tăng glucose huyết, nhiều biến chứng và được xem là vấn đề cấp bách của thời đại. Ở Việt Nam, cắn dịch chiết phân đoạn nhexan rễ Salacia cochinchin nsìs Lour, (đặt tến là PĐ) đã bước đầu được nghiên cứu và chứng minh tác đụng hạ glucose huyếí trên động vật thí nghiệm và trên một số đích tác dụng cùa thuốc điều trị ĐTĐ đồng thời cũng đã chiết tách và xác định được cấu trúc của 3 chất có trong pliân đoạn n hexan là friedelan~3Pol (SCC1); Psiíosterol (SCC2) và 21a,30~dihyđroxyfrjedelan3on (SCC3). Mục tiêu nghiên cứu: Thăm dò khả năng gây độc tế bào C2C 12 của PĐ; Đánh giá tác dụng tãng thu nhận glucose trên íể bào cơ vân C2C 12của PĐ; Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK của các chất chiết tách được từ PĐ. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: Tê bào C2C 2 được ủ với mẫu thử PĐ ở các nồng độ 20,00 50,00 125,00 250,00 (ig/ml trong 48 giờ, xác định khả năng gây chết té bào C2Cí2 cùa PĐ so với lô chứng bằng kỹ thuật định lượng MTT. Đánh giá ảnh hưởng của PĐ ờ hai nồng độ 20,00 |Jg/ml và 50,00 |ig/ml đến khả nãng thu nhận glucose vào tế bào bằng cách ủ tế bào và PĐ trong môi trường ủ chứa sẵn 8,0 M glucose, định lượng glucose còn iại trong môi trường bằng phương pháp glucose oxiđase. ủ tế bào vởi SCC1, SCC2 và SCC3 ở hai nồng độ 20,00 |jg/mL và 50,00 |ig/ml, đùng kỹ thuạt lai Western (Western blot) đánh giá khả năng làm tăng mức độ biểu hiện của pAMPK ờ các lô thử so với lô chứng. Kết quả: PĐ ờ nồng độ 125 Mg/ml và 250 Mg/ml gây chết 21,82% và 28,74% íé bào C2C12. PĐ 20,00 Mg/mỉ và 50,00 ng/ml không gây chẹt tế bào C2C12, làm tãng thu nhận glucose vào tế bào C2C12 khi không có mặt insulin trong môi trường nuôi cây và không làm tăng thu nhận glucose vào tể bào C2C I2 khi có mặt insulin trong môi trường. Trong 3 chất chiết tách từ PĐ chỉ có psitosterol (50,00 ug/ml) có tác dụng hoạt hóa AMPK, friedelan3pol và 21a,30 dihydroxyfriedelan3on không có tácdụng này. Kết luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy PĐ có thể ảnh hưởng đến khả năng thu nhận glucose vào tế bào cơ vân chủ yếu theo cơ chê không phụ thuộc insulin hoặc PĐ có những tác đụng kiểu insulin. Kê£ quả thu được về tác dụng hoạt hóa AMPK cửa các chât hóa học chiết tách được từ PĐ phù hợp với kết quả của các nghiên cứu khác đã được tiến hàiih. Đây sẽ là những cơ sở ban đầu của việc đua Chóc máu Nam vào làm thuốc trong điều trị đái tháo đường. * Từ khóa: Rễ cây Chóc máu cam; Hạ glucose huyết; Tế bào vân cơ. Probing the hypoglycemic m echanism o f n-hexane segm ent o f salacm cochinchinensis lour, roots xtra c t in C 2C i 2 m u sc l c lls Sum m ary Diabetes is a metabolic disorder leading to hyperglycemia and complications. In Vietna, nhexane segment of Salaciacochinchin nsisLour, roots extract (named PĐ) is studied demonstrating hypoglycaemic effect in rats and on somq targets of antidiabetic drugs. Do Thi Nguyet Que et al extracted and determined the structures of 3 substances from this segment. They are friedelan3pol (SCC1); psitostero] (SCC2) and 21a,30đihyđroxyfrieđe an3on (SCC3). Objective: Probe the C2C 2 cytotoxicity of PĐ; Evaluate the increasing glucose uptake effect in C2C12 of PĐ Evaluate the AMPK activation effect of substances those are extracted from PĐ. * Dại học Dựợc Hà Nội ** Cọc Khoa học Công nghệ và Đào tạo 469
Material and methods: C2C 12 muscle cells were incubated with PĐ at various concentrations (20.00 50.00 125.00 250.00 ịig/mL) in 48h, cytotoxicity of PĐ was determined by MTT assay. Effect of PĐ at concentrations of 20.00 |ig/mL and 50.00 (ig/mL on glucose uptaking of CzCiz was determined by incubating the cells with PĐ in environment containing 8,0M glucose, then quantify the amount of glucose remaining in the medium by using glucose oxidase. Incubate the cells with SCC1; SCC2 or SCC3 at concentrations of 20.00 fig/mL and 50.00 fig/mL, evaluate ứie AMPK activation effect of substances by Western blot method. Results: PĐ at concentrations of 125.00 |ig/mL and 250.00 jig/mL caused 21.82% and 28.74% C2C 12 death, respectively. The amount of death cells in the lots that incubated with PĐ at concentrations of 20.00 fig/mL and 50.00 jig/mL were not different from stock lot. PĐ at concentrations of 20.00 Mg/mL and 50.0Ố|ig/mL increased the glucose uptaking of C2C 12 with insulin absence in medium. In three substances, only SCC2 at concentration of 50,00 |ig/mL effected on AMPK activation. Conclusion: These experiments suggest that PĐ can affect to glucose uptake of C2Cj2 on the way that not depend on insulin or PĐ has effects similar to effects of insulin. The results obtained on the effect of substances extracted from PĐ on AMPK activation consistent with results of other researches. This will be the scientific basis of taking PĐ in the treatment of diabetes. * Key words: s alacia cochinchin nsis lour. Roots; Hypoglycemia; Muscle cells. I.Đ Ặ T V Ẩ N Đ Đái tháo đường là rối loạn chuyển hóa dẫn đến tăng glucose huyết, nhiều biến chứng và được xem là vấn đề cấp bách của thòi đại. Đã có một số thuốc điều trị đái tháo đường (ĐTĐ) nhưng hiệu quả còn nhiều hạn chế. M ột số loằi thuộc chi Salacia đã được sử đụng để điều trị béo ph v à ĐTĐ tại .một số nước trên thế giói. Ở Việt Nam, Salacia cochinchin nsis Lour. (Chóc máu Nam) được đồng bào Kata sử đụng để tiêu khát, chống viêm, Đỗ Thị Nguyệt Quế và c s đã chứng minh tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết methanol toàn phần và phân đoạn n hexan rễ s. cochinchỉn nsìs Lour, trên động vật thí nghiệm và trên một số đích tác dụng của thuốc điều trị ĐTĐ, đồng thời cũng đã chiết tách và xác định được cấu trúc của 3 chất có trong phân đoạn nhexan là friedelan3Ị3ol; 21a,30~dihyđroxyfrieđelan3on và psitosterol [2]. Để tiếp tục t m hiểu cơ ché tác dụng của phân đoạn n hexan rễ cây Chóc máu Nam v à các chất tách chiết được từ phân đoạn này chúng tôi thực hiện nghiên cứu: “Thăm dò c c h ế tác dụn g h ạ đu ờn g huyểt của ph ẫn đoạn n-h xan r ễ cây Ch c m áu Nam (PĐ) trên tế bào c vân C2 C12 ” với 3 mục tiêu: Thăm dò k h ả n ân g gây độc tể bào C2C 2 cùa PĐ' Đánh giá tác dụ n g tăng th u n hận glucos trên t ế bào c vấn C2Cị 2 của PĐ. - Đ ánh giá tác dụ n g hoạt h a A M P K của các chất chiết tách được t ừ P B „ II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1. Nguyên ỉiệu Rễ cây Chóc máu Nam, tên khoa học là s. cochinchin sis Lour.. M ầu tiêu bản số 9694 được lưu tại Phòng tiêu bản, Viện Dược liệu, c ắ n phân đoạn nhexan địch chiết methanol toàn phần rễ Chóc máu Nam (PĐ). Các chất chiết tách từ PĐ: frieđelan3poí (SCCi); Ị5sitosterol (SCC2); 21a,30dihydrox>friedeIan3on (SCC3). Tế bào d ù ng tro n g nghiên cứu: Tê bào cơ vân nguyên phát của chuột nhắt C2C Ỉ2 được cung cấp bởi American Type Culture C ollection (clone CRL1772). 470
2.2. Phương pháp nghiên cứu Thăm dò k h ả nă ng gây độc t ế bào C 2 C12 cửa PĐ Sử dụng kỹ thuật định lượng M TT (MTT assay) [9]. Gồm các bước như sau: Hoạt hoá và nuôi cấy tế bào C2C 12 trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% huyết thanh bò, penicillin lOOUI/mỉ; streptomycin 0,lm g/m l ở 37°c, 5% C 0 2. c ấ y chuyển vào đĩa 96 giếng. Biệt hóa té bào bằng huyết thanh ngựa 5% trong 72 giờ. Chia các giếng tế bào thành các lô, mỗi lô 3 giếng, ủ với PĐ (hòa tan trong DMSO) với các nồng độ 20,00 50,00 125,00 và 250,00 |ig/m l trong 48 giờ. Tiến hành song song với các giếng chứng (chỉ bổ sung DMSO). Thêm 20 MI đung dịch M TT (5 mg/ml) vào mỗi giếng, ủ 5 giờ. H út bỏ phần đung dịch thêm 200p,L ĐMSO, trộn đều và để 15 phút. Đo quang ở bước sóng 540 nm bằng máy ELISA. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần ở cùng điều kiện. So sánh mật độ quang giữa lô ủ với PĐ và lô chứng để đánh giá ảnh hưởng của PĐ đến chức năng sống của tế bào. % gây chét tế bào do PĐ so với lô chứng tính theo công thức: , 1 0 0 X ( O P eM w . ODth ) Q^chửng Trong đó: X : Phần trăm tế bào chết của lô thử so với lô chứng (%). ODchứng: mật độ quang của lô chứng; ODthừ: mật độ quang lô ủ mẫu thử. Đánh giá ảnh hưở n g của PĐ đến k h ả năn g thu n hận glucos của tế bào C 2 C 12 Các bước tiến hành: H oạt hóa, nuôi cấy và biệt hóa tế bào C 2C 12 (giống như trên). Hòa tan PĐ vào DMSO. Chia các giếng tế bào thành các lô, mỗi lô 3 giếng: Lô 1 (lô chứng): chỉ bổ sung DMSO; Lô 4 (lô insulin): ủ với insuiin 0,1 pM. LÔ 2: ủ với PĐ nồng độ 20,00 *ig/ml; Lô 5: ủ PĐ 20,00 Ịig/ml; insulin 0,1 ịM . Lô 3: ủ với PĐ nồng độ 50,00 Hg/mỉ; Lô 6: ù PĐ 50,00 ịig/ml; insulin 0,1 fiM. Tiến hành ủ tế bào với mẫu thử như trên 1 giờ ở 37°c trong môi trường DMEM chứa 8 mM glucóse và 0,1% albumin bò. Hút iop.1 môi trường ở mỗi giếng tế bào cho vào một đĩa 96 giếng mới có chứa sẵn 200|iỉ glucose oxydase, trộn đều. ủ tiếp trong 15 phút ở 37°c. Đo quang ở bước sóng 492 nm. So sánh mật độ quang của các lô ủ với mẫu thử với lô chứng để đánh giá tác dụng của mẫu thử. Đánh giá tác đụ ng h oạ t h a A M P K của các c h ầ chiết tách được từ P B Đánh giá khả năng hoạt hóa AM PK của mẫu thử thông qua đánh giá mức độ biểu hiện của AM PK đã phosphory hóa ở phân tử threonin 172 (viết iắt là pAMPK) bằng kỹ íhuật W estern blot. Các bước tiến hành cơ bản như sau: Hoạt hóa, nuôi cấy và biệt hóa tế bào C2Cị 2 trong đĩa 6 giếng, ủ tế bào với mẫu thử SCC1 SCC2 và SCC3 ở các nồng độ 20,00 và 50,00 ng/ml trong 1 giờ. Xác định mức độ biểu hiện cùa pAMPK và pactin (protein đối chứng) bằng kỹ thuật Western blot [7]. X ử ly số liệu: s ố liệu được xử lý thống kê theo phần mềm Microsoft Excel 2007. Sự khác nhau có ý nghĩa thông kê khi p
Bảng ỉ. Giá trị mật độ quang của các lô tế bào sau khi ủ với MTT Lô n Nồng độ ủ (Ịlg/ml) Giá trị m ật độ quang % tế bào chết Lô chứng 3 - 0,51 ±0,04 Lô thử 1 3 PĐ 20,00 [ig/mL 0,55 + 0,04 Lô thử 2 3 PĐ 50,00 ịig/mL .0 ,5 5 + 0,12 Lô thử 3 3 PĐ 125,00 ịlgỉmL 0,40 ±0,09* 21,82 Lô thử 4 3 PĐ 250,00 [ig/mL 0,37 ± 0,05** 28,74 *: p
T ỷ lệ mức độ biểu hiện pAMPK so với Pactin và số lần tăng mức độ biểu hiện cùa pAMPK ở các lô thử so với lô chứng như sau: Bảng 3. Phần trăm mức độ biểu hiệnpAMPK so với pactin % mức độ biểu hiện Mầu pAMPK so vói pactin Lô chứng 128,91 +59,05 SCC1 50fig/mi 122,51 ±89,74 SCC1 20|ig/ml 152,07 ±88,47 SCC2 50ịjg/mỉ 148,63 + 63,00* SCC2 20|ig/ml 135,18 ± 85,01 SCC3 50|ig/ml 92,16 ±67,79 H nh 2, Số lần tăng biểu hiện pAMPK của lô ủ với *: p
Trước khi tiến hành đánh giá tác dụng của PĐ trên tế bào cơ vân C2C J2, chóng tôi đã khảo sát khả năng gây độc của mẫu thử trên dòng tế bào này. Kết quả cho thấy PĐ ờ các nồng độ 20,00 và 50,00 Ịig/ml không gây chết tế bào, PĐ (125 và 250 |ig/m l) gây chết 21,82 và 28,74% tế bào so với lô chứng (p
trong các nghiên cứu được công bố tại các tạp chí có uy tín trên thế giới. Kết quả cho thấy SCC2 (50,00 (Ig/ml) ỉàm tăng mức độ biểu hiện của pAM PK so với lô chứng (p