Thiết kế hệ thống vector CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen GmHyPRP1, một gen của cây đậu tương liên quan tới quá trình chống chịu đa stress phi sinh học

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

39
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này đã thiết kế hệ thống vector CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats/Cas9) mang các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 nhằm phục vụ cho công tác tạo cây đậu tương đột biến tăng cường khả năng chống chịu với các stress phi sinh học. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thiết kế hệ thống vector CRISPR/Cas9 để chỉnh sửa gen GmHyPRP1, một gen của cây đậu tương liên quan tới quá trình chống chịu đa stress phi sinh học

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THIẾT KẾ HỆ THỐNG VECTOR CRISPR/Cas9 ĐỂ CHỈNH SỬA GEN GmHyPRP1, MỘT GEN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG LIÊN QUAN TỚI QUÁ TRÌNH CHỐNG CHỊU ĐA STRESS PHI SINH HỌC Nguyễn Hữu Kiên1,a, Vũ Văn Tiến1,2,a, Nguyễn Trung Anh1, Lê Thị Mai Hương1 , Đoàn Thị Hải Dương2, Đinh Thị Mai Thu1, Nguyễn Thị Hòa1, Tống Thị Hường1, Đinh Thị Thu Ngần1, Phạm Xuân Hội1, Jae-Yean Kim2,*, Nguyễn Văn Đồng1,* TÓM TẮT Stress phi sinh học như hạn, độ mặn trong đất cao, lạnh, nhiệt độ cao và độc tố kim loại nặng là những điều kiện môi trường bất lợi làm ảnh hưởng và hạn chế năng suất cây trồng trên toàn thế giới. Đậu tương (Glycine max L.) cũng là một trong những cây trồng bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi stress phi sinh học. Hiện nay, công nghệ chỉnh sửa gen bằng phức hợp CRISPR/Cas9 được biết tới là một công cụ hữu hiệu có thể chỉnh sửa chính xác các gen quan tâm ở cây trồng. GmHyPRP1 được dự đoán như là một gen điều hòa tiêu cực đối với các stress phi sinh học và có thể đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện khả năng đáp ứng của cây trồng đối với các stress phi sinh học bằng việc làm bất hoạt hoặc mất chức năng của gen này. Chính vì vậy, đã tiến hành thiết kế hệ thống vector biểu hiện CRISPR/Cas9 và các sgRNA tương ứng để chỉnh sửa có định hướng gen GmHyPRP1 nhằm phục vụ công tác nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương đáp ứng tốt với đa stress phi sinh học. Từ khóa: CRISPR/Cas9, đậu tương, PCR, protein HyPRP, chống chịu đa stress phi sinh học. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 2 tương lên tới 60% (Abdel Latef et al., 2015). Hơn nữa, các stress phi sinh học còn làm thay đổi quá trình Đậu tương (Glycine max L.) là cây họ đậu được trao đổi chất, sinh trưởng và phát triển của cây, cuối trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới. Nó chiếm cùng là dẫn đến sự già hóa và có thể làm cây chết 50% của cây họ đậu và chiếm 68% tổng sản lượng cây (Hakeem et al., 2012). Để đối phó với stress phi sinh trồng trên toàn thế giới (Abdel Latef et al., 2015). Tuy học, cây trồng thường có những phản ứng sinh lý, nhiên, diện tích gieo trồng đậu tương hàng năm ở sinh hóa đa dạng và phức tạp để thích nghi và tồn tại Việt Nam chỉ đạt khoảng 105 nghìn hecta với sản (Manavalan et al., 2009). Ngoài ra, khả năng chống lượng 168 nghìn tấn, chiếm một phần rất nhỏ của thế chịu với các stress phi sinh học ở cây trồng nói giới (Gain, 2018; FAOSTAT, 2019). Có nhiều nguyên chung và ở cây đậu tương nói riêng là tính trạng được nhân ảnh hưởng tới diện tích và sản lượng đậu tương kiểm soát bởi nhiều gen (Dorothea Bartels et al., gồm có: các stress sinh học và phi sinh học. 2005). Các stress phi sinh học như hạn, mặn, lạnh, Các protein giàu proline lai (HyPRPs: Hybrid nhiệt độ cao, lụt, thiếu dinh dưỡng và nhiễm kim loại proline-rich proteins) được biết tới như là một họ nặng,... làm giảm năng suất và sản lượng của cây đậu protein tiến hóa linh hoạt để phù hợp cho cây trồng và ban đầu được cho là các protein đáp ứng với tổn 1 Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, thương về mặt cơ học (Dvorakova et al., 2007). Hơn Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp nữa, HyPRP cũng được biết tới là có tham gia vào đáp Việt Nam ứng với stress sinh học và phi sinh học. Trong đó, 2 Bộ môn Khoa học sự sống ứng dụng (Chương trình SIHyPRP1 là một gen giảm sự biểu hiện và đóng vai BK21), Trung tâm Nghiên cứu Sinh học phân tử thực vật và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Quốc gia trò điều hòa tiêu cực đối với các stress phi sinh học ở Gyeongsang, Hàn Quốc cây cà chua (Li et al., 2016). Khi so sánh protein a Đồng tác giả chính SIHyPRP1 với các protein HyPRP1 ở cây đậu tương, * Email: kimjaeyean@gmail.com; dongjircas@yahoo.com đã nhận thấy trình tự protein của GmHyPRP1 10 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ (Glyma.13g22940.1) tương đồng với SIHyPRPR1, 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU điều này chỉ ra GmHyPRP1 có thể có chức năng 2.1. Vật liệu nghiên cứu giống như SIHyPRP1. Các cấu trúc vector pICH47751 và pID sử dụng Chính vì vậy, trong nghiên cứu này đã thiết kế trong nghiên cứu được cung cấp bởi Trường Đại học hệ thống vector CRISPR/Cas9 (clustered, regularly Quốc gia Gyeongsang, Hàn Quốc. Chủng vi khuẩn E. interspaced, short palindromic repeats/Cas9) mang coli Top10 được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm Trọng các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 nhằm điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền phục vụ cho công tác tạo cây đậu tương đột biến tăng Nông nghiệp. Các primer sử dụng trong nghiên cứu cường khả năng chống chịu với các stress phi sinh được trình bày ở bảng 1. học. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Bảng 1. Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu Stt Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) Kích thước (bp) 1 U6-F CAGTCGGTCTCAGGAGtgatcaaaagtcccacat 64 cgatcaggtgatatatagcagcttagttta 2 U6-R CAGTCGGTCTCAcaatcgctatgtcgactctatcatt 64 atataaactaagctgctatatatcacc 3 GmHyPRP1_sgRNA1-F CAGTCGGTCTCAATTGCCAGGCTTGTGC 86 TTTTTGGGgttttagagctagaaatagcaagttaaaata aggctagtccgttatcaac 4 GmHyPRP1_sgRNA2-F CAGTCGGTCTCAATTGGGGGCATGTAGC 86 CTGTGCgttttagagctagaaatagcaagttaaaataag gctagtccgttatcaac 5 GmHyPRP1_sgRNA3-F CAGTCGGTCTCAATTGCCTAGTTTGAGC 86 GTGTCAATgttttagagctagaaatagcaagttaaaata aggctagtccgttatcaac 6 GmHyPRP1_sgRNA4-F CAGTCGGTCTCAATTGTAGAGGGAGCAG 86 GTGTAACCgttttagagctagaaatagcaagttaaaata aggctagtccgttatcaac 7 GmHyPRP1_sgRNA-R CAGTCGGTCTCAAGCGAAAAAAAgcaccga 74 ctcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttatttt 2.2.1. Tìm kiếm dữ liệu và thiết kế các sgRNA định số lượng vị trí chỉnh sửa ngoài gen đích (off- target) đối với các sgRNA. Trình tự các gen GmHyPRP1 được lấy từ cơ sở dữ liệu Soykb (http://soykb.org/) và phytozome 2.2.2. Xây dựng hệ thống vector CRISPR/Cas9 v9.1 (www.phytozome.net/). chứa các sgRNA của các gen GmHyPRP1 Để tiến hành thiết kế các sgRNA cho chỉnh sửa Để xây dựng hệ thống vector CRISPR/Cas9 có gen GmHyPRP1, công cụ CRISPR-P2 chứa các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1, hệ (http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/) được sử dụng trong thống Moclo toolkit (Addgene, Hoa Kỳ) được sử quá trình thực hiện. Cụ thể, trên web CRSPR-P2, đã dụng trong nghiên cứu này theo hướng dẫn của lựa chọn đối tượng quan tâm là cây đậu tương và sử Warner et al., 2012 với một số chỉnh sửa đề phù hợp dụng trình tự của gen GmHyPRP1 với điều kiện phòng thí nghiệm. Cụ thể, đoạn (Glyma13g22940.1). Từ thông tin đối tượng quan tâm promoter U6 và các GmHyPRP1_sgRNA(1-4) được là cây đậu tương và trình tự của đoạn gen cần chỉnh khuếch đại bằng PCR với các cặp mồi tương ứng U6- sửa, đã tìm ra được vị trí của các sgRNA trên gen F/U6-R cho promoter U6 và GmHyPRP1_sgRNA(1- GmHyPRP1. Trang web online (http://www. 4)-F/GmHyPRP1_sgRNA-R cho các rgenome.net/cas-offinder/) được sử dụng để xác GmHyPRP1_sgRNA(1-4) (Bảng 1) sử dụng enzyme PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 11
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ (ThermoFisher Scientific, Hoa Kỳ) với điều kiện pICH47751:U6:GmHyPRP1_sgRNA1 1 µL; phản ứng: HF buffer (5X) 12 µL; dNTPs (10 mM) 1,2 pICH47751:U6:GmHyPRP1_sgRNA2 1 µL; µL; mồi xuôi (10 µM) 3µL; mồi ngược (10 µM) 3µL; pICH47751:U6:GmHyPRP1_sgRNA3 1 µL; Phusion Taq 0,6 µL và nước cất 2 lần cho đủ tổng thể pICH47751:U6:GmHyPRP1_sgRNA4 1 µL; vector tích 60 µL và theo chu trình: biến tính 98oC, 20 giây; pID (11,348 bp; 500 ng/μL) 0,26 μL; enzyme BpiI 0,5 35 chu kỳ với 3 bước (biến tính 98oC, 10 giây; gắn μL; nước cất 2 lần cho đủ tổng thể tích 15 μL và tiến mồi 60oC, 30 giây; kéo dài 72oC, 10 giây); kéo dài hành theo chu trình như trình bày ở trên. 72oC 5 phút; giữ 12oC, 15 phút. Sản phẩm PCR được Sản phẩm của vector tái tổ hợp kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và tinh pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs được biến nạp vào sạch sử dụng kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen, chủng vi khuẩn E. coli. Dịch khuẩn sau đó được cấy Đức). trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 50 mg/L Tiếp theo, sản phẩm PCR tinh sạch của kháng sinh kanamycin và nuôi ở 37oC qua đêm. Các promoter U6 và từng sgRNA được ghép nối với khuẩn lạc trắng được lựa chọn để nuôi tăng sinh khối vector tiếp nhận pICH47751 trong phản ứng Golden trong môi trường LB lỏng có bổ sung 50 mg/L Gate với thành phần: T4 DNA ligase buffer (10X) 1,5 kanamycin và tách chiết DNA plasmid sử dụng kit µL; đoạn promoter U6 (100 bp; 6 ng/μL) 0,23 µL; Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep. Các DNA plasmid tinh đoạn sgRNA (135 bp; 6 ng/μL) 0,3 µL; vector sạch được cắt với enzyme giới hạn BamHI và kiểm tra pICH47751 (4968 bp; 100 ng/μL) 0,42 µL; T4 DNA bằng điện di trên gel agarose 1%. Cuối cùng, các DNA ligase 0,5 µL; enzyme BsaI 0,5 µL và nước cất 2 lần plasmid của vector tái tổ hợp cho đủ tổng thể tích 15 µL và được thực hiện theo pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs cho kết quả dương tính chu trình: xử lý tiền cắt ở 37oC, 15 phút, phản ứng với phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn được sử dụng cắt-nối 30 chu kỳ (37oC, 2 phút; 16oC, 5 phút), xử lý để giải trình tự với mồi Lv11-sF1. sau cắt lần 1 ở 37oC, 5 phút, xử lý sau cắt lần 2 ở 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50oC, 5 phút, dừng phản ứng ở 80oC, 5 phút. 3.1. Kết quả tìm kiếm dữ liệu gen GmHyPRP1 Các vector tái tổ hợp của phản ứng Golden Gate Để tìm kiếm trình tự gen GmHyPRP1, đã sử cho mỗi cấu trúc U6:GmHyPRP1_sgRNA được biến dụng code Glyma13g22940.1 và tìm kiếm trên trang nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10 bằng phương web cơ sở dữ liệu về cây đậu tương Soykb pháp sốc nhiệt. Dịch khuẩn sau khi biến nạp được (http://soykb.org/). Kết quả tìm kiếm được trình cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 20 bày như trong hình 1. mg/L X-gal và 125 mg/L ampicillin và nuôi cấy ở 37oC qua đêm. Các khuẩn lạc màu trắng cho mỗi cấu trúc U6:GmHyPRP1_sgRNA được lựa chọn để nuôi tăng sinh khối trong môi trường LB lỏng có bổ sung 125 mg/L ampicillin và tách chiết DNA plasmid sử dụng kit Fast-n-Easy Plasmid Mini-Prep (Jena Bioscience, Đức). Các DNA plasmid được cắt bằng enzyme giới hạn BpiI và kiểm tra trên gel agarose 1%. Các khuẩn lạc dương tính đối với mỗi cấu trúc Hình 1. Kết quả tìm kiếm gen GmHyPRP1 U6:GmHyPRP1_sgRNA được lựa chọn để giải trình tự với mồi Lv11-sF1: 5’- Kết quả hình 1 cho thấy, Glyma13g22940.1 nằm GGTGTAAACAAATTGACGCTTAGA-3’ bằng máy trên NST số 13 và mRNA có chiều dài là 2412 bp bắt giải trình tự Sanger. đầu từ vị trí 26.409.922 và kết thúc ở vị trí 26.412.334 chứa cả vùng không dịch mã (5’UTR và 3’UTR), vùng Các vector tái tổ hợp pICH47751 chứa các cấu exon và intron. Tuy nhiên, Glyma13g22940.1 chỉ có trúc U6:GmHyPRP1_sgRNAs với trình tự chính xác một vùng exon mã hóa liên tục cho 684 bp của gen của promoter U6 và các đoạn sgRNA cho chỉnh sửa GmHyPRP1 từ vị trí 26.411.494 đến 26.412.177. gen GmHyPRP1 tiếp tục được sử dụng để ghép nối với vector pID trong phản ứng Golden Gate với thành phần: T4 DNA ligase buffer (10X) 1,5 µL; 12 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ lai HyPRP. Đã lựa chọn GmHyPRP1 làm đối tượng để chỉnh sửa và tiến hành thiết kế các sgRNA nhằm xây dựng hệ thống vector CRISPR/Cas9 mang các sgRNA để chỉnh sửa gen GmHyPRP1 trên cây đậu tương. 3.2. Kết quả thiết kế các sgRNA của gen GmHyPRP1 Khi sử dụng công cụ CRISPR-P2 cho thiết kế Hình 2. Kết quả phân tích trình tự protein và vùng sgRNA của gen GmHyPRP1, đã thu được kết quả bảo thủ ở đầu C- của GmHyPRP1 như hình 3. Chú thích: (A) cấu trúc protein của GmHyPRP1; (B) Vùng bảo thủ ở đầu C- của GmHyPRP1. Khi phân tích trình tự protein và vùng bảo thủ ở đầu C- của GmHyPRP1 trên web https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb .cgi, kết quả cho thấy GmHyPRP1 có chứa vùng 8CM và 4 liên kết disulfide ở đầu C- nhằm đảm bảo sự liên kết giữa các phần ở đầu N- và C và thuộc phân Hình 3. Vị trí các đoạn sgRNA trên trình tự gen họ protein AAI_LTSS (Alpha-Amylase Inhibitors_ GmHyPRP1 Lipid Transfer and Seed Storage) của nhóm protein Kết quả cho thấy có 116 sgRNA nằm rải rác trên lai HyPRP (Hình 2). toàn bộ chiều dài của gen GmHyPRP1. Dựa trên kết Qua kết quả tìm kiếm và phân tích trình tự cho quả tìm kiếm sgRNA cho gen chỉnh sửa gen thấy, gen GmHyPRP1 có kích thước 684 bp và mã GmHyPRP1, đã lựa chọn được 4 sgRNA lần lượt được hóa cho 228 amino axit thuộc họ protein giàu proline ký hiệu là sgRNA1-4 (Bảng 2). Bảng 2. Các sgRNA được lựa chọn cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 TT Tên Trình tự đích sgRNA Vị trí Số lượng ngoài mục tiêu đích (
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ U6:GmHyPRP1_sgRNA3; 18-21, các khuẩn lạc của U6:GmHyPRP1_sgRNA4 Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR của promoter U6 có kích thước khoảng 106 bp và các đoạn DNA chứa các GmHyPRP1_sgRNA(1-4) có kích thước khoảng 135 bp (Hình 4A). Tiếp theo, sản phẩm PCR tinh sạch của promoter U6 và các đoạn DNA của các sgRNA(1-4) được sử dụng cho phản ứng Golden gate. Trong đó, các sản phẩm PCR và vector tiếp nhận pICH47751 cùng được xử lý bởi enzyme giới hạn BsaI và phản ứng ghép nối được thực hiện nhờ sự có mặt của enzyme T4 DNA ligase. Các vector tái tổ hợp của phản ứng Golden gate cho mỗi cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10 bằng phương Hình 4. Kết quả khuếch đại promoter U6 và các pháp sốc nhiệt. Dịch khuẩn sau khi biến nạp được sgRNA(1-4) bằng PCR và kiểm tra các sản phẩm tái cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung 20 tổ hợp của các U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) mg/L X-Gal kết hợp với 125 mg/L ampicillin và nuôi cấy qua đêm ở 37oC. Bốn khuẩn lạc màu trắng cho Chú thích: (A) Sản phẩm khuếch đại của mỗi cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA được lựa chọn promoter U6 và các sgRNA(1-4); (B) Sản phẩm tái tổ để nuôi tăng sinh khối trong môi trường LB lỏng có hợp của các U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) được cắt bổ sung 125 mg/L ampicilin để tách chiết thu DNA kiểm tra bằng enzyme giới hạn BpiI. M, thang chuẩn plasmid. Các vector tái tổ hợp cho mỗi DNA 100 bp plus; 1, sản phẩm PCR của promoter U6; U6:GmHyPRP1_sgRNA được cắt kiểm tra bằng 2-5, sản phẩm PCR của các đoạn DNA chứa các enzyme giới hạn BpiI. sgRNA(1-4); 6-9, các khuẩn lạc của U6:GmHyPRP1_sgRNA1; 10-13, các khuẩn lạc của U6:GmHyPRP1_sgRNA2; 14-17, các khuẩn lạc của Bảng 3. Kết quả giải trình tự các cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) U6:GmHyPRP1_sgRNA1 U6:GmHyPRP1_sgRNA2 U6:GmHyPRP1_sgRNA3 U6:GmHyPRP1_sgRNA4 tctgtGAAGACaaACTAga TctgtGAAGACaaTTACg CctgtGAAGACaaCAGAg CctgtGAAGACaaTGTGg attcccatggggagTgatcaaaa aattcccatggggagTgatcaaa aattcccatggggagTgatcaaa aattcccatggggagTgatcaaa gtcccacatcgatcaggtgatata agtcccacatcgatcaggtgatat agtcccacatcgatcaggtgatat agtcccacatcgatcaggtgatat tagcagcttagtttatataatgata atagcagcttagtttatataatgat atagcagcttagtttatataatgat atagcagcttagtttatataatgat gagtcgacatagcgattgCCA agagtcgacatagcgattgGG agagtcgacatagcgattgCCT agagtcgacatagcgattgTAG GGCTTGTGCTTTTTGG GGCATGTAGCCTGTG AGTTTGAGCGTGTCAA AGGGAGCAGGTGTAA Ggttttagagctagaaatagcaa Cgttttagagctagaaatagcaa Tgttttagagctagaaatagcaa CCgttttagagctagaaatagca gttaaaataaggctagtccgttatc gttaaaataaggctagtccgttatc gttaaaataaggctagtccgttatc agttaaaataaggctagtccgttat aacttgaaaaagtggcaccgagt aacttgaaaaagtggcaccgagt aacttgaaaaagtggcaccgagt caacttgaaaaagtggcaccgag cggtgctttttttctagacccagctt cggtgctttttttctagacccagctt cggtgctttttttctagacccagctt tcggtgctttttttctagacccagct tcttgtacaaagttggcattacgct tcttgtacaaagttggcattacgct tcttgtacaaagttggcattacgct ttcttgtacaaagttggcattacgc TTACttGTCTTCtgcac CAGAttGTCTTCtgcac TGTGttGTCTTCtgcac tGAGCttGTCTTCtgcac Chú thích: Chữ in đậm màu đỏ, vị trí enzyme giới hạn BsaI nhận biết; chữ in đậm màu xanh, vị trí cắt của enzyme giới hạn BsaI; chữ gạch chân, trình tự các sgRNA. Kết quả điện di cho thấy, với mỗi vector tái tổ pICH47751 và 1 băng có kích thước 237 bp được dự hợp U6:GmHyPRP1_sgRNA sau khi cắt đều có 2 đoán là của các cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) vạch băng trên bản gel. Cụ thể, 1 băng có kích thước (Hình 4B). Như vậy, bước đầu cho thấy việc tách khoảng 4352 bp trùng với kích thước của vector dòng và ghép nối các đoạn GmHyPRP1_sgRNA và 14 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ promoter U6 vào vector tiếp nhận pICH47751 đã U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4), trùng với kích thước dự thành công. đoán và 1 băng có kích thước khoảng 4039 bp có Tiếp theo, 2 trong số 4 khuẩn lạc dương tính với chứa trình tự của gen Bar và Cas9 (Hình 5). Để đảm mỗi cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA được lựa chọn bảo sự chính xác, hai trong số ba khuẩn lạc đã được để giải trình tự với mồi Lv11-sF1: 5’- lựa chọn để giải trình tự kiểm tra lại. Kết quả cho GGTGTAAACAAATTGACGCTTAGA-3’ bằng máy thấy, các cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) có giải trình tự Sanger. trình tự hoàn toàn chính xác như trình bày ở bảng 3 Kết quả giải trình tự cho thấy, tất cả 4 vector và được sắp xếp như trong hình 6. pICH47751 có chứa các cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) và đều mang trình tự chính xác của promoter U6 và theo sau là các GmHyPRP1_sgRNA(1-4) (Bảng 3). Tiếp theo, cả 4 vector pICH47751 chứa các cassette U6:GmHyPRP1_sgRNA(1-4) được sử dụng cho phản ứng Golden gate để ghép nối các cassette này vào vector binary pID. Sản phẩm tái tổ hợp của cấu trúc binary vector pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli Top10. Sau đó, dịch khuẩn được cấy trải trên đĩa LB có bổ sung 50 mg/L kháng sinh kanamycin và nuôi qua đêm ở 37oC. Ba khuẩn lạc trắng được lựa chọn để tiếp tục nuôi tăng sinh khối trong LB lỏng có bổ sung 50 mg/L kanamycin cho tách chiết và tinh sạch phục vụ cho việc giải trình tự và cắt kiểm tra bằng enzyme Hình 6. Cấu trúc vector pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs giới hạn. và cassette chứa các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 Chú thích: (A) Cấu trúc vector pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs. (B) Cassette chứa các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1. LB, biên trái; NOSp-BAR-NOST, chỉ thị gen bar kháng glufosinate; 2x35S-hSpCas9-tNOS, Cas9 được điều khiển bởi promoter 35S; U6:gRNA(1-4), vị trí lần lượt của các GmHyPRP1_sgRNA từ trái sang phải; RB, biên phải; pVS1, vùng bắt đầu sao chép; nptII, chỉ thị gen nptII Hình 5. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp kháng kanamycin pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs bằng enzyme giới hạn Qua hình 6 cho thấy, vector binary pID có mang BamHI cassette cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 ở cây đậu Chú thích: M, 1Kb plus ladder; 1-3, DNA tương được sắp xếp lần lượt từ vùng LB sang RB gồm plasmid của các khuẩn lạc có: 1 vùng chứa đoạn gen Bar, 1 vùng chứa Cas9 pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs được điều khiển bằng promoter 2x35S và 4 sgRNA Kết quả cắt kiểm tra vector tái tổ hợp được điều khiển bởi 4 promoter U6, cùng với đó hệ pID:U6:GmHyPRP1_sgRNAs bằng enzyme giới hạn thống chọn lọc được sử dụng đối với vi khuẩn là BamHI (Hình 5) cho thấy, các sản phẩm cắt đều có 2 kháng sinh kanamycin và thực vật là glufosinate. Với băng; trong đó, 1 băng có kích thước khoảng 8210 bp kết quả này, cấu trúc vector binary pID có chứa hệ có chứa vùng trình tự của 4 cassette thống CRISPR/Cas9 và các U6:GmHyPRP1_sgRNA N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 15
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ (1-9) cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 ở cây đậu tương 2. Bao A., Burritt D. J., Chen H., Zhou X., Cao đã được thiết kế thành công. Cho đến nay, kỹ thuật D., & Tran, L. P., 2019. The CRISPR/Cas9 system chỉnh sửa gen sử dụng CRISPR/Cas9 được biết đến and its applications in crop genome editing. Crit Rev như là một trong những công cụ hữu ích trong việc Biotechnol, 39(3): 321-336. nghiên cứu chức năng gen cũng như chỉnh sửa các 3. Bartels D., Sunkar R. (2005). Drought and Salt gen liên quan tới các đặc tính nông sinh học, yếu tố Tolerance in Plants. Critical Reviews in Plant cấu thành năng suất và tăng cường khả năng chống Sciences, 24(1): 23-58. chịu với các stress sinh học và phi sinh học trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau (Bao et al., 4. Dvorakova L., Cvrckova F., and Fischer, L. 2019). Với việc thiết kế thành công hệ thống chỉnh (2007). Analysis of the hybrid proline-rich protein sửa gen CRISPR/Cas9 cho gen GmHyPRP1, chúng families from seven plant species suggests rapid tôi mong rằng sẽ sớm thu được các cây đậu tương diversification of their sequences and expression chỉnh sửa gen GmHyPRP1 có khả năng tăng cường patterns. BMC Genomics, 8: 412. chống chịu các stress phi sinh học, từ đó mở ra 5. FAOSTAT (2019). Food and agriculture hướng đi mới cho sản xuất đậu tương tại Việt Nam. organization of the United Nations (FAO) statistical 4. KẾT LUẬN databases, Available at: http://www.fao.org, Retrieved 10 august 2019. Các kết quả của nghiên cứu chỉ ra rằng, hệ thống vector CRISPR/Cas9 chứa các sgRNA cho 6. Jose-Estanyol M., Gomis-Ruth F. X., and chỉnh sửa có định hướng gen GmHyPRP1 đã được Puigdomenech P. (2004). The eight-cysteine motif, a thiết kế thành công. Sự thành công của nghiên cứu versatile structure in plant proteins. Plant Physiol. này sẽ là nguồn cung cấp hệ thống cấu trúc vector Biochem, 42, 355–365. cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 nhằm cải thiện khả 7. Gain U (2018). Vietnam—oilseeds and năng đáp ứng của cây đậu tương với các stress phi products annual 2018, Global agricultural sinh học bằng phương pháp biến nạp gen thông qua information network (Gain) report VM8018, USDA vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Gain, Hanoi, Vietnam. LỜI CẢM ƠN 8. Hakeem U. R. K., Öztürk M., Ahmad P., Công trình nghiên cứu được thực hiện trong Memon A. R. (2012). Biotechnology as an aid for khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu bước đầu tạo cây đậu crop improvement to overcome food shortage. Crop tương tăng cường khả năng chịu hạn bằng kỹ thuật Production for Agricultural Improvement, 239-261. CRISPR/Cas9” theo Quyết định số 617/QĐ-KHNN- 9. Li J., Ouyang B., Wang T., Luo Z., Yang C., Li KH ngày 31/7/2019 của Giám đốc Viện Khoa học H., Sima W., Zhang J., Ye Z. (2016). HyPRP1 gene Nông nghiệp Việt Nam về việc Phê duyệt danh mục suppressed by multiple stresses plays a negative role các nhiệm vụ thường xuyên Phòng thí nghiệm Trọng in abiotic stress tolerance in tomato. Frontiers in điểm Công nghệ Tế bào thực vật thực hiện từ năm Plant Science, 7: 967. 2019. Công trình nghiên cứu được đồng tài trợ bởi 10. Manavalan L. P., Guttikonda S. K., Tran L. S., Quỹ Nghiên cứu Quốc gia Hàn Quốc (Mã số Đề tài Nguyen, H. T. (2009). Physiological and molecular NRF 2020M3A9I4038352 và 2020R1A6A1A03044344). approaches to improve drought resistance in soybean. Plant Cell Physiol, 50(7): 1260-1276. TÀI LIỆU THAM KHẢO 11. Werner S., Engler C., Weber E., Gruetzner 1. Abdel Latef A., Jan S., Allah E., Rashid B., R., Marillonnet S. (2012). Fast track assembly of John R., Ahmad P. (2015). Soybean under abiotic multigene constructs using Golden Gate cloning and stress. Proteomic approach, 28–42. the MoClo system. Bioeng Bugs, 3(1): 38-43. 16 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CONSTRUCTION OF THE CRISPR/Cas9 VECTOR SYSTEM FOR EDITING GmHyPRP1, A SOYBEAN GENE RELATES TO MULTIPLE ABIOTIC STRESS TOLERANCE Nguyen Huu Kien1,a, Vu Van Tien1,2,a, Nguyen Trung Anh1, Le Thi Mai Huong1, Doan Thi Hai Duong2, Dinh Thi Mai Thu1, Nguyen Thi Hoa1, Tong Thi Huong1, Dinh Thi Thu Ngan1, Pham Xuan Hoi1, Jae-Yean Kim2,*, Nguyen Van Dong1,* 1 National Key Laboratory for Plant Cell Biotechnology, Agricultural Genetics Institute, Vietnam Academy of Agricultural Sciences, Hanoi, Vietnam 2 Division of Applied Life Science (BK21 program), Plant Molecular Biology and Biotechnology Research Center, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Republic of Korea. a Equally contributed * Email: kimjaeyean@gmail.com; dongjircas@yahoo.com Summary Abiotic stresses such as, drought, high soil salinity, cold, high temperature, and heavy metal toxicity are commonly adverse environmental conditions that affect and limit crop productivity worldwide. Soybean (Glycine max L.) is also one of the plants severely affected by abiotic stresses. Recently, the CRISPR/Cas9- based genome editing technology is known as a useful tool for precisely editing genes of interests in plants. GmHyPRP1 has been predicted as a negative regulator gene for abiotic stresses and may play an important role in improving plant response to abiotic stresses by inactivating or loss-of-function of this gene. Thus, we conducted constructing a vector system for expressing CRISPR/Cas9 and sgRNAs for editing of GmHyPRP1 gene with the aim of improving soybean plants that could tolerate mutiple abiotic stresses. Keywords: Abiotic stress, CRISPR/Cas9, HyPRP protein, PCR, soybean, multi-stress tolerance. Người phản biện: TS. Nguyễn Xuân Thắng Ngày nhận bài: 14/7/2020 Ngày thông qua phản biện: 14/8/2020 Ngày duyệt đăng: 21/8/2020 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 12/2020 17