Thử nghiệm tạo hạt từ miễn dịch phân tách tế bào lympho T ứng dụng trong ghép tủy

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, hạt nano từ tính được gắn với kháng thể kháng tế bào T nhằm tạo hạt từ miễn dịch phân tách tế bào Jurkat T ra khỏi môi trường nuôi cấy. Kháng thể được gắn định hướng lên bề mặt hạt từ -NH2 thông qua liên kết với protein A/G, một protein có khả năng bắt đặc hiệu vùng Fc của kháng thể.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Thử nghiệm tạo hạt từ miễn dịch phân tách tế bào lympho T ứng dụng trong ghép tủy

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học THỬ NGHIỆM TẠO HẠT TỪ MIỄN DỊCH PHÂN TÁCH TẾ BÀO LYMPHO T ỨNG DỤNG TRONG GHÉP TỦY Trần Văn Thuận* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: singapore379@gmail.com TÓM TẮT Hiện nay, biến chứng vật ghép chống chủ (GVHD) là rào cản lớn nhất của ứng dụng ghép tủy đồng loài trong điều trị các bệnh ung thư máu, gây ra bởi các tế bào T của người cho tấn công tế bào của người nhận. Do đó, loại bỏ tế bào T trước khi cấy ghép là điều rất cần thiết. Kỹ thuật phân tách tế bào dựa vào từ tính (MACS) để loại bỏ tế bào lympho T là một trong những giải pháp hiệu quả nhất nhằm ngăn ngừa GVHD. Trong nghiên cứu này, hạt nano từ tính được gắn với kháng thể kháng tế bào T nhằm tạo hạt từ miễn dịch phân tách tế bào Jurkat T ra khỏi môi trường nuôi cấy. Kháng thể được gắn định hướng lên bề mặt hạt từ -NH2 thông qua liên kết với protein A/G, một protein có khả năng bắt đặc hiệu vùng Fc của kháng thể. SPDP được sử dụng để tạo cầu nối cộng hóa trị giữa gốc amine trên bề mặt hạt từ và protein A/G. Hạt nano từ tính có khả năng gắn được 71 μg protein A/G, 26 μg kháng thể trên một mg hạt từ. Hạt từ miễn dịch phân tách được 85,56% riêng lẻ tế bào Jurkat T. Từ khóa: Hạt nano, hạt từ miễn dịch, phân tách tế bào lympho T, ghép tủy, protein A/G, kháng thể kháng tế bào T. ASSAY OF PRODUCING IMMUNOMAGNETIC NANOPARTICLES TO REMOVE T CELLS FOR APPLICATION OF BONE MARROW TRANSPLANTATION Tran Van Thuan* University of Science – VNU Ho Chi Minh City *Corresponding Author: singapore379@gmail.com ABSTRACT Currently, Graft-Versus-Host Disease (GVHD) is the major barrier to allogeneic bone marrow transplantation for hematopoietic disorders treatment, caused by undesired responses of donor’s T cells to the recipient’s cells. Therefore, T cell depletion prior to transplant is unmet need. Magnet-Activated Cell Sorting (MACS) for T cells removal is one of the most effective methods to prevent GVHD. In this study, magnetic nanoparticles were conjugated with anti-T cell antibodies to produce immunomagnetic particles for separation of Jurkat T cells from cell culture medium. Anti-Jurkat T antibodies were oriented on -NH2 magnetic nanoparticles’ surface through recombinant protein A/G, which is an antibody’s Fc binding protein. SPDP formed a covalent bound between amine groups on the particle’s surface and amine groups of protein molecules. Approximately, 71 μg of protein A/G and 26 μg of antibody were immobilized on one mg of magnetic beads. The immunomagnetic nanoparticles could remove 85.56% of Jurkat T cells from cell culture. Keywords: Nanoparticles, immunomagnetic nanoparticles, T cell depletion, bone marrow transplantation, protein A/G, anti-T cell antibodies. 140
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học TỔNG QUAN toàn và ít bị tái phát lại sau khi cấy ghép. Ngày nay, các vật liệu nano ngày càng Tuy nhiên, trở ngại lớn nhất của cấy ghép được quan tâm và ứng dụng trong nhiều đồng loài chính là biến chứng vật ghép lĩnh vực, đặc biệt là trong lĩnh vực y sinh chống chủ (Graft-Versus-Host Disease – học. Điều này đã mở ra thêm nhiều giải GVHD) sau khi cấy ghép, gây ra nhiều pháp hiệu quả để giải quyết các vấn đề hậu quả nghiêm trọng và có thể dẫn đến còn tồn đọng trong nghiên cứu lẫn lâm tử vong. Theo nhiều nghiên cứu gần đây sàng. Trong các ứng dụng của hạt nano, cho thấy, sự hiện diện tế bào lympho T ứng dụng phân tách tế bào là một ứng trong tủy ghép là nguyên nhân chính dẫn dụng tiêu biểu của hạt nano từ tính trong đến các đáp ứng miễn dịch bất lợi gây ra y sinh học (Corchero and Villaverde tổn thương nghiêm trọng đối với người 2009, Shubayev, Pisanic II et al. 2009). nhận tủy ghép (Ferrara, Levine et al. Kỹ thuật phân tách tế bào dựa vào từ tính 2009). Vì vậy, việc loại bỏ tế bào lympho (Magnet-Activated Cell Sorting – T trong tủy ghép là điều rất cần thiết nhằm MACS) là kỹ thuật phân tách dựa trên đặc ngăn ngừa GVHD. điểm sinh hóa của tế bào. So sánh với các Tại Việt Nam, việc nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tách khác, MACS có tính kỹ thuật MACS trong cấy ghép tủy xương chọn lọc và độ đặc hiệu cao hơn do sự cũng đang được quan tâm. Đi đầu trong tương tác đặc hiệu giữa kháng thể và dấu nghiên cứu về hạt từ miễn dịch của cả ấn trên bề mặt tế bào. Đồng thời, MACS nước, trường Đại học Khoa học Tự nhiên có tốc độ phân tách nhanh, dễ dàng thu - Đại học Quốc gia TP.HCM đã thực hiện hồi tế bào sau khi phân tách, thao tác đơn đề tài nghiên cứu “Bước đầu xây dựng giản và không quá tốn kém so với các quy trình ứng dụng hạt nano từ tính phương pháp dựa trên đặc điểm sinh hóa Fe3O4@SiO2 để loại bỏ tế bào lympho T” khác như: cột sắc kí ái lực và đánh dấu do Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử huỳnh quang (Plouffe, Murthy et al. và Môi trường phối hợp với Bộ môn Vật 2014). Với các đặc điểm trên, MACS liệu từ Y sinh thực hiện đã đạt được được sử dụng phổ biến trong việc phân những kết quả nhất định. Tuy nhiên, hiệu tách tế bào T trong cấy ghép tủy xương, quả phân tách của hạt từ miễn dịch này hỗ trợ điều trị các bệnh lý liên quan đến chưa cao, chưa thể áp dụng cho các huyết học. nghiên cứu sâu hơn sau này (Ta, Trinh et Ghép tủy là phương pháp sử dụng các tế al. 2016). Do đó mục tiêu đề tài này bào gốc máu khỏe mạnh để thay thế các hướng đến là tạo hạt từ miễn dịch có khả tế bào gốc hư hỏng. Đến nay phương năng phân tách tế bào đạt hiệu quả cao pháp ghép tủy xương cùng với xạ trị, hóa hơn bằng hạt từ có nhóm chức –NH2 trên trị đã mang lại niềm hi vọng cho các bệnh bề mặt thay thế nhóm –CDI trước đó. Đề nhân mắc các bệnh huyết học (ung thư tài nghiên cứu gồm có hai nội dung chính bạch cầu/leukemia, ung thư lympho được thực hiện nối tiếp nhau như sau: tạo bào/lymphoma, ung thư tế bào dòng hạt từ miễn dịch với quy trình có các tủy/myeloma,...), di truyền, suy giảm thông số tối ưu; đánh giá khả năng phân miễn dịch, và các bệnh ung thư khác. Dựa tách tế bào trong quần thể tế bào Jurkat T. vào đối tượng cho tế bào gốc tạo máu, Hạt từ miễn dịch được tạo thành bằng ghép tủy được chia làm hai loại là ghép cách cố định vùng Fc của kháng thể tủy tự thân và ghép tủy đồng loài. Trong kháng tế bào T lên bề mặt hạt từ -NH2 đó, ghép tủy đồng loài ngày càng được thông qua protein A/G. Protein A/G được quan tâm do bệnh nhân hồi phục hoàn tạo liên kết cộng hóa trị với hạt từ -NH2 141
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học thông qua SPDP (N-succinimidyl 3-(2- 30 phút. Tiếp theo, hạt từ sẽ được đảo 40 pyridyldithio) propionate)- nhân tố tạo μg/ml BSA cũng đã được phản ứng với cầu nối hóa học được sử dụng để tạo liên 7,25 μg SPDP trong 18h ở các nhiệt độ kết cộng hóa trị giữa hai nhóm -NH2 và khảo sát (10°C và 25°C). Phần hạt từ và có liên kết S-S (disulfide) có thể được cắt phần dịch sau phản ứng được tách ra bằng bởi dithiothreitol (DTT) hoặc những chất nam châm. Sử dụng dung dịch glycine khử khác tạo thành gốc chức -SH ở đầu (pH 2,5) rửa phần hạt nhằm loại protein phân tử. Sau đó, hạt từ miễn dịch sẽ được liên kết yếu với hạt từ. Liên kết giữa hạt đánh giá khả năng phân tách riêng lẻ tế từ và protein BSA sẽ được đánh giá bằng bào lympho T trong quần thể tế bào. SDS-PAGE. Tạo liên kết giữa hạt từ và protein A/G NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG Protein A/G được gắn với hạt từ dựa theo PHÁP NGHIÊN CỨU các thông số tối ưu đã được khảo sát ở các Nguyên liệu thí nghiệm gắn protein BSA và hạt từ với Hạt nano từ tính Fe3O4@SiO2-NH2 sử qui trình tương tự. Sau đó, liên kết hạt từ dụng trong đề tài được cung cấp bởi bộ và protein A/G sẽ đánh giá bằng SDS- môn Vật liệu từ và Y sinh, khoa Khoa học PAGE. Lượng protein A/G liên kết với Vật liệu, trường Đại học Khoa học Tự hạt từ (M) được định lượng gián tiếp bằng nhiên, ĐHQG TP.HCM. Protein A/G phương pháp Bradford tương tự với công (cung cấp bởi Bio basic Inc.) được gắn lên thức (1). hạt từ bằng SPDP (cung cấp bởi Sigma- Tạo hạt từ miễn dịch Aldrich) nhằm cố định định hướng kháng Kháng thể đa dòng kháng CD3 được pha thể kháng protein CD3 lên hạt từ. Kháng trong dung dịch tris-buffered salin with thể kháng CD3 thử nghiệm trong phân Tween20 (TBST) ở các nồng độ 10, 30, tách tế bào T là kháng thể đa dòng được 50, 70, 90 μg/ml được cho đảo nhẹ với cung cấp bởi Bộ môn Công nghệ Sinh 0,25 mg hạt từ-pA/G trong 1h ở 4°C. Sau học Phân tử và Môi trường. đó, phần hạt được tách ra bằng nam châm Tế bào Jurkat T (nguồn gốc từ ATCC) là và rửa bằng TBST. Dung ly kháng thể ra các dòng tế bào mô hình được sử dụng để khỏi hạt từ-pA/G bằng dung dịch glycine đánh giá khả năng phân tách riêng lẻ tế (pH 2,5). Dịch dung ly sẽ được trung hòa bào T của hạt từ miễn dịch và được nuôi bằng Tris-HCl (pH 9) với tỷ lệ 10:1 và trong môi trường RPMI-1640 (mua từ tổng lượng kháng thể gắn lên 1 mg hạt từ- Himedia) chứa 10% FBS (cung cấp bởi pA/G (XG) được định lượng trực tiếp Sigma-Aldrich) trong điều kiện 37oC, 5% bằng phương pháp Bradford. CO2. Đánh giá khả năng phân tách riêng lẻ tế Phương pháp bào Jurkat T của hạt từ miễn dịch Tối ưu thông số gắn protein lên hạt từ Chuẩn bị tế bào Jurkat T trong dịch Do sự giới hạn của protein A/G, nghiên phosphat buffer saline (PBS) chứa 1% cứu sử dụng protein BSA thay thế trong BSA và 2 mM EDTA vào với lượng xấp quá trình khảo sát. Hòa 0,25 mg hạt nano xỉ 3x105 tế bào/ml. Hòa 1 ml tế bào vào từ tính vào 1 ml dung dịch phosphate eppendorf chứa 0,25 mg hạt từ miễn dịch, buffer saline chứa 150 mM NaCl, 1 mM huyền phù đảo ở điều kiện 25oC trong 40 EDTA, 0,02% sodium azide (pH 7,5). phút. Dùng nam châm để tách hỗn hợp Sau đó, hạt từ được cho phản ứng với các thành hai pha: Pha hạt và pha dịch, hút lượng SPDP khác nhau (10, 20, 30, 40, 50 pha dịch vào một eppendorf khác. Tiến μg) trong 30 hoặc 60 phút rồi được xử lý hành đếm tế bào ở pha dịch bằng buồng bằng dithiothreitol (DTT) 50 mM trong đếm hồng cầu với dung dịch Trypan Blue. 142
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học Lượng tế bào trong pha hạt bằng hiệu số số tế bào ban đầu. của số tế bào ban đầu trừ cho số tế bào trong pha dịch. Khả năng phân tách tế bào KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN của hạt từ miễn dịch được tính dựa trên Tối ưu thông số gắn protein lên hạt từ phần trăm tế bào trong pha hạt so với tổng Hình 1. Lượng BSA gắn lên 1 mg hạt từ theo các thông số khảo sát (μg) a. Khảo sát thời gian hoạt hóa hạt từ của SPDP ở 30, và 60 phút; b. Đánh giá khả năng hoạt hóa hạt từ của SPDP; c. Khảo sát nhiệt độ phản ứng của protein BSA và hạt từ ở 10°C và 25°C. Số lượng protein BSA gắn trên 1 mg hạt được hoạt hóa với 10 μg SPDP trong thời từ được xử lý bằng phương pháp thống kê gian 30 phút được chọn cho các thí t-test không bắt cặp cho thấy: lượng nghiệm tiếp theo. Đồng thời, điều kiện protein gắn lên hạt từ có sự khác biệt có ý nhiệt độ phản ứng protein và hạt từ sẽ nghĩa thống kê khi hạt từ được hoạt hóa được thực hiện ở 25°C, vì đây là nhiệt độ với SPDP ở 30 và 60 phút (a) ; không có tiêu chuẩn của các phòng thí nghiệm nói sự khác biệt ở năm thông số SPDP hoạt chung và phòng thí nghiệm cấy ghép nói hóa hạt từ (b) và 2 điều kiện nhiệt độ phản riêng nên có thể dễ dàng áp dụng trong ứng của BSA với hạt từ (c). Lượng điều kiện không cần sử dụng các biện protein gắn với hạt từ được hoạt hóa ở 30 pháp làm lạnh. và 60 phút lần lượt là 33,98 ± 2,47μg và Tạo liên kết giữa hạt từ và protein A/G 23,82 ± 2,80μg. Điều này có thể được lí Liên kết giữa protein A/G và hạt từ được giải bởi sự kém ổn định của của SPDP kiểm tra bằng phương pháp SDS-PAGE trong dung môi phân cực. Vì vậy, thời cho kết quả tương đồng với kết quả hạt từ gian phản ứng với hạt từ càng lâu thì dẫn gắn với protein BSA (Hình 2). Ở giếng 1 đến khả năng phân hủy của chúng càng (chứng âm) và giếng 3 (mẫu không xử lý lớn, do đó không có sự gia tăng hiệu suất DTT) đều không có vạch protein, giếng 2 phản ứng giữa SPDP và hạt từ. Nhằm (mẫu có xử lý DTT) có xuất hiện vạch nâng cao lượng protein gắn lên hạt từ và xấp xỉ 50,5 kDa bằng với vạch protein tiết kiệm lượng SPDP phản ứng, hạt từ A/G ở giếng 4. Điều này chứng tỏ, protein 143
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học A/G đã gắn kết được với hạt từ thông qua qua phương pháp định lượng Bradford, liên kết cộng hóa trị S-S. Sau khi kiểm tra lượng protein A/G gắn lên 1mg hạt từ đạt liên kết giữa protein A/G và hạt từ, thông 71,29 ± 7,87 μg. Hình 2. Đánh giá sự gắn kết của protein A/G và hạt từ bằng phương pháp SDS-PAGE M. thang; 1. chứng âm; 2. mẫu xử lý với điều kiện khử; 3. mẫu xử lý ở điều kiện không khử; 4. protein A/G. Tạo hạt từ miễn dịch thể bị phá hủy bằng dịch dung ly có pH Liên kết hạt từ-pA/G với kháng thể được thấp. Lượng kháng thể sẽ được định đánh giá bằng SDS-PAGE cho thấy, lượng trực tiếp bằng Bradford. Kết quả kháng thể có thể được liên kết với A/G tạo lượng kháng thể gắn lên hạt từ ở các nồng thành hạt từ miễn dịch. Liên kết này có độ khác nhau được thể hiện ở Hình 3. Hình 3. Khảo sát nồng độ kháng thể gắn trên 1 mg hạt từ-pA/G Hình 3 thể hiện lượng kháng thể gắn lên đến lượng kháng thể gắn lên hạt từ pA/G 1 mg hạt từ-pA/G theo năm giá trị nồng sẽ không tăng theo nồng độ kháng thể độ kháng thể khác nhau ở 10, 30, 50, 70, phản ứng. Từ biểu đồ này, nồng độ kháng 90 μg/ml. Kết quả cho thấy lượng kháng thể 10 μg/ml gắn được 25,94 ± 3,74 μg thể này không có sự chênh lệch về mặt kháng thể lên 1 mg hạt từ-pA/G sẽ được thống kê. Nguyên nhân là do lượng sử dụng để tạo hạt từ miễn dịch thử protein A/G gắn kết trên bề mặt hạt bị giới nghiệm khả năng phân tách tế bào Jurkat hạn. Khi đó, số protein A/G này chỉ tương T ở thí nghiệm tiếp theo nhằm giảm lượng tác với một lượng kháng thể nhất định dẫn kháng thể sử dụng. 144
Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học KẾT LUẬN phù hợp là 10 μg/ml. Kết quả, 25,94 ± Nghiên cứu này đã tìm ra lượng SPDP 3,74 μg kháng thể được cố định lên bề hoạt hóa và thời gian hoạt hóa hạt từ tối mặt 1 mg hạt từ-pA/G. Hạt từ miễn dịch ưu là 10μg trong 30 phút, 25°C là nhiệt độ được tạo thành có khả năng phân tách thích hợp để gắn protein A/G lên bề mặt 85,56% riêng lẻ tế bào Jurkat T từ môi hạt từ -NH2. Ở các điều kiện tối ưu này, trường nuôi cấy. So với đề tài trước đó, hạt từ gắn được 71,29 ± 7,87 μg protein hiệu suất phân tách của hạt từ miễn dịch A/G trên 1 mg hạt. Sau đó, hạt từ-pA/G đã được cải thiện đáng kể, từ 53,3% lên được cho phản ứng với nồng độ kháng thể 85,56%. TÀI LIỆU THAM KHẢO CORCHERO, J. L. AND A. VILLAVERDE (2009). Biomedical applications of distally controlled magnetic nanoparticles. Trends in biotechnology 27(8): 468- 476. FERRARA, J. L., J. E. LEVINE, P. REDDY AND E. HOLLER (2009). Graft-versus- host disease. The Lancet 373(9674): 1550-1561. PLOUFFE, B. D., S. K. MURTHY AND L. H. LEWIS (2014). Fundamentals and application of magnetic particles in cell isolation and enrichment: A review. Reports on Progress in Physics 78(1): 016601. SHUBAYEV, V. I., T. R. PISANIC II AND S. JIN (2009). Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced drug delivery reviews 61(6): 467-477. TA, T. K. H., M.-T. TRINH, N. V. LONG, T. T. M. NGUYEN, T. L. T. NGUYEN, T. L. THUOC, B. T. PHAN, D. MOTT, S. MAENOSONO AND H. TRAN- VAN (2016). Synthesis and surface functionalization of Fe3O4-SiO2 core-shell nanoparticles with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane and 1, 1′- carbonyldiimidazole for bio-applications. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 504: 376-383. 145