intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Tìm hiểu tính kháng thuốc kiểu gen của HIV ‐ 1 trên bệnh nhân chưa điều trị ARV tại thành phố Hồ Chí Minh

Chia sẻ: Ro Ong Kloi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

47
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung của bài viết trình bày về các chủng HIV ‐ 1 đột biết kháng thuốc, khảo sát tỷ lệ, các kiểu đột biến của HIV ‐ 1 ở người bệnh chưa từng điều trị ARV tại thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2010 ‐ 1011. Kêt quả nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ các chủng HIV ‐ 1 đột biến kháng thuốc tiếp tục tăng cao so với các nghiên cứu trước, hình thái đột biến đa dạng hơn.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Tìm hiểu tính kháng thuốc kiểu gen của HIV ‐ 1 trên bệnh nhân chưa điều trị ARV tại thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> TÌM HIỂU TÍNH KHÁNG THUỐC KIỂU GEN CỦA HIV‐1  <br /> TRÊN BỆNH NHÂN CHƯA ĐIỀU TRỊ ARV TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH <br /> Huỳnh Minh Tuấn*,**, Nguyễn Kim Huyền*, Phạm Hùng Vân**, Nguyễn Thanh Bảo** <br /> <br /> TÓM TẮT <br /> Mở đầu: Các chủng HIV‐1 đột biết kháng thuốc thoạt đầu xuất hiện bên trong một người bệnh đang được <br /> điều trị thuốc ARV, tạo nên hiện tượng kháng thuốc mắc phải (ADR = Acquired Drug Resistance); sau đó chúng <br /> có khả năng lây nhiễm vào người bệnh mới chưa từng điều trị, tạo nên hiện tượng kháng thuốc tiên phát (TDR = <br /> Transmitted Drug Resistance). Tỷ lệ TDR ngày càng tăng trong nhóm người bệnh mới càng làm tăng nguy cơ <br /> thất bại điều trị.  <br /> Mục tiêu: Khảo sát tỷ lệ, các kiểu đột biến của HIV‐1 ở người bệnh chưa từng điều trị ARV tại TP. Hồ Chí <br /> Minh trong năm 2010‐1011.  <br /> Phương pháp: Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp mô tả, tiền cứu, thực hiện tại Bệnh Viện Bệnh <br /> Nhiệt Đới TP. Hồ Chí Minh từ 1/2010 đến 12/2011. Cỡ mẫu: 250 mẫu. Tiêu chuẩn chọn mẫu: người bệnh được <br /> chẩn đoán xác định nhiễm HIV‐1 theo tiêu chuẩn chẩn đoán của Bộ Y Tế 2009, chưa từng được điều trị thuốc <br /> kháng siêu vi. Tiến hành ly trích RNA từ huyết tương, tổng hợp cDNA, khuếch đại và giải trình tự nucleotid <br /> vùng gen reverse transcriptase, protease.S au đó, phân tích trình tự và tìm đột biến kháng thuốc dựa vào ngân <br /> hàng dữ liệu kháng thuốc Stanford (Hoa Kỳ) và ANRS (Pháp). <br /> Kết  quả:  Trong 216 mẫu khuếch đại thành công, có 44 mẫu (20,37%) mang ít nhất một đột biến kháng <br /> thuốc; trong đó 6 mẫu (2,78%) mang hai đột biến kháng thuốc. Tần suất của đột biến kháng thuốc NRTI là 20 <br /> trường hợp (9,2%), NNRTI là 10 (7,8%), và PI là 7 (3,3%). Các đột biến được ghi nhận nhóm NRTIlà L74I, <br /> M184V/I,  K219Q,  T69N/S,  T215D,  M184V,  T69N;  NNRTI  là  K103N/T,  E138A,  Y181C,  G190A,  V106I, <br /> Y181C, V106I; PI là M46I, M36I, H69K.  <br /> Kết luận: Tỷ lệ các chủng HIV‐1 đột biến kháng thuốc tiếp tục tăng cao so với các nghiên cứu trước, hình <br /> thái đột biến đa dạng hơn.  <br /> Từ khóa: HIV‐1, kháng thuốc tiên phát, kháng thuốc thứ phát, ADR, TDR,NRTI, NNRTI, PI. <br /> <br /> ABSTRACT <br /> GENOTYPIC RESISTANT PROFILE OF HIV‐1 IN ARV‐NAÏVE PATIENT IN HO CHI MINH CITY <br /> Huynh Minh Tuan, Nguyen Kim Huyen, Pham Hung Van, Nguyen Thanh Bao <br />  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 384 ‐ 391 <br /> Background:The drug‐resistant HIV‐1 strains appear in patients who are treated with ARV drug firstly, <br /> creating  the  phenomenon  of  acquired  drug  resistance  (ADR),  then  they  have  the  ability  to  infect  into  new <br /> persons,  creating  naïve  drug  resistance  (TDR  =  Transmitted  Drug  Resistance).  TDR  rate  is  growing  in  new <br /> HIV‐1 infections, trigger the high risk for treatment failure.  <br /> Objectives: Surveil the rate of drug‐resistant HIV‐1, types of mutations in naïve patients in Ho Chi Minh <br /> City during 2010‐2011. <br /> Methods:  The  study  was  designed  according  to  the  descriptive  and  prospective  method,  performed  at <br /> *Khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn Bệnh viện Đại học Y Dược Tp. HCM <br /> ** Bộ môn Vi sinh – Khoa Y – Đại học Y Dược Tp. HCM <br /> <br />  <br /> <br />  <br /> <br /> Tác giả liên lạc: ThS Huỳnh Minh Tuấn  ĐT: 0909349918  Email: huynhtuan@yds.edu.vn. <br /> <br /> 384<br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> HCMC  Hospital  for  Tropical  Diseases  from  1/2010  to  12/2011.  Sample  size:  250.  Criteria  for  screening: <br /> naïve patients were diagnosed with HIV infection following Vietnam Ministry of Health 2009 Guildelines <br /> for diagnosing and treatment HIV/AIDS  (10). Total whole blood samples were extracted RNA from plasma, <br /> synthesized  cDNA,  amplified  and  sequenced  reverse  transcriptase  and  protease  gene.  Then,  we  analysed <br /> sequences and found out the drug‐resistant mutations, basing on drug resistance database Stanford (USA) <br /> and the ANRS AC11 group (France). <br /> Results:  Among  216  successful  samples,  there  are  44  individuals  (20.37%)  carrying  at  least  one  drug‐<br /> resistant mutation type; in which 6 individuals (2.78%) carrying two drug‐resitant mutations. The frequency of <br /> NRTI mutations is 20 cases (9.2%), of NNRTI is 10 (7.8%), and of PI is 7 (3.3%). NRTI‐resistant mutations <br /> detected are M184V, T69NL74I, M184V/I, K219Q, T69N/S, T215D; NNRTI‐ resistant mutations are Y181C, <br /> V106I, K103N/T, E138A, Y181C, G190A, V106I; PI‐resistant mutations are M46I, M36I, H69K.  <br /> Conclusion: The rate of ARV drug‐resistant HIV‐1 mutations is increasing not only in the term of quantity <br /> of virus but also of number of mutant strains. <br /> Key words: HIV‐1, naïve, ADR, TDR, NRTIs, NNRTIs, Pis. <br /> trên toàn quốc có 69.882 người bệnh được điều <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ <br /> trị ARV (chiếm tỷ lệ 33,17%), các thông tin cụ thể <br /> Kể  từ  trường  hợp  bệnh  đầu  tiên  được  phát <br /> khác về vấn đề điều trị như sau: <br /> hiện  vào  cuối  thập  kỷ  90  của  thế  kỷ  trước,  đại <br /> Bảng 2: Tình hình điều trị thuốc ARV tại Việt Nam <br /> dịch nhiễm HIV/AIDS vẫn là vấn đề nóng bỏng <br /> năm 2012 <br /> trong  ngành  y  tế  Việt  Nam  cho  đến  hiện  nay. <br /> Tổng số người bệnh được điều trị<br /> 69.882<br /> Theo  Báo  cáo  tổng  kết  công  tác  phòng,  chống <br /> Người bệnh điều trị tại TP.HCM<br /> 21.350<br /> HIV/AIDS  năm  2012  của  Cục  Phòng  Chống <br /> Phác đồ bậc 1<br /> 96,82%<br /> HIV/AIDS(5) thì số liệu cụ thể cho đến cuối năm <br /> Phác đồ bậc 2<br /> 3,05%<br /> 2012 trên toàn quốc là: <br /> Theo  “Hướng  dẫn  chẩn  đoán  và  điều  trị <br /> Bảng 1: Số liệu tình hình HIV/AIDS tại Việt Nam <br /> năm 2012(5) <br /> Số trường hợp nhiễm HIV hiện<br /> vẫn còn sống<br /> Số bệnh nhân AIDS hiện còn<br /> sống<br /> Số bệnh nhân AIDS tử vong<br /> Tỉ lệ nhiễm HIV toàn quốc<br /> Nhiễm mới HIV năm 2012<br /> Chuyển AIDS năm 2012<br /> Tử vong năm 2012<br /> <br /> 210.703<br /> 61.699<br /> 63.372<br /> 239 người/ 100.000 dân<br /> 11.102<br /> 3.716<br /> 961<br /> <br /> Về  điều  trị  thuốc  kháng  siêu  vi  ARV  (Anti <br /> Retrovirus),  kể  từ  năm  2005,  Việt  Nam  bắt  đầu <br /> nhận được tài trợ chính thức của hai quỹ United <br /> States  President’s  Emergency  Plan  for  AIDS <br /> Relief (PEPFAR) và Global Fund để  bắt  đầu  áp <br /> dụng chương trình điều trị kháng siêu vi (ART = <br /> Anti Retroviral Therapy) cho người bệnh nhiễm <br /> HIV/AIDS trên toàn quốc, và cho đến hiện nay, <br /> số lượng người bệnh nhiễm HIV/AIDS tiếp cận <br /> được với thuốc điều trị ARV ngày một tăng lên. <br /> Cũng  theo  báo  cáo  trên(5),  tính  đến  30/9/2012, <br /> <br /> Nhiễm<br /> <br /> HIV/AIDS”  năm  2009(10)  và  “Sửa  đổi,  bổ  sung <br /> hướng  dẫn  chẩn  đoán  và  điều  trị  HIV/AIDS” <br /> năm 2011(11) của Bộ Y Tế, thuốc ARV chính thức <br /> sử dụng tại Việt Nam thuộc ba nhóm sau đây: <br /> ‐  Nhóm  ức  chế  men  sao  chép  ngược <br /> nucleoside  và  nucleotide  (NRTIs  =  Nucleoside <br /> Reverse  Transcripatase  Inhibitors;  NtRTIs  = <br /> Nucleotide  Reverse  Transcriptase  Inhibitors) <br /> gồm  các  thuốc:  Zidovudine  (AZT,  ZDV), <br /> Stavudine  (d4T),  Didanosine  (ddI),  Lamivudine <br /> (3TC), Abacavir (ABC), Tenofovir (TDF)… <br /> ‐  Nhóm  ức  chế  men  sao  chép  ngược  không <br /> phải  là  nucleoside  (NNRTIs  =  Non‐Nucleoside <br /> Reverse  Transcripatase  Inhibitors)  gồm  các <br /> thuốc:  Efavirenz  (EFV),  Nevirapine  (NVP), <br /> Etravirine (ETR), Rilpivirine (RPV)… <br /> ‐  Nhóm  ức  chế  men  protease  (PIs  = <br /> Protease Inhibitors) gồm các thuốc: Atanazavir <br /> +  ritonavir  (ATV/r),  Lopinavir  +  ritonavir <br /> (LPV/r), Ritonavi (RTV)… <br /> <br /> 385<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> Trên  bình  diện  thế  giới  và  khu  vực,  y  văn <br /> đã ghi nhận tình hình kháng thuốc ARV do sự <br /> xuất hiện của các chủng HIV‐1 đột biến kháng <br /> thuốc  ngày  một  tăng  lên  theo  số  lượng  người <br /> bệnh được điều trị thuốc ARV, cả kháng thuốc <br /> thứ phát, mắc phải do chọn lọc trong quá trình <br /> điều trị (ADR = Acquired Drug Resistance) và <br /> kháng thuốc tiên phát do lây nhiễm chủng siêu <br /> vi  đột  biến  kháng  thuốc  (TDR  =  Transmitted <br /> Drug  Resistance).  Tổ  Chức  Y  Tế  Thế  Giới <br /> (WHO  =  World  Health  Organization)  đã  có <br /> khuyến cáo về tầm soát các trường hợp kháng <br /> thuốc tiên  phát  do  lây  nhiễm  phải  chủng  siêu <br /> vi  kháng  thuốc(3).  Các  kết  quả  nghiên  cứu  ở <br /> Trung  Quốc  đã  công  bố  số  liệu  về  tỷ  lệ  lưu <br /> hành  của  các  chủng  HIV‐1  đột  biến  kháng <br /> thuốc  khoảng  3,8%(7).  Tại  Thái  Lan,  một  đất <br /> nước rất gần và có rất nhiều điểm tương đồng <br /> với đất nước chúng ta, các kết quả nghiên cứu <br /> cũng  cho  thấy  tỷ  lệ  lưu  hành  của  các  chủng <br /> HIV‐1 đột biết kháng thuốc tăng dần từ khi bắt <br /> đầu  chương  trình  ART  trên  người  bệnh  Thái <br /> nhiễm  HIV/AIDS  năm  2002,  đã  vượt  lên  hơn <br /> ngưỡng 5% (5,2% vào năm 2006)(1,14). <br /> Tại Việt Nam, ngay từ năm 2005 khi bắt đầu <br /> chương trình quốc gia ART, một nghiên cứu của <br /> tác giả Trương Thị Xuân Liên và cộng sự ở TP. <br /> Hồ  Chí  Minh(15)  đã  báo  cáo  về  một  trường  hợp <br /> nhiễm chủng HIV‐1 mang đột biến kháng thuốc <br /> NRTI trên người bệnh là phụ nữ mang thai chưa <br /> điều  trị  ARV.Năm  2006,  một  nghiên  cứu  khác <br /> của  tác  giả  Ayouba  và  cộng  sự  cũng  ở  TP.  Hồ <br /> Chí Minh(2) báo cáo về các trường hợp nhiễm các <br /> chủng  HIV‐1  mang  các  đột  biến  kháng  thuốc <br /> NNRTI  và  PI  trên  nhóm  người  bệnh  là  thanh <br /> niên trẻ đến tầm soát nhiễm HIV tại các phòng <br /> tham  vấn  xét  nghiệm  tự  nguyện  (VCT  = <br /> Voluntary  Counseling  and  Testing).Cũng  năm <br /> 2006,  một  nghiên  cứu  của  tác  giả  Nguyễn  Trần <br /> Hiển  và  cộng  sự  tại  Hà  Nội(8)  báo  cáo  về  các <br /> trường hợp nhiễm chủng HIV‐1 mang đột biến <br /> kháng  thuốc  cả  NRTI  và  NNRTI  trên  nhóm <br /> người  bệnh  đến  tầm  soát  nhiễm  HIV  tại  các <br /> phòngVCT.Tiếp  theo  sau  đó,  vào  các  năm  2007 <br /> và 2008, tác giả Yang và cộng sự công bố kết quả <br /> <br /> 386<br /> <br /> nghiên cứu ở TP. Hồ Chí Minh(19) cho thấy tỷ lệ <br /> người  bệnh  mang  các  chủng  HIV‐1  đột  biến <br /> kháng thuốc có thể lên đến 5‐15% người trẻ đến <br /> tầm  soát  nhiễm  HIV  tại  các  phòng  VCT.  Ngoài <br /> ra, còn một số kết quả nghiên cứu của các tác giả <br /> khác ở cả hai miền nam bắc cho thấy khoảng 6,3‐<br /> 6,7% người nhiễm HIV‐1 mạn tính chưa điều trị <br /> ARV có mang các chủng siêu vi đột biến kháng <br /> thuốc trên toàn bộ Việt Nam(4,6,8,16,16). <br /> Tổng  kết  từ  các  nghiên  cứu  này,  xét  về  các <br /> nhóm thuốc ARV, đột biến kháng NRTI là nhiều <br /> nhất (có thể lên đến 8‐9%), và đột biến kháng PI <br /> là thấp nhất (ít hơn 2%). Khi xét cụ thể  các  đột <br /> biến  thì,  trong  các  đột  biến  kháng  thuốc  nhóm <br /> NRTI, chiếm tỷ lệ cao nhất là đột biến M184I/V <br /> và  các  đột  biến  TAMs  (Thymidine‐Analogue <br /> Mutations), bao gồm M41L, D67N, K70R, T215F, <br /> L210W, và K219E/Q, tiếp theo sau đó là đột biến <br /> L74I/V;  trong  các  đột  biến  kháng  thuốc  nhóm <br /> NNRTI, thường gặp nhất là các đột biến Y181C, <br /> K103N,  và  G190A;  trong  các  đột  biến  kháng <br /> thuốc nhóm PI, thường gặp nhất là M46I/I. <br /> Khả  năng  đột  biến  để  thích  nghi  và  tồn  tại <br /> dưới áp lực thuốc ARV của HIV‐1 là siêu việt, và <br /> chắc  chắn  sẽ  còn  tiếp  diễn.  Đây  cũng  là  một <br /> trong  những  thách  thức  to  lớn  cho  con  người <br /> trong  công  cuộc  tìm  kiếm  vũ  khí  (thuốc)  hữu <br /> hiệu để khống chế căn bệnh thế kỷ này. Đó cũng <br /> là lý do để chúng tôi tiến hành nghiên cứu này, <br /> tiếp  tục  tìm  hiểu  đặc  tính  kháng  thuốc  trên <br /> những  người  bệnh  chưa  điều  trị  ARV,  nhằm <br /> mục  đích  đóng  góp  vào  kiến  thức  dịch  tể  nói <br /> chúng,  và  góp  phần  giúp  các  bác  sĩ  điều  trị  có <br /> nhiều thông tin hơn trong việc chọn lựa phác đồ <br /> điều trị cho người bệnh. <br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU <br /> Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp <br /> mô  tả,  tiền  cứu,  thực  hiện  tại  Bệnh  Viện  Bệnh <br /> Nhiệt  Đới  TP.  Hồ  Chí  Minh  từ  1/2010  đến <br /> 12/2011. <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 <br /> Đối tượng <br /> Tổng  cộng  nhóm  nghiên  cứu  chúng  tôi  đã <br /> thu  thập  được  250  mẫu  máu  toàn  phần  người <br /> bệnh  HIV‐1  đến  khám  và  điều  trị  tại  phòng <br /> khám  ngoại  trú  của  Bệnh  viện  Bệnh  Nhiệt  Đới <br /> TP.HCM.  Mẫu  được  lấy  theo  phương  pháp <br /> ngẫu  nhiên  liên  tục  cho  đến  khi  kết  thúc.  Tiêu <br /> chuẩn chọn mẫu vào nghiên cứu là người bệnh <br /> được chẩn đoán xác định nhiễm HIV‐1 theo tiêu <br /> chuẩn chẩn đoán của Bộ Y Tế 2009(10), chưa được <br /> điều  trị  thuốc  kháng  siêu  vi  trước  đó,  trưởng <br /> thành  (≥  18  tuổi  tính  đến  thời  điểm  tham  gia <br /> nghiên  cứu)  và  đồng  ý  tham  gia  nghiên  cứu; <br /> không phân biệt tuổi, giới, tiền sử lây truyền, và <br /> giai đoạn tiến triển của bệnh. <br /> <br /> Ly trích huyết tương <br /> Mẫu máu toàn phần (8‐10ml) được cho vào <br /> ống  chống  đông  EDTAK3  (Nam  Khoa  Biotek, <br /> HCMC,  Vietnam),  được  vận  chuyển  từ  Bệnh <br /> Viện  Bệnh  Nhiệt  Đới  TP.  Hồ  Chí  Minh  về  Đại <br /> Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong thùng xốp <br /> kín có đá khô không quá hai (02)  giờ  kể  từ  khi <br /> lấy mẫu, và được ly tách huyết tương ngay. <br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Mẫu  máu  được  ly  tách  huyết  tương  bằng <br /> phương pháp ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, <br /> trong  10  phút  ở  nhịêt  độ  4oC.  Huyết  tương  ly <br /> tách  được  khoảng  3‐4ml,  được  aliquot  vào  các <br /> ống Effpendof 1,5ml và lưu ở ‐70°C đến khi thực <br /> hiện bước tiếp theo. <br /> <br /> Ly trích RNA siêu vi HIV‐1 <br /> Rã đông tự nhiên huyết tương đã lưu ở trên, <br /> ly  trích  RNA  bằng  cách  sử  dụng  150µl  huyết <br /> tương  và  bộ  kit  RNAPrep  (Nam  Khoa  Biotek, <br /> HCMC, Vietnam). Nguyên tắc của bộ kit này là <br /> sử  dụng  hợp  chất  phenol‐chloroform  làm  biến <br /> tính  protein  và  dùng  ethanol  lạnh  để  làm  tủa <br /> RNA của siêu vi HIV‐1. <br /> <br /> Tổng hợp cDNA từ RNA được ly trích ở trên <br /> Sản  phẩm  RNA  ly  trích  ở  bước  trên  được <br /> sử dụng để tổng hợp thành cDNA bằng bộ kit <br /> cDNA  Synthesis  (Nam  Khoa  Biotek,  HCMC, <br /> Vietnam). Chu kỳ nhiệt được sử dụng là: 25oC <br /> trong  5  phút,  42oC  trong  30  phút,  85oC  trong  <br /> 5 phút. <br /> <br /> Khuếch đại các vùng gen reverse transcriptase (rt) và protease (pr) của HIV‐1 bằng phương pháp <br /> “nested” PCR và tinh sạch sản phẩm sau khuếch đại <br /> Vùng gen<br /> <br /> rt<br /> <br /> pr<br /> <br /> Mồi ngoài<br /> Mồi trong<br /> MJ3:<br /> A(35):<br /> 5’-AGTAGGACCTACACCTGTCA-3’<br /> 5’-TTGGTTGCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCCTATT-3’<br /> (2480 to 2499)<br /> (2530 to 2558)<br /> MJ4:<br /> NE1(35):<br /> 5’-CTGTTAGTGCTTTGGTTCCTCT-3’<br /> 5’-CCTACTAACTTCTGTATGTCATTGACAGTCCAGCT(3399 to 3420)<br /> 3’ (3300 to 3334) (kích thước 805 bp)<br /> 5’ prot 1:<br /> 5’ prot 2:<br /> 5’-TAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTTCC-3’<br /> 5’-TCAGAGCAGACCAGAGCCAACAGCCCCA-3’<br /> (2082 to 2109)<br /> (2136 to 2163)<br /> 3’ prot 1:<br /> 3’ prot 2:<br /> 5’-GCAAATACTGGAGTATTGTATGGATTTTCAGG5’-AATGCTTTTATTTTTTCTTCTGTCAATGGC-3’<br /> 3’ (2703 to 2734)<br /> (2621 to 2650) (kích thước 515 bp)<br /> <br /> Trình tự mồi tham khảo từ tổ chức ANRS (http://www.hivfrenchresistance.org) <br /> giây,  61 oC  trong  30  giây  và  72 oC  trong  1  phút; <br /> Chu kỳ nhiệt PCR khi sử dụng “mồi ngoài”: <br /> sau cùng là 72 oC trong 10 phút. <br /> 95 oC trong 5 phút; 40 chu kỳ gồm 94 oC trong 30 <br /> Khi đã thực hiện khuếch đại vùng gen rt, pr, <br /> giây,  50 oC  trong  30  giây  và  72 oC  trong  1  phút; <br /> sau cùng là 72 oC trong 10 phút. <br /> <br /> chúng tôi cho sản phẩm PCR  chạy  điện  di  trên <br /> <br /> Chu kỳ nhiệt PCR khi sử dụng “mồi trong”: <br /> oC trong 5 phút; 40 chu kỳ gồm 94 oC trong 30 <br /> 95 <br /> <br /> gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide để xác <br /> <br /> Nhiễm<br /> <br /> 387<br /> <br /> Nghiên cứu Y học <br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014<br /> <br /> định sản phẩm chính là gen rt, pr (dựa vào kích <br /> thước đoạn khuếch đại). <br /> Tinh sạch toàn bộ sản phẩm PCR bằng bộ kit <br /> Purification (Qiagen, Hilden, Germany). <br /> <br /> Giải trình tự gen rt, pr <br /> Sản phẩm từ  bước tinh  sạch  ở  trên  sẽ  được <br /> thực hiện giải trình tự nucleotid cả 2 mạch bằng <br /> bộ kit BigDye Terminator Cycle Sequencing v3.1 <br /> (Applied  Biosystems,  Foster  CA,  USA)  với  mồi <br /> “xuôi” và “ngược” là A(35), NE1(35) đối với gen <br /> rt; 5’prot2, 3’prot2 đối với gen pr, sau khi tất cả <br /> sản phẩm PCR được đánh dấu huỳnh quang, sẽ <br /> được  “cô  đặc”  lại  và  huyền  phù  trong  20µl <br /> formamid để được phân tích trình tự nucleotide <br /> bằng máy giải trình tự tự động ABI Prism 3130xl <br /> (Applied Biosystems, Foster CA, USA). <br /> <br /> Tinh sạch trình tự và tìm đột biến kháng <br /> thuốc <br /> Trình tự nucleotid “thô” sau khi giải sẽ được <br /> “tinh sạch”  bằng  phần  mềm  Mega  5.05,  sau  đó <br /> so  sánh  với  dữ  liệu  HIV  kháng  thuốc  Stanford <br /> (http://hivdb.Stanford.edu/) <br /> và <br /> ANRS <br /> (http://www.hivfrenchresistance.org)  để  xác <br /> định  đột  biến  kháng  thuốc  chính,  phụ  đối  với <br /> thuốc ARV (antiretrovirus) gồm các nhóm NRTI, <br /> NNRTI, PI. <br /> <br /> trong  việc  khuếch  đại,  giải  và  phân  tích  trình <br /> tự của 216 mẫu (chiếm 86,4%). <br /> Trong tổng số 216 mẫu được phân tích, có <br /> 44  cá  thể  người  bệnh  (chiếm  20,37%)  mang  ít <br /> nhất một kiểu đột biến kháng thuốc của cả ba <br /> nhóm  NRTI,  NNRTI,  và  PI;  trong  đó  6  cá  thể <br /> người bệnh (2,78%) mang chủng HIV‐1 có hai <br /> đột  biến  kháng  thuốc  đã  được  ghi  nhận.  Tần <br /> suất  xuất  hiện  của  các  đột  biến  kháng  thuốc <br /> NRTI  là  20  trường  hợp  (9,2%),  NNRTI  là  10 <br /> trường  hợp  (7,8%),  và  PI  là  7  trường  hợp <br /> (3,3%). Các kết quả cụ thể được trình bày trong <br /> những bảng dưới đây. <br /> Dữ  liệu  tham  khảo  về  vị  trí  đột  biến,  kiểu <br /> đột biến chính‐phụ được tham khảo từ các kết <br /> quả đã công bố của nhóm ANRS (Pháp) và từ <br /> ngân hàng dữ liệu Stanford (Hoa Kỳ). <br /> Khi  so  sánh  với  các  kết  quả  nghiên  cứu <br /> kháng thuốc đã công bố tại Việt Nam(2,4,6,8 ,15,16,19), <br /> chúng tôi thấy: trong các nghiên cứu đã công bố <br /> ở trên, các đột biến kháng thuốc nhóm NRTI đã <br /> được  ghi  nhận  là:  M41L,  K65R,  D67N,  T69D, <br /> K70R, L74V/I, V75A/M, M184V/I,L210W, T215F, <br /> K219E/Q/R; so với nghiên cứu của chúng tôi, các <br /> vị  trí  và  kiểu  đột  biến  được  phát  hiện  là  L74I, <br /> M184V/I, K219Q, T69N/S, T215D, cho thấy có sự <br /> tương đồng với các nghiên cứu đã công bố.  <br /> <br /> KẾT QUẢ & BÀN LUẬN <br /> Trong 250 mẫu bệnh phẩm thu thập được, <br /> nhóm  nghiên  cứu  chúng  tôi  đã  thành  công <br /> <br /> Kết quả phân tích đột biến kháng thuốc nhóm NRTI <br /> Bảng 3: Kết quả đột biến kháng thuốc nhóm NRTI <br /> TT<br /> <br /> Loại đột biến<br /> <br /> 1<br /> <br /> L74I<br /> <br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> Tổng đột biến chính<br /> <br /> T69N<br /> T69S<br /> T215D<br /> 3<br /> <br /> Tỷ lệ %<br /> <br /> Loại thuốc bị kháng<br /> ABC¥, ddI¥<br /> <br /> 0,93<br /> <br /> 3<br /> 4<br /> 2<br /> 11<br /> <br /> M184I<br /> M184V<br /> K219Q<br /> 4<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> Tổng đột biến phụ<br /> <br /> Tần suất<br /> Chính<br /> 2<br /> <br /> ¥<br /> <br /> 1,39<br /> 1,85<br /> 0,93<br /> 5,10<br /> <br /> 3TC , FTC¥, ABC, ddI<br /> 3TC¥, FTC¥, ABC, ddI<br /> d4T<br /> <br /> 6<br /> 2<br /> 1<br /> 9<br /> <br /> 2,78<br /> 0,93<br /> 0,46<br /> 4,17<br /> <br /> TDF<br /> TDF<br /> ZDV, d4T<br /> <br /> Phụ<br /> <br /> ¥ <br /> <br /> Thuốc ARV bị kháng ở mức độ cao <br /> <br /> 388<br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa <br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2