Threonine 612 quyết định đặc điểm của chuỗi nucleotid giả định hình thành kênh ion của TMEM16E /GDD1/Ano5

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> THREONINE 612 QUYẾT ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM CỦA CHUỖI NUCLEOTID<br /> GIẢ ĐỊNH HÌNH THÀNH KÊNH ION CỦA TMEM16E /GDD1/Ano5<br /> Tạ Tố Trân*, Kei Tobiume**, Chikara Hirono***, Nobuyuki Kamata**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Xác định TMEM16E có chức năng là kênh CaCC như protein TMEM16A trong cùng nhóm hay<br /> không.<br /> Phương pháp nghiên cứu: so sánh dòng điện đo được từ tế bào mang TMEM16E-GFP với tế bào mang<br /> TMEM16A-GFP ngoại sinh cũng như tế bào mang chimera nhân tạo<br /> Kết quả: TMEM16E không có chức năng là một CaCC giống như TMEM16A và chuỗi nucleotide được cho<br /> là hình thành kênh ion ở TMEM16E chỉ cho phép ion Chloride đi qua khi tạo thêm đột biến điểm Thr612Cys.<br /> Kết luận: Threonine612 quyết định đặc điểm của chuỗi nucleotid giả định hình thành kênh ion của<br /> TMEM16E /GDD1/Ano5.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> THREONINE612 DEFINES THE PUTATVE CHANNEL PORE-FORMING DOMAIN CHARACTER OF<br /> TMEM16E/GDD1/Ano5<br /> Ta To Tran, Kei Tobiume, Chikara Hirono, Nobuyuki Kamata<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 164 - 170<br /> Objective: to determine whether TMEM16E functions as CaCC, similar to TMEM16A<br /> Methods: comparing the currents consulted from HEK293T cells expressing exogenous TMEM16E-GFP to<br /> cells expressing exogenous TMEM16A-GFP or constructed chimeras.<br /> Results: TMEM16E is not equivalent to TMEM16A in functioning as CaCC and the putative pore-forming<br /> domain of TMEM16E could transit ion chloride only with additional Thr612Cys mutation.<br /> Conclusion: The putative channel pore-forming domain of TMEM16E determines its specific character<br /> through Threonine 612.<br /> Key words: GDD, TMEM16, CaCC<br /> <br /> GIỚI THIỆU<br /> Loạn sản xương hàm-thân xương dài<br /> (Gnathodiaphyseal dysplasia, GDD) là một bệnh<br /> di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, đặc<br /> trưng bởi loạn sản ở xương hàm, xương dài cong<br /> và dễ gãy, sự dày lên của vỏ thân xương dài(1,10).<br /> Từ năm 2003, nhóm nghiên cứu đã tìm được<br /> nguyên nhân gây bệnh GDD nằm tại vị trí<br /> <br /> nhiễm sắc thể 11p14.3-15.1 và xác định được<br /> điểm đột biến gây bệnh(11,12). Nhóm đặt tên gen<br /> mới là GDD1. GDD1 còn có tên là<br /> TMEM16E/Ano5(4), thuộc nhóm protein TMEM16<br /> do có tám đoạn nucleotide xuyên màng. Đột<br /> biến gây bệnh GDD trên TMEM16E<br /> (TMEM16Egdd) giải mã Cystein356Argrinin (phát<br /> hiện ở các bệnh nhân người Nhật) hoặc<br /> Cystein356Glycin (phát hiện ở các bệnh nhân<br /> <br /> * Bộ môn PTM- Khoa RHM- Đại học Y Dược TP HCM<br /> ** Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Graduate School of Biomedical and Health Sciences,<br /> Hiroshima University, Hiroshima, Japan<br /> *** Department of Physiology and Oral Physiology, Graduate School of Biomedical and Health Sciences,<br /> Hiroshima University, Hiroshima, Japan<br /> Tác giả liên lạc: TS Tạ Tố Trân<br /> ĐT: 0913632526<br /> Email: totrandent@yahoo.com<br /> <br /> 164<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> người Mỹ gốc Phi). Nghiên cứu hóa mô miễn<br /> dịch trên các mô của chuột chỉ phát hiện protein<br /> TMEM16E ở mô cơ và mô xương(6). Tầm quan<br /> trọng về mặt sinh lý của TMEM16E trên mô cơ<br /> càng rõ nét khi TMEM16E mất chức năng hoặc<br /> không tồn tại là nguyên gây bệnh loạn dưỡng cơ<br /> (LGMD2L) và bệnh cơ Miyoshi (MMD3)(2). Một<br /> số đột biến lặn (gây kết thúc mã hóa sớm) được<br /> tìm thấy trong các bệnh về cơ này và những<br /> bệnh nhân có bộ gen là dị hợp tử của các đột<br /> biến này.<br /> Mặc dù đột biến gen TMEM16E gây những<br /> bệnh tại mô chuyên biệt đã rõ nhưng chức năng<br /> của protein TMEM16E vẫn chưa được xác định.<br /> Trong cùng nhóm, TMEM16A là protein đầu<br /> tiên được xác định là kênh chloride-hoạt hóa bởi<br /> calci(3,9,13) (Calci activated Chloride Channel,<br /> CaCC), sau đó đến TMEM16B(8) và TMEM16F(7).<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát<br /> khả năng TMEM16E là kênh chloride-hoạt hóa<br /> bởi calci, giống TMEM16A hay không. Do<br /> TMEM16E, được biểu hiện trong tế bào<br /> HEK293T, không nằm trên màng tế bào nên<br /> chúng tôi đã đưa đoạn nucleotide giữa<br /> nucleotide xuyên màng thứ năm và thứ sáu của<br /> TMEM16E lên màng tế bào bằng phương pháp<br /> tạo chimera (A5E6A) với TMEM16A. Tuy nhiên,<br /> chimera AEA cũng không tạo được dòng điện<br /> trừ khi tạo thêm đột biến Threonin612Cystein.<br /> Kết quả này gợi ý Threonin612 quyết định đặc<br /> điểm của chuỗi nucleotide giả định hình thành<br /> kênh ion của TMEM16E /GDD1/Ano5.<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Nuôi cấy tế bào (cell culture): nuôi cấy tế bào<br /> HEK293FT (Invitrogen) và tế bào HEK293T<br /> (ngân hàng RIKEN) trong DMEM (Sigma) 10%<br /> FBS và 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen)<br /> Sự tạo thành plasmid (plasmid construction):<br /> ghép TMEM16E-GFP và TMEM16A-GFP vào<br /> vector pCR8/GW/TOPO (Invitrogen) tạo thành<br /> các plasmid. Tạo chimera bằng cách: tạo enzym<br /> SnaBI và NheI trên cùng vị trí nucleotide xuyên<br /> màng thứ năm và thứ sáu của TMEM16E-GFP<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> và TMEM16A-GFP, cắt nucleotide của những<br /> plasmid này tại các enzym đã tạo và enzym XbaI<br /> của vector. Thu thập những đoạn polypeptide và<br /> ghép chéo chúng với nhau bằng “enzym<br /> ligestion high” (Takara). Xác minh các chuỗi<br /> nucleotide bằng máy phân tích sơ đồ gen 3130xl<br /> Genetic analyzer (ABI). Sau đó, chuyển vector<br /> khung pCR8/GW sang khung plenti6.2-DEST<br /> Gateway (Invitrogen) bằng LR Clonase II enzym<br /> Mix (Invitrogen).<br /> Tạo dòng tế bào bền vững (stable cell<br /> establishing): đưa những pLenti6.2 vector vào tế<br /> bào HEK293FT cùng với plasmid Virapower<br /> Lentiviral Packaging Mix (Invitrogen) và dùng<br /> tác nhân FuGENE 6 (Roche) để tạo virus chứa<br /> các chimera. 48 giờ sau, chiếc xuất dung dịch bề<br /> mặt chứa virus và lây nhiễm vào tế bào<br /> HEK293T sử dụng tác nhân polybrene (Sigma).<br /> Sử dụng Blasticidin (Invitrogen) để loại tế bào<br /> không phơi nhiễm. Sau 1 tuần, những tế bào còn<br /> sống là những tế bào chứa vector mang gen<br /> ngoại sinh hoặc chimera.<br /> Chụp huỳnh quang (fluorescent imaging): mỗi<br /> gen gốc hay chimera đều mang đoạn gen GFP<br /> phát huỳnh quang. Nuôi cấy tế bào trong đĩa<br /> 24 giếng, đáy kính (IWAKI) và quan sát dưới<br /> kính hiển vi laser cắt lớp FV10i (OLYPUS)<br /> hoặc kính hiển vi huỳnh quang (KEYENCE)<br /> độ phóng đại 60X.<br /> Đo dòng điện tế bào bằng phương pháp toàn vẹn<br /> tế bào (Patch-clamp recordings): nuôi cấy tế bào<br /> HEK293T mang các gen nghiên cứu trên những<br /> tấm kính rất nhỏ một cách rời rạc hai ngày trước<br /> khi đo dòng điện để tế bào bám vào mặt kính<br /> vừa đủ. Sau đó di chuyển tấm kính lên kính hiển<br /> vi nổi và đo bằng các công cụ chuyên biệt trong<br /> đó, pipet vừa tiếp xúc và phá vỡ một phần màng<br /> tế bào và kết nối với màng tế bào thành một thể<br /> thống nhất. Dung dịch bên ngoài tế bào (120mM<br /> NMDG-Cl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2, 120mM<br /> Mannit và 10mM NMDG-HEPES (pH 7,4)),<br /> dung dịch bên trong tế bào hay dung dịch trong<br /> pipet “có hiện diện Ca2+” (120mM NMDG-Cl,<br /> 3,5mM CaCl2, 5mM EGTA-NMDG, 50mM<br /> <br /> 165<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Mannit, 2mM ATP-Hemi muối Mg, 10mM<br /> NMDG-HEPES (pH 7,4)) và “không hiện diện<br /> Ca2+” (120mM NMDG-Cl, 10mM NMDG-EGTA,<br /> 50mM Mannit, 2mM ATP-Hemi muối Mg,<br /> 10mM NMDG-HEPES (pH 7,4)). Điện thế màng<br /> được giữ ở 0mV. Sau khi kết nối pipet với màng<br /> tế bào thành một thể thống nhất, đo dòng điện ở<br /> +100mV và -100mV bằng cách thay đổi điện thế<br /> màng tế bào đến những điện thế cần đo và giữ<br /> trong 1 giây, mỗi lần đo cách nhau 10 giây.<br /> Những chi tiết khác được thực hiện giống<br /> nghiên cứu trước(5,8).<br /> Phân tích thống kê: sử dụng test Tukey để so<br /> sánh các trung bình nhóm.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> TMEM16E ngoại sinh trong tế bào<br /> HEK293T không có hoạt tính kênh<br /> chloride-hoạt hóa bởi calci<br /> Do TMEM16A là protein đầu tiên trong<br /> nhóm TMEM16 được phát hiện có chức năng<br /> kênh chloride-hoạt hóa bởi calci, chúng tôi đánh<br /> giá xem TMEM16E có cùng chức năng như<br /> TMEM16A hay không. Khi đo điện thế ở màng<br /> tế bào bằng phương pháp toàn vẹn tế bào, tế bào<br /> HEK293T mang TMEM16A-GFP tạo dòng điện<br /> rõ ràng theo hướng từ trong ra ngoài màng (hình<br /> 1A) và cho hình ảnh đặc trưng của một kênh<br /> chloride-hoạt hóa bởi calci, phụ thuộc điện thế<br /> và phụ thuộc calci (hình 1B). Ngược lại, tế bào<br /> mang TMEM16E-GFP không cho bất kỳ dòng<br /> điện nào khi có hoặc không có calci hiện diện<br /> trong dung dịch pipet, tương tự như tế bào<br /> mang GFP (hình 1).<br /> <br /> TMEM16E tồn tại bên trong tế bào nhưng<br /> chimera với TMEM16A có thể di chuyển<br /> lên màng tế bào<br /> Hình ảnh chụp dưới kính hiển vi cho thấy<br /> TMEM16E-GFP tồn tại tại bên trong tế bào (hình<br /> 2A). Do phương pháp đo dòng điện được sử<br /> dụng trong nghiên cứu này chỉ đo được những<br /> kênh chloride nằm trên màng tế bào nên vị trí<br /> của TMEM16E có thể ảnh hưởng đến kết quả<br /> <br /> 166<br /> <br /> trên. Tiếp theo, chúng tôi cố di chuyển<br /> TMEM16E lên màng tế bào bằng cách trao đổi<br /> các đoạn polypeptide của gen này với<br /> TMEM16A. Chúng tôi thành công trong việc di<br /> chuyển đoạn polypeptide, được cho là kênh, nơi<br /> ion ra vào, của TMEM16E lên màng tế bào, đó là<br /> chimera A5E6A-GFP (hình 2A).<br /> <br /> Đoạn polypeptide giả định hình thành<br /> kênh ion của TMEM16E không thay thế<br /> đoạn polypeptide tương ứng của<br /> TMEM16A trong hoạt động như một kênh<br /> chloride-hoạt hóa bởi calci<br /> A5E6A -GFP biểu hiện trên màng tế bào cho<br /> phép đánh giá liệu đoạn polypeptide giả định<br /> hình thành kênh của TMEM16E có khả năng là<br /> kênh chloride không. Chúng tôi so sánh đặc<br /> điểm điện-sinh lý của tế bào mang A5E6A -GFP<br /> với tế bào mang TMEM16A. Tế bào mang A5E6A<br /> -GFP cho dòng điện nhỏ khi đo có và không có<br /> sự hiện diện của Ca2+. Tuy nhiên, dòng điện tại<br /> ±100mV khác biệt không có ý nghĩa so với tế bào<br /> mang GFP, cũng như với tế bào mang<br /> TMEM16A khi đo không có Ca2+ (hình 6B). Kết<br /> quả này cho thấy đoạn polypeptide giả định<br /> hình thành kênh của TMEM16E không có khả<br /> năng là kênh chloride-hoạt hóa bởi calci.<br /> <br /> A5E6A cho dòng điện kênh chloride-hoạt<br /> hóa bởi calci khi tạo đột biến Thr612Cys<br /> trên đoạn polypeptide giả định hình thành<br /> kênh<br /> Khi so sánh amino acid của đoạn gen được<br /> cho là hình thành kênh ion giữa các TMEM16,<br /> TMEM16E có acid amin Thr612 thay vì Cys như<br /> các kênh chloride-hoạt hóa bởi calci khác<br /> (TMEM16A, TMEM16B) (hình 7A). Do đó,<br /> chúng tôi thử thực hiện đột biến Thr612Cys trên<br /> A5E6A-GFP xem có phải sự hiện diện bộ ba Cys<br /> tại đoạn gen này có thể hình thành kênh ion.<br /> Protein A5E6CysA-GFP mới được tạo thành cũng<br /> biểu hiện trên màng tế bào giống A5E6A -GFP<br /> (hình 7A). Khi đo dòng điện, tế bào mang<br /> A5E6CysA-GFP cho dòng điện có dạng kênh<br /> chloride-hoạt hóa bởi calci, giống như của tế bào<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> mang TMEM16A-GFP (hình 7C và E). Để đánh<br /> giá vai trò của Thr612 trong việc hình thành<br /> kênh ion, một lần nữa chúng tôi thực hiện đột<br /> biến Cys635Thr trên TMEM16A-GFP (giãn đồ<br /> hình 7A). Tuy nhiên, TMEM16AThr-GFP biểu<br /> hiện ở màng tế bào giống TMEM16A-GFP (hình<br /> 7A) nhưng không làm thay đổi đặc tính kênh<br /> chloride-hoạt hóa bởi calci (hình 7D). Điều này<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> ngụ ý những polypeptide xung quanh Thr612<br /> của đoạn polypeptide giả định hình thành kênh<br /> này của TMEM16E quyết định khả năng không<br /> là kênh chloride-hoạt hóa bởi calci. Những kết<br /> quả này chỉ ra rằng bản chất TMEM16E có chức<br /> năng khác so với TMEM16A và cấu trúc chuyên<br /> biệt của protein làm cho TMEM16E khác biệt so<br /> với các protein khác trong cùng nhóm.<br /> <br /> Chú giải hình<br /> <br /> Hình 1: Không ghi nhận được Kênh chloride-hoạt hóa bởi calci ở tế bào HEK293T mang TMEM16E ngoại sinh.<br /> A, Biểu đồ đại diện dòng điện theo thời gian đo được ở tế bào mang TMEM16A-GFP, TMEM16E-GFP hoặc<br /> GFP, tương ứng, đo khi có sự hiện diện của Ca2+ trong dung dịch pipet. Điện thế màng được thay đổi từ 0mV đến<br /> ±100mV như biểu đồ đính kèm. B, Dòng điện đo được từ các tế bào tương ứng ở hình A với sự hiện diện (bốn<br /> hình trên) và không có sự hiện diện của Ca2+ (bốn hình dưới) trong dung dịch pipet. Dòng điện được ghi nhận từ<br /> 3 phút sau khi pipet kết nối với màng tế bào thành một thể thống nhất, điện thế màng được thay đổi từ điện thế<br /> chuẩn (0 mV) đến -100 mV và +100 mV như biểu đồ đính kèm.<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> 167<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Hình 2: Vị trí bên trong tế bào có thể là nguyên nhân TMEM16E không là kênh ion. A, Hình chụp dưới kính<br /> hiển vi huỳnh quang tế bào mang TMEM16E-GFP, TMEM16A-GFP và A5E6A-GFP. B, Dòng điện của các tế<br /> bào mang TMEM16A-GFP, A5E6A-GFP và GFP ở ±100mV có (+) hoặc không có (-) sự hiện diện của Ca2+ (trung<br /> bình ± SE, ∗∗p