Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy cadmium ở lúa TBR225

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

13
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy cadmium ở lúa TBR225 đánh giá biểu hiện của gen đích và thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Cas9) gây đột biến bất hoạt OsNRAMP5 của giống lúa chủ lực TBR225.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy cadmium ở lúa TBR225

Vietnam J. Agri. Sci. 2022, Vol. 20, No. 9: 1220-1229 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2022, 20(9): 1220-1229 www.vnua.edu.vn Ngô Thị Vân Anh1, Nguyễn Anh Minh2, Phạm Thu Hằng2, Phạm Phương Ngọc2, Lê Quỳnh Mai3, Phạm Xuân Hội2, Nguyễn Duy Phương2* 1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2 Viện Di truyền Nông nghiệp 3 Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội * Tác giả liên hệ: phuongnd.bio@gmail.com Ngày nhận bài: 06.08.2022 Ngày chấp nhận đăng: 27.09.2022 TÓM TẮT Cadmium (Cd) có độc tính rất cao đối với hầu hết các sinh vật sống, bao gồm cả con người. Lúa gạo chứa hàm lượng Cd vượt ngưỡng (0,2 mg/kg - QCVN 8- 2:2011/BYT) là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc Cd. OsNRAMP5 thuộc họ NRAMP (natural resistance-associated macrophage protein) đã được xác định có liên quan tới quá trình vận chuyển nhiều kim loại như sắt (Fe), kẽm (Zn), đồng (Cu), mangan (Mn) và Cd ở lúa. Để phục vụ nghiên cứu chức năng OsNRAMP5, chúng tôi đã đánh giá biểu hiện của gen đích và thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Cas9) gây đột biến bất hoạt OsNRAMP5 của giống lúa chủ lực TBR225. Bằng phương pháp xử lý nhân tạo trong dung dịch trồng thủy sinh có bổ sung Cd, OsNRAMP5 đã được chứng minh tăng cường biểu hiện ở mô rễ lúa TBR225. Một phần trình tự chứa ExonI của OsNRAMP5 dài 0,29kb đã được phân lập để phục vụ thiết kế sgRNA (single guide RNA) cho hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5. Cấu trúc biểu hiện sgRNA mang hai trình tự crRNA (CRISPR RNA) nhận biết ExonI OsNRAMP5 đã được ghép nối vào vector nhị thể pCas9. Vector tái tổ hợp đã được kiểm tra bằng PCR và giải trình tự Nu. Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho cải tiến chất lượng giống lúa chủ lực TBR225 bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen. Từ khóa: Bất hoạt gen, Cadmium, CRISPR/Cas9, OsNRAMP5, TBR225. Designing CRISPR/CAS9 System for Knocking out OsNRAMP5 Related to Cadmium Accumulation in Rice Variety TBR225 ABSTRACT Cadmium (Cd) is highly toxic to most living organisms, including humans. Rice with excessive Cd (> 0,2 mg/kg - QCVN 8-2:2011/BYT) is one of the leading causes of Cd poisoning, threatening human health. Several genes belonging to the NRAMP (natural resistance-associated macrophage protein) family are related to metal accumulation in plants; in which OsNRAMP5 has been identified to be involved in the transport of various metals such as iron (Fe), zinc (Zn), copper (Cu), manganese) Mn and Cd in rice. In order to identify the function of OsNRAMP5 in elite rice variety TBR225, we evaluated the expression of the targeted gene and designed Clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated Cas9 (CRISPR/Cas9) system for editing TBR225 OsNRAMP5. The increase of OsNRAMP5 expression was observed in the root tissues of TBR225 rice plant in the Cd-treatment experiment using hydroponic culture. A sequence containing the ExonI region of OsNRAMP5 with a size of 0.29kb was isolated from the total DNA of TBR225 to design single guide RNAs (sgRNA) for OsNRAMP5- editing CRISPR/Cas9 system. The sgRNA expression construct carrying two CRISPR RNA (crRNA) sequences recognizing two different sites on the ExonI of OsNRAMP5 was ligated into the binary vector pCas9. The recombinant vector was validated by PCR and sequencing analysis. The results serve as basis for the improvement of TBR225 rice variety with high quality by using genome editing technology. Keywords: Cadmium, CRISPR/Cas9, Knocking out gene, OsNRAMP5, TBR225. 1220
Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng, Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương - -  1221
Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium ở lúa TBR225 µ µ µ µ µ µ µ µ µ µ µl µ Mục đích Kích thước Tên Trình tự Gen đích thí nghiệm (bp) NRAMP5-F GGTGTGGCTTGAGAGTTCGT OsNRAMP5 [12] Phân lập 286 NRAMP5-TBR NRAMP5-R CATGGTGACAGTGGAGTGCT NRAMP5-RT-F CAGCAGCAGTAAGAGCAAGATG RT-PCR 111 NRAMP5-RT-R GTGCTCAGGAAGTACATGTTGAT Actin-F TGATGGTGTCAGCCACACT OsActin [12] RT-PCR 230 Actin-R TGGTCTTGGCAGTCTCCATT attL-F GTACAAAAAAGCAGGCT pENTR4-V2 PCR vector tái 995 tổ hợp attL-R GTACAAGAAAGCTGGGT BtgZI-crRNA1-F TGTT[GCATCAGCTGGAGAGCTAGTG] crRNA1-OsNRAMP5 Thiết kế vector 21 BtgZI-crRNA1-R AAAC[CACTAGCTCTCCAGCTGATGC] BsaI-crRNA2-F GTGT[GATGATCAGCTGCTAATGA] crRNA2-OsNRAMP5 21 BsaI-crRNA2-R AAAC[TCATTAGCAGCTGATCATC] Ubi-F CCCTGCCTTCATACGCTATT pCas9 PCR vector tái 350 tổ hợp Cas9-t-R GCCTCGGCTGTCTCGCCA Hpt-F AAGGAGGTGATCCAGCC 821 Hpt-R GAGTTTGATCCTGGCTCAG 1222
Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng, Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương µ µ µ µ µ µ ° ° °   ∞ 1223
Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium ở lúa TBR225 1224
Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng, Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương - - – - 1225
Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium ở lúa TBR225 Tên Trình tự crRNA (5’-3’) Kích thước (bp) TSL DSL TBP CBP IBP % GC On-score sgRNA-1 GATGATCAGCTGCTAATGA 19 3 - 12 6 0 40% 0,7456 sgRNA-2 GAGAGAGAGCAGTGAGAGA 19 3 - 11 7 0 55% 0,0912 sgRNA-3 GAGAGAGAGAGCAGTGAGAG 20 3 - 9 3 0 55% 0,1913 sgRNA-4 GTGAGAGAGGGAGCATCAGC 20 3 - 11 3 0 60% 0,1012 sgRNA-5 GCATCAGCTGGAGAGCTAGTG 21 4 SL1 10 4 2 55% 0,3903 sgRNA-6 GAGAGAGAGAGCAGTGAGAGA 21 3 - 9 3 0 55% 0,1913 sgRNA-7 GATCATCTGCGTCGAGCTTCT 21 3 - 11 3 0 55% 0,0323 sgRNA-8 GCAGATGATCAGCTGCTAATGA 22 3 - 13 6 0 45% 0,2272 Trình tự đoạn DNA tương đồng crRNA Tên Vị trí Khoảng cách (bp)* Gen đích/Mã số trong hệ gen lúa sgRNA-1 GATGATC[AGCTGCTAATGA] E 0 OsNRAMP5 GATGAGG[AGCTGCTGATGA] E 0 Os02g0611200 AATAATC[AGCTGCTAATCA] - 6907 Os11g0508301 sgRNA-5 GCATCAGCT[GGAGAGCTAGTG] E 0 OsNRAMP5 - 1226
Ngô Thị Vân Anh, Nguyễn Anh Minh, Phạm Thu Hằng, Phạm Phương Ngọc, Lê Quỳnh Mai, Phạm Xuân Hội, Nguyễn Duy Phương  1227
Thiết kế hệ thống CRISPR/Cas9 bất hoạt OsNRAMP5 liên quan tới tích lũy Cadmium ở lúa TBR225 → › µ 1228