Thử nghiệm cảm nhiễm bào tử perkinsus olseni vào nghêu bến tre (Meretrix lyrata) bằng phương pháp ngâm

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2017<br /> <br /> THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br /> <br /> THỬ NGHIỆM CẢM NHIỄM BÀO TỬ Perkinsus olseni<br /> VÀO NGHÊU BẾN TRE (Meretrix lyrata) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGÂM<br /> INFECTION OF PARASITES Perkinsus olseni INTO BEN TRE HARD CLAM<br /> (Meretrix lyrata) BY SOAKING METHOD<br /> Phạm Quốc Hùng1, Nguyễn Thị Hồng Nhung1<br /> Ngày nhận bài: 10/3/2017; Ngày phản biện thông qua: 30/6/2017; Ngày duyệt đăng: 25/9/2017<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu được tiến hành với mục đích cảm nhiễm bào tử ký sinh trùng Perkinsus olseni vào nghêu<br /> Bến Tre (Meretrix lyrata) bằng phương pháp ngâm. Thí nghiệm có ba nghiệm thức gồm ngâm nghêu trong 3<br /> lít nước biển 25‰ có bào tử động (2x105 bào tử/mL), bào tử nghỉ (13 bào tử/ml) của P. olseni và nghiệm thức<br /> đối chứng không chứa bào tử. Sau khi ngâm 36 ngày, kết quả ở các nghiệm thức như sau nghêu được ngâm với<br /> bào tử động chết 100%, cường độ nhiễm 200 - 1.500 bào tử/cá thể, tỷ lệ nhiễm 93 ± 4,7%; ngâm với bào tử<br /> nghỉ nghêu chết 100%, cường độ nhiễm 100 - 1.500 bào tử/cá thể, tỷ lệ nhiễm 80 ± 0%.<br /> Từ khóa: bào tử động, bào tử nghỉ, cảm nhiễm, Meretrix lyrata, Perkinsus olseni<br /> ABSTRACT<br /> The study was conducted for the purpose of infected by Perkinsus olseni on Ben Tre clam (Meretrix lyrata)<br /> in experimental conditions. Clams were soaked in 3 liters of sea water containing zoospores (2x105 spores/<br /> mL), hypnospores (13 spores/ml) of P. olseni and control treatment not containing spores. After soaking for 36<br /> days, clams soaked with zoospores had mortality at 100%, infection intensity 200 - 1,500 spores/individuals,<br /> prevalence of 93 ± 4.7%; clams soaked with hypnospore had mortality at 100%, intensity of infection<br /> 100 - 1,500 spores/individual, rate of infection 80 ± 0%.<br /> Keywords: zoospore, hypnospore, infection, Meretrix lyrata, Perkinsus olseni<br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Động vật thân mềm hai mảnh vỏ là nhóm<br /> động vật có tầm quan trọng về kinh tế, tuy vậy<br /> cùng với sự phát triển của nghề nuôi thì dịch<br /> bệnh trên đối tượng này cũng xuất hiện và<br /> bùng phát mạnh hơn trên toàn thế giới. Bệnh<br /> trên động vật thân mềm đã xảy ra trên các đối<br /> tượng khác nhau (hàu, nghêu, trai) gây ra thiệt<br /> hại đáng kể cho nghề nuôi ở nhiều quốc gia<br /> trên thế giới trong đó có Việt Nam.<br /> Kí sinh trùng đơn bào nội ký sinh thuộc<br /> giống Perkinsus là một trong nhiều nguyên<br /> nhân đã gây ra dịch bệnh trên nghêu.<br /> 1<br /> <br /> Bệnh do kí sinh trùng đơn bào Perkinsus<br /> được ghi nhận gây thiệt hại nghiêm trọng<br /> nhất về mặt kinh tế trên phạm vi toàn cầu.<br /> Kí sinh trùng nội ký sinh này đã được báo<br /> cáo gây ra tỷ lệ chết cao và thường xuyên<br /> cho nhiều loài động vật thân mềm (hàu, điệp,<br /> bào ngư, nghêu, vẹm, sò huyết và trai ngọc)<br /> nước mặn có giá trị ở tất cả các châu lục [11].<br /> Cảm nhiễm bởi Perkinsus sp. gây hoại tử<br /> mô, giảm tăng trưởng, giảm khả năng sinh<br /> sản, giảm sự tích trữ năng lượng của mô<br /> vật chủ, và gây ra tỷ lệ chết cao và thường<br /> xuyên cho vật chủ [7, 9].<br /> <br /> Viện Nuôi trồng Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 23<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> Các loài Perkinsus có vòng đời tương tự<br /> nhau với 3 giai đoạn biến thái chính, bao gồm:<br /> thể dinh dưỡng (Trophozoite), bào tử nghỉ<br /> (Hypnospore) và bào tử động (Zoospore). Giai<br /> đoạn thể dinh dưỡng xảy ra trong các mô của<br /> vật chủ còn sống. Nó là một tế bào hình cầu<br /> với một không bào chiếm diện tích lớn trong tế<br /> bào và nhân tế bào ngoại vi nên được gọi là tế<br /> bào nhẫn [11], dinh dưỡng tăng sinh trong mô<br /> và tiến hành phân chia bên trong tế bào vật<br /> chủ. Giai đoạn bào tử nghỉ xuất hiện ở mô của<br /> vật chủ bị nhiễm Perkinsus được ủ trong dung<br /> dịch Fluid Thioglycolate Medium (FTM) [11]<br /> giai đoạn này, thể dinh dưỡng của chúng mở<br /> rộng, thành tế bào phát triển dày lên, hình<br /> thành một giai đoạn phát triển mới gọi là bào<br /> tử nghỉ. Khi bào tử nghỉ được hình thành trong<br /> môi trường FTM sẽ được phân lập và chuyển<br /> vào trong môi trường nước biển, và quá trình<br /> hình thành bào tử động bắt đầu. Giai đoạn bào<br /> tử động xuất hiện trong nước biển. Hàng trăm<br /> bào tử động sẽ hình thành và được phóng thích<br /> ra môi trường ngoài thông qua một hoặc hai<br /> ống nhỏ. Ống này sẽ xuất hiện trên mỗi bào tử<br /> nghỉ trước khi quá trình phân chia tế bào hình<br /> thành bào tử động bên trong diễn ra [4, 6, 8].<br /> Bào tử động mới sử dụng roi để di chuyển<br /> vào vật chủ và lặp lại chu kỳ sống của chúng.<br /> Tất cả các giai đoạn biến thái trong vòng đời<br /> của Perkinsus olseni đều có thể gây bệnh cho<br /> động vật thân mềm [3].<br /> Ở Việt Nam, từ đầu năm 2003 cho đến<br /> nay, hiện tượng động vật thân mềm hai mảnh<br /> vỏ nói chung và nghêu nói riêng liên tục chết<br /> hàng loạt trên diện rộng tại nhiều địa phương<br /> nhưng chưa rõ nguyên nhân đang trở thành<br /> vấn đề quan tâm của người nuôi, nhà khoa học<br /> và nhà quản lý. Các nghiên cứu về bệnh trên<br /> nghêu, đặc biệt là bệnh do P. olseni còn hạn<br /> chế. Hầu hết các kết quả nghiên cứu mới dừng<br /> lại ở mức độ mô tả sự hiện diện của ký sinh<br /> trùng và đánh giá mức độ nhiễm của chúng<br /> trên các đối tượng động vật thân mềm [1, 2].<br /> <br /> 24 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Số 3/2017<br /> Những nghiên cứu về khả năng gây bệnh<br /> và đường truyền lây của P. olseni hầu như<br /> chưa được nhắc đến. Do đó, việc thử<br /> nghiệm cảm nhiễm bào tử ký sinh trùng<br /> P. olseni bằng phương pháp ngâm sẽ tạo điều<br /> kiện thuận lợi hơn cho các nghiên cứu chuyên<br /> sâu trong điều kiện thí nghiệm.<br /> II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Vật liệu nghiên cứu<br /> Nghêu sạch bệnh có nguồn gốc từ huyện<br /> Hòa Bình, tỉnh Bạc Liêu, kích cỡ từ 30 - 50mm<br /> chiều dài. Sau thời gian thuần dưỡng từ 3 - 4<br /> ngày, 20% số lượng cá thể được thu để phân<br /> tích tỷ lệ và cường độ nhiễm Perkinsus olseni<br /> theo phương pháp của Ray (1952). Quần thể<br /> sạch bệnh đạt yêu cầu để thí nghiệm khi có<br /> cường độ nhiễm P. olseni là 0 bào tử/cá thể và<br /> tỷ lệ nhiễm là 0%.<br /> Các cá thể thí nghiệm được cho ăn hỗn<br /> hợp tảo Nannochloropsis oculata và Isochrysis<br /> galbana với tỷ lệ 1 : 1 về thể tích. Tần suất cho<br /> ăn là 2 - 3 lần/ngày với mật độ tảo là 7 - 10 x 105<br /> tế bào/mL.<br /> Bào tử nghỉ P. olseni được chuẩn bị theo<br /> phương pháp của Shimokawa et al (2010). Bào<br /> tử nghỉ được thu từ nghêu nhiễm P. olseni tại<br /> Cần Giờ, thành phố Hồ Chí Minh vào tháng<br /> 2/2016. Nghêu được nuôi cấy nguyên con trong<br /> môi trường FTM có bổ sung Cloramphenicol<br /> (200 µg/ml) và Nystatin (200 IU/ml) trong điều<br /> kiện tối ở nhiệt độ phòng trong 7 - 9 ngày. Cơ<br /> nghêu đã nuôi cấy được ly tâm (5.000 vòng/phút,<br /> trong 10 phút), sau đó phân hủy bằng<br /> Trypsin 10% trong 90 phút ở nhiệt độ phòng.<br /> Bào tử nghỉ được lọc qua lưới lọc 300µm, sau<br /> đó rửa vài lần trong nước biển tiệt trùng.<br /> Bào tử động P. olseni được chuẩn bị bằng<br /> cách đặt bào tử nghỉ vào ống falcon (50 ml)<br /> chứa 30 ml nước biển có nhiệt độ 25ºC, độ<br /> mặn 25‰, pH 7,5 - 8. Khi sự có mặt của bào<br /> tử động được quan sát, chúng sẽ được ly tâm<br /> thu sinh khối trước khi tiêm cho nghêu.<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2017<br /> <br /> Hình 1. Vật liệu nghiên cứu<br /> (A: Nghêu; B: Bào tử nghỉ P. olseni giai đoạn 1 tế bào; B: Bào tử nghỉ P. olseni giai đoạn n tế bào)<br /> <br /> 2. Phương pháp nghiên cứu<br /> 2.1. Bố trí thí nghiệm<br /> Khoảng 2 x 105 bào tử động/mL và 13 bào<br /> tử nghỉ/mL của Perkinsus olseni được cho vào<br /> nước biển trong thùng xốp, thể tích nước là 3 lít<br /> chứa 10 cá thể nghêu không bị nhiễm P. olseni.<br /> Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Ở nghiệm<br /> thức đối chứng, nghêu được ngâm với nước<br /> biển 25‰ đã được xử lý. Hệ thống thí nghiệm<br /> không sục khí suốt quá trình thí nghiệm. Nghêu<br /> không được cho ăn để kích thích quá trình lọc<br /> nước. Nghêu chết được thu mẫu phân tích<br /> cường độ nhiễm Perkinsus bằng phương pháp<br /> nuôi cấy trong môi trường FTM.<br /> 2.2. Theo dõi yếu tố môi trường<br /> Các yếu tố môi trường gồm nhiệt độ, pH<br /> được theo dõi vào 7:00 - 8:00 h và 14:00 15:00 h hằng ngày. Trong đó, nhiệt độ được đo<br /> bằng nhiệt kế với độ chính xác 1ºC, pH được đo<br /> bằng máy đo pH Consort - C3010, độ mặn (‰)<br /> sử dụng tỷ trọng kế với độ chính xác 1‰ trước<br /> khi cấp nước vào thùng xốp trước khi tiến hành<br /> thí nghiệm và khi thay nước (nước được thay<br /> hằng ngày từ 20 - 100% tùy thuộc vào điều<br /> kiện môi trường nuôi).<br /> 2.3. Phân lập Perkinsus<br /> Phương pháp nuôi cấy nguyên con được<br /> dùng để kiểm tra cường độ nhiễm P. olseni của<br /> nghêu trước và sau khi tiến hành thí nghiệm.<br /> Khối mô nuôi cấy được cắt nhỏ và ủ trong các<br /> falcon chứa 20 ml môi trường FTM có bổ sung<br /> Cloramphenicol (200µg/ml) và Nystatin (200IU/<br /> ml). Mẫu được nuôi cấy ở nhiệt độ phòng,<br /> <br /> trong bóng tối, yếm khí. Sau 7 ngày nuôi cấy,<br /> bào tử P. olseni được nuôi cấy bằng cách ly<br /> tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút,<br /> loại bỏ môi trường FTM. Phần thịt nghêu được<br /> phân hủy bằng NaOH 2M ở 600C để tách bào<br /> tử nghỉ khỏi tổ chức mô của nghêu. Quá trình<br /> được thực hiện vài lần cho đến khi phần cơ<br /> được tiêu hủy hoàn toàn. Bào tử được đếm số<br /> lượng để tính cường độ nhiễm bằng kính hiển<br /> vi quang học ở 40x.<br /> Phương pháp tính<br /> Tỷ lệ nhiễm (%) là phần trăm số cá thể<br /> nhiễm bệnh ký sinh trùng Perkinsus olseni so<br /> với số cá thể kiểm tra. Cường độ nhiễm (bào<br /> tử/cá thể) là số lượng bào tử P. olseni trên một<br /> cá thể kiểm tra.<br /> III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Tỷ lệ chết tích lũy khi ngâm nghêu không<br /> bị nhiễm ký sinh trùng Perkinsus olseni trong<br /> nước có chứa bào tử động và bào tử nghỉ<br /> được thể hiện qua Hình 2.<br /> <br /> Hình 2. Tỷ lệ chết cộng dồn của nghêu cảm nhiễm<br /> bằng phương pháp ngâm<br /> <br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 25<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> <br /> Số 3/2017<br /> <br /> Sau 36 ngày của thí nghiệm, tỷ lệ chết tích<br /> lũy của nghiệm thức đối chứng là 46,67%,<br /> ngâm với bào tử động và bào tử nghỉ là 100%.<br /> Nghêu tại các đơn vị thí nghiệm chết rải rác<br /> bắt đầu từ ngày thứ 6 sau khi ngâm. Ở cả hai<br /> thí nghiệm, nghêu được ngâm bào tử nghỉ<br /> hay bào tử động đầu chết tập trung nhiều vào<br /> ngày 12 - 18 sau khi gây nhiễm. Nghêu chết<br /> ở các nghiệm thức không nhận thấy các dấu<br /> hiệu bệnh lý đặc trưng xuất hiện trên các cơ<br /> quan của nghêu, mà chỉ nhận thấy khả năng<br /> lọc thức ăn của nghêu giảm và tiết nhớt.<br /> Sau 36 ngày thí nghiệm ngâm nghêu với<br /> <br /> bào tử động và bào tử nghỉ, nghêu có kết quả<br /> về cường độ nhiễm lần lượt là 1.314 ± 121,5<br /> bào tử/cá thể và 1.050 ± 212,1 bào tử/cá thể<br /> (Bảng 1). Cường độ nhiễm nằm trong khoảng<br /> từ 200 - 1.500 bào tử/cá thể và tỷ lệ cảm nhiễm<br /> là 93 ± 4,7% khi ngâm với bào tử động; cường<br /> độ nhiễm 100 - 1.500 bào tử/cá thể và tỷ lệ<br /> nhiễm là 80 ± 0% khi ngâm bào tử nghỉ. Sau<br /> 9 ngày ngâm bào tử động, nhận thấy có bào<br /> tử ký sinh trùng P. olseni trong mô nghêu nuôi<br /> cấy FTM và sau 11 ngày đối với bào tử nghỉ.<br /> Cường độ nhiễm ký sinh trùng tăng theo thời<br /> gian thí nghiệm ở cả hai nghiệm thức.<br /> <br /> Bảng 1. Cường độ nhiễm của nghêu Số liệu diễn giải giá trị trung bình ± sai số chuẩn<br /> Cường độ nhiễm (bào tử/cá thể)<br /> <br /> Thời gian sau khi<br /> ngâm (ngày)<br /> <br /> Bào tử động<br /> <br /> Bào tử nghỉ<br /> <br /> Đối chứng<br /> <br /> 6<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0<br /> <br /> -<br /> <br /> 12<br /> <br /> 175 ± 125,8<br /> <br /> 57 ± 78,7<br /> <br /> 0<br /> <br /> 18<br /> <br /> 588 ± 172,7<br /> <br /> 333 ± 88,8<br /> <br /> 0<br /> <br /> 24<br /> <br /> 767 ± 186,2<br /> <br /> 857 ± 382,3<br /> <br /> 0<br /> <br /> 30<br /> <br /> 825 ± 485,6<br /> <br /> 1.050 ± 212,1<br /> <br /> 0<br /> <br /> 36<br /> <br /> 1.314 ± 121,5<br /> <br /> -<br /> <br /> 0<br /> <br /> Thực tế, các loài ký sinh trùng có thể tiếp<br /> cận và gây bệnh cho các vật chủ thông qua<br /> con đường thức ăn hoặc được hấp thụ qua<br /> mang và màng áo [11]. Chính vì vậy, gây nhiễm<br /> Perkinsus bằng phương pháp ngâm đã được<br /> nhiều nhà nghiên cứu áp dụng trên hàu C.<br /> virginica [11], nghêu M. lyrata [2], nghêu Manila<br /> [10]. Các nghiên cứu này là cơ sở để chúng<br /> tôi dùng phương pháp ngâm để gây nhiễm P.<br /> olseni cho nghêu M. lyrata.<br /> Theo báo cáo từ các nghiên cứu trước đây,<br /> bào tử nghỉ hay bào tử động của Perkinsus đều<br /> có khả năng gây hại cho động vật thân mềm<br /> trong điều kiện thí nghiệm. Cụ thể, Ngô Thị<br /> Ngọc Thủy (2011) đã cho thấy nghêu M. lyrata<br /> khi được ngâm 146 bào tử/mL, 73 bào tử/mL,<br /> 36,5 bào tử/mL đã có tỷ lệ nhiễm lần lượt là<br /> 51,82%, 22,54% và 36,07%. Shimokawa et<br /> al (2010) cũng xác định khả năng gây nhiễm<br /> của túi bào tử động P. olseni trên nghêu<br /> Manila bằng phương pháp ngâm trong 6 ngày.<br /> <br /> 26 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br /> <br /> Tác giả đã chỉ ra liều gây chết của loại ký sinh<br /> trùng này là khoảng 107 bào tử/g thịt nghêu.<br /> Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở Bảng 1 và<br /> Hình 1 cũng cho thấy cường độ nhiễm sau khi<br /> cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm, bào tử<br /> động có cường độ nhiễm (1.314 ± 121,5 bào<br /> tử/cá thể) cao hơn so với ngâm bào tử nghỉ<br /> (1.050 ± 212,1 bào tử/cá thể). Nghêu ngâm với<br /> bào tử nghỉ có thời gian chết sau khi gây nhiễm<br /> với tỷ lệ 100% sớm hơn (30 ngày) so với bào<br /> tử động (36 ngày).<br /> Ký sinh trùng nội ký sinh phải vượt qua<br /> rất nhiều rào cản và chịu đựng sự loại thải,<br /> tiêu diệt của hệ miễn dịch để có thể gây bệnh<br /> cho vật chủ [5]. Theo các nhà nghiên cứu, tất<br /> cả các giai đoạn biến thái trong vòng đời của<br /> P. olseni đều có thể gây bệnh cho động vật<br /> thân mềm [3]. Điều này đã được chứng<br /> minh bằng các thí nghiệm gây bệnh thực<br /> nghiệm bằng thể dinh dưỡng, bào tử nghỉ<br /> và bào tử động Perkinsus spp. trên hàu [5].<br /> <br /> Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br /> Hàu được tiêm P. marinus thể dinh dưỡng dẫn<br /> đến tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm cao hơn<br /> hàu tiêm bào tử nghỉ tuy nhiên khi xét đến sự<br /> thay đổi các chỉ tiêu sinh học thì bào tử nghỉ<br /> gây ra những biến đổi lớn hơn so với thể dinh<br /> dưỡng. Nghiên cứu này cũng đã cho thấy bào<br /> tử nghỉ hay bào tử động của P. olseni đều<br /> có khả năng gây nhiễm cho nghêu M. lyrata.<br /> Chintala et al (2002) đã thí nghiệm cảm nhiễm<br /> P. marinus của hàu Crassostrea virginica bằng<br /> các phương pháp cho ăn, tiêm vào xoang<br /> màng áo, đặt ống trong ruột và tiêm cơ khép<br /> vỏ với mật độ P. marinus ban đầu là 106 tế bào<br /> pha log/g mô ướt. Kết quả cho thấy cường độ<br /> nhiễm ký sinh trùng giảm dần theo các phương<br /> <br /> Số 3/2017<br /> pháp tiêm vào cơ khép vỏ, xoang màng áo, đặt<br /> ống trong ruột và cho ăn. Ngoài ra, thí nghiệm<br /> cũng cho thấy màng áo, mang và ruột chính là<br /> cơ quan nhiễm P. marinus đầu tiên của hàu C.<br /> Virginica.<br /> IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ<br /> Ký sinh trùng Perkinsus olseni có thể cảm<br /> nhiễm lên nghêu bằng phương pháp ngâm khi<br /> sử dụng bào tử động và bào tử nghỉ. Nghiên<br /> cứu chỉ sử dụng một phương pháp để cảm<br /> nhiễm, do đó, để có thể tìm ra phương pháp<br /> hiệu quả nhất để gây nhiễm ký sinh trùng<br /> P. olseni trên nghêu còn cần những nghiên<br /> cứu với các phương pháp cảm nhiễm khác.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Tiếng Việt<br /> 1.<br /> <br /> Ngô Thị Thu Thảo, 2008. Một số đặc điểm của ký sinh trùng Perkinsus sp. Lây nhiễm trên nghêu lụa Paphia<br /> undulata ở Kiên Giang và Bà Rịa - Vũng Tàu. Tạp chí Khoa học. Trường Đại học Cần Thơ, 2008 (1), 222-230.<br /> <br /> 2.<br /> <br /> Ngô Thị Ngọc Thủy 2011. Điều tra, nghiên cứu bệnh trên một số đối tượng nhuyễn thể nuôi tại vùng ven biển<br /> Cà Mau Việt Nam.<br /> Tiếng Anh<br /> <br /> 3.<br /> <br /> Aswani, K & Chu, FLE, 1994. Comparison of infectivity of pathogenicity of meront and Prezoosporangiae<br /> stages of the oyster pathogen Perkinsus marinus in eastern oysters, Crassostrea virginica. Journal of Shellfish<br /> Research, 13(2), 521-527.<br /> <br /> 4.<br /> <br /> Azevedo, C, 1989. Fine structure of Perkinsus atlanticus n. sp. (Apicomplexa, Perkinsea) parasite of clams,<br /> Ruditapes decussatus, from Portugal. Journal of Parasitology, 75, 627-635.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> Chintala, MM, David, B & Susan, EF, 2002. Comparison of in vitro-cultured and wild-type Perkinsus marinus.<br /> II. Dosing methods and host response. Deseases of aquatic organisms, 51, 203-216.<br /> <br /> 6.<br /> <br /> Lester, RJG & Davis, GHG 1981. A new Perkinsus species (Apicomplexa, Perkinsea) from the abalone Haliotis<br /> ruber. Journal of Invertebrate Pathology, 37, 181-187.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> Mackin, JG & Hopkins, SH 1962. Studies on oyster mortality in relation to natural environments and to oil fields<br /> in Louisiana, University of Texas Institute of Marine Science.<br /> <br /> 8.<br /> <br /> McLaughlin, MS, Tall, DB, Shaheen, A, Elsayed, EE & Faisal, M 2000. Zoosporulation of a new Perkinsus<br /> species isolated from the gills of the softshell clam Mya arenari. Parasite, 7, 115-122.<br /> <br /> 9.<br /> <br /> Park, KI & Choi, KS 2001. Spatial distribution of the protozoan parasite Perkinsus sp. found in the Manila<br /> clams, Ruditapes philippinarum, in Korea. Aquaculture, 203, 9-22.<br /> <br /> 10. Shimokawa, J, Yoshinaga, T & Ogawa, K 2010. Experimental evaluation of the pathogenicity of Perkinsus<br /> olseni in juvenile Manila clams Ruditapes philippinarum. Journal of Invertebrate Pathology, 105, 347-351.<br /> 11. Villalba, A, Casas, SM, Figueras, A, Ordás, CM & Reece, KS 2004. Perkinsosis in molluscs: A review. Aquatic<br /> Living Resources, 17, 411-432<br /> TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 27<br /> <br />