Tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 trên bệnh nhân ung thư phổi

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> TÍNH ĐA HÌNH A4889G CỦA GEN CYP1A1<br /> TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI<br /> Lê Hồng Công, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Đa hình A4889G trên gen CYP1A1 được chỉ ra là yếu tố nguy cơ cao gây ung thư phổi trên người Châu<br /> Á. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 ở nhóm bệnh nhân<br /> ung thư phổi so với nhóm đối chứng. 220 mẫu bệnh nhân ung thư phổi và 200 người không mắc bệnh ung<br /> thư được lựa chọn vào nghiên cứu. Kỹ thuật PCR - RFLP (PCR - Restriction fragment length polymorphism)<br /> được lựa chọn để xác định tính đa hình A4889G. Kết quả cho thấy, tần số alen A và G ở nhóm bệnh nhân<br /> ung thư phổi chưa có sự khác biệt so với tần số alen A và G của nhóm đối chứng với p > 0,05. Tuy nhiên,<br /> kết quả cho thấy rõ mối liên hệ giữa kiểu gen AG, GG so với kiểu gen AA với yếu tố nguy cơ là hút thuốc lá<br /> và có ý nghĩa thống kê với tỷ suất chênh OR = 2,208; 95% CI = 1,127 - 4,326 p < 0,02. Bước đầu thấy được<br /> sự tương quan giữa đa hình thái A4889G của gen CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi với yếu tố nguy cơ hút<br /> thuốc lá ở người Việt Nam.<br /> Từ khóa: Ung thư phổi, đa hình A4889G, gen CYP1A1<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ung thư phổi là loại ung thư thường gặp<br /> <br /> nghề nghiệp và các đột biến gen di truyền qua<br /> những thế hệ khác nhau.<br /> <br /> nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu<br /> <br /> Cytochrome P450 (CYPs) là một liên họ<br /> <br /> ở nhiều nước trên Thế giới [1]. Hút thuốc lá<br /> <br /> lớn chứa các hemoprotein xúc tác rất nhiều<br /> <br /> được cho là nguyên nhân chính gây ung thư<br /> <br /> phản ứng enzym khác nhau để chuyển hóa<br /> <br /> phổi, 85 - 90% bệnh nhân ung thư phổi là do<br /> <br /> các chất nội sinh và ngoại sinh. Trong hệ<br /> <br /> hút thuốc lá. Tuy nhiên chỉ dưới 20% số người<br /> <br /> thống cytochrome P450, cytochrome P450<br /> <br /> hút thuốc lá bị ung thư phổi, điều này cho thấy<br /> <br /> 1A1 (CYP1A1) là enzym chính hoạt hóa các<br /> <br /> các yếu tố khác bao gồm các biến thể di<br /> <br /> chất và là chìa khóa để kích hoạt quá trình<br /> <br /> truyền đóng một vai trò quan trọng trong cơ<br /> <br /> trao đổi chất giữa các hydrocarbons có nhân<br /> <br /> chế gây bệnh ung thư phổi [2]. Sự phát sinh,<br /> <br /> thơm, các amin dị vòng dẫn đến hình thành<br /> <br /> phát triển bệnh ung thư phổi diễn ra qua nhiều<br /> <br /> các phân tử DNA bất thường từ đó khởi đầu<br /> <br /> giai đoạn dưới tác động của các yếu tố nguy<br /> <br /> cho quá trình ung thư [3]. Kết quả của các<br /> <br /> cơ, sự mẫn cảm của gen và quá trình tích lũy<br /> <br /> nghiên mới được công bố gần đây cho thấy<br /> <br /> đột biến xảy ra trên các gen gây ung thư. Các<br /> <br /> có mối liên quan chặt chẽ giữa ung thư phổi<br /> <br /> yếu tố nguy cơ bao gồm hút thuốc lá, nhiễm<br /> <br /> với đa hình gen CYP1A1; trong đó, đa hình<br /> <br /> virus human papillomavirus (HPV), môi trường,<br /> <br /> A4889G của gen CYP1A1 được chỉ ra là yếu<br /> tố nguy cơ cao gây bệnh ung thư phổi trên<br /> các đối tượng người Châu Á [4 - 7].<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường<br /> Đại học Y Hà Nội<br /> <br /> Để góp phần hiểu rõ hơn về mối liên quan<br /> <br /> Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn<br /> <br /> giữa đa hình A4889G của gen CYP1A1 với<br /> <br /> Ngày nhận: 15/12/2016<br /> <br /> nguy cơ ung thư phổi, nghiên cứu được thực<br /> <br /> Ngày được chấp thuận: 26/2/2017<br /> <br /> hiện nhằm:<br /> <br /> 48<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> 1. Xác định tính đa hình A4889G của gen<br /> CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi và người<br /> bình thường.<br /> 2. Đánh giá mối tương quan giữa tính đa<br /> hình A4889G của gen CYP1A1 ở bệnh nhân<br /> ung thư phổi và người bình thường.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> <br /> + Thành phần phản ứng PCR (thể tích<br /> 10,2μl) gồm: 4,7 μl Taq polymerase; 0,3μl mồi<br /> xuôi; 0,3μl mồi ngược; 1,2μl DNA và 3,7μl<br /> H2O.<br /> + Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:<br /> o<br /> <br /> 94 C/5 phút, 35 chu kỳ [94oC/40 giây, 54oC/30<br /> giây, 72oC/45 giây], 72oC/7 phút. Bảo quản<br /> mẫu ở 15oC. Sản phẩm PCR được điện di<br /> trên gel agarose 1,5%, với điện thế 95V, trong<br /> <br /> 1. Đối tượng<br /> <br /> 25 phút.<br /> <br /> Nhóm bệnh lý: gồm 220 bệnh nhân ung<br /> thư phổi được điều trị ở Bệnh viện Bạch Mai<br /> <br /> Xác định đa hình A4889G của gen<br /> CYP1A1 bằng kỹ thuật cắt enzym giới hạn:<br /> <br /> trong đó có 165 nam và 55 nữ với tuổi trung<br /> <br /> + Thành phần phản ứng: 5μl H20; 1,5μl<br /> <br /> bình 60 ± 9,1. Bệnh nhân ung thư phổi được<br /> <br /> Buffer 10x; 0,5μl enzym MspI, 8μl sản phẩm<br /> <br /> thăm khám lâm sàng, làm các xét nghiệm cận<br /> <br /> PCR. Phản ứng cắt được ủ ở nhiệt độ 37oc<br /> <br /> lâm sàng và làm xét nghiệm giải phẫu bệnh để<br /> <br /> qua đêm, sau đó điện di trên gel agarose<br /> <br /> chẩn đoán xác định ung thư phổi.<br /> <br /> 2,5% với điện thế 80V, trong 90 phút và chụp<br /> <br /> Nhóm chứng: 200 người trong chương<br /> <br /> ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging system.<br /> <br /> trình quản lý tăng huyết áp và đái tháo đường,<br /> <br /> Khi enzym MspI cắt đoạn gen sẽ tạo ra các<br /> <br /> gồm 129 nam và 71 nữ, tuổi trung bình 66 ±<br /> <br /> đoạn DNA có kích thước 204 bp (kiểu gen<br /> <br /> 9,4. Được kiểm tra định kỳ bằng X-quang để<br /> <br /> GG); 149 bp và 55 bp (kiểu gen AA); 204bp,<br /> <br /> loại trừ ung thư phổi.<br /> <br /> 149 bp và 55 bp (kiểu gen AG).<br /> <br /> Bệnh nhân ung thư phổi và nhóm chứng<br /> được lấy 2ml máu chống đông trong EDTA.<br /> 2. Phương pháp<br /> <br /> - Phân tích số liệu<br /> Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0<br /> để phân tích số liệu. Dùng kiểm định χ2 để so<br /> sánh tỷ lệ kiểu gen của hai nhóm ung thư và<br /> <br /> Tách chiết DNA<br /> DNA tổng số được tách chiết từ các mẫu<br /> <br /> nhóm chứng. Để ước tính mối liên quan giữa<br /> các kiểu gen và khả năng mắc ung thư phổi<br /> <br /> máu theo phương pháp sử dụng enzym pro-<br /> <br /> dùng tỷ xuất OR với khoảng tin cậy 95%. Các<br /> <br /> tein K và phenol: chloroform: isoamyl alcohol.<br /> <br /> kiểm định có ý nghĩa khi p < 0,05.<br /> <br /> - Kỹ thuật PCR-RFLP (PCR- Restriction<br /> Fragment Length Polymorphism):<br /> <br /> 3. Đạo đức trong nghiên cứu<br /> Đề tài đã được thông qua hội đồng đạo<br /> <br /> PCR được sử dụng để khuếch đại vùng<br /> <br /> đức của Trường Đại học Y Hà Nội theo chấp<br /> <br /> gen đa hình A4889G của gen CYP1A1 với<br /> <br /> thuận số 118/HĐĐĐ-ĐHYHN ngày 31/1/2013.<br /> <br /> cặp mồi:<br /> <br /> Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào<br /> <br /> Mồi xuôi: 5’ - TAG GAG TCT TGT CTC<br /> <br /> nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi<br /> <br /> ATG CCT - 3 .<br /> <br /> nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia<br /> <br /> Mồi ngược: 5’- CAG TGA AGA GGT GTA<br /> GCC GCT - 3’.<br /> <br /> vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân sẽ<br /> <br /> ’<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> được đảm bảo bí mật.<br /> 49<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu<br /> Bảng 1. Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu<br /> Các đặc điểm<br /> <br /> Ung thư phổi n1 (%)<br /> <br /> Nhóm chứng n2 (%)<br /> <br /> p<br /> <br /> 165 (75%)<br /> <br /> 129 (65%)<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> 55 (25%)<br /> <br /> 71 (35%)<br /> <br /> Tuổi<br /> Trung bình (M)<br /> <br /> 60<br /> <br /> 66<br /> <br /> Độ lệch (SD)<br /> <br /> 9,1<br /> <br /> 9,4<br /> <br /> Giới<br /> Nam<br /> Nữ<br /> <br /> Hút thuốc lá<br /> Không<br /> <br /> 132 (60%)<br /> <br /> Có<br /> < 10 bao/năm<br /> <br /> 88 (40%)<br /> 25 (37%)<br /> <br /> > 10 bao/năm<br /> <br /> 55 (63%)<br /> <br /> 143 (71,5%)<br /> 57 (28,5%)<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> < 0,05<br /> <br /> Giải phẫu bệnh<br /> K biểu mô tuyến<br /> <br /> 114 (51%)<br /> <br /> K không tế bào nhỏ<br /> <br /> 14 (6,2%)<br /> <br /> K tế bào nhỏ<br /> <br /> 13 (6%)<br /> <br /> Chưa xác định<br /> <br /> 84 (36,8%)<br /> <br /> Bảng 1 cho thấy tỷ lệ nam cao hơn nữ ở cả 2 nhóm nghiên cứu và độ tuổi trung bình là 60 ở<br /> nhóm ung thư phổi và 66 ở nhóm đối chứng. Ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi, tỷ lệ bệnh nhân<br /> không hút thuốc cao hơn nhóm bệnh nhân có hút thuốc và hút > 10 năm chiếm tỷ lệ cao hơn hút<br /> thuốc dưới 10 năm. Ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi đã được xác định giải phẫu bệnh; ung thư<br /> biểu mô tuyến chiếm tỉ lệ cao nhất (51%).<br /> 2. Xác định tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 ở bệnh nhân ung thư phổi và người<br /> bình thường<br /> Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng gen chứa đa hình A4889G trên gen CYP1A1,<br /> sản phẩm PCR tiếp tục được cắt enzym MspI để xác định các kiểu gen khác nhau.<br /> <br /> 50<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bệnh<br /> nhân<br /> ung thư<br /> phổi<br /> Bệnh<br /> nhân<br /> K phổi<br /> <br /> MK PCR (+)<br /> <br /> AA AG GG<br /> <br /> AG<br /> <br /> Ngườibình<br /> bình thường<br /> thường<br /> Người<br /> <br /> AG AA AG<br /> <br /> AG<br /> <br /> 204 bp<br /> 204bp<br /> 149bp<br /> 149 bp<br /> 55bp<br /> 255 bp<br /> <br /> Hình 1. Kết quả xác định đa hình A4889G của gen CYP1A1 bằng kỹ thuật PCR – RFLP<br /> MK: Marker 100bp, PCR: sản phẩm PCR không cắt enzym, (+) mẫu đối chứng dương cắt<br /> enzym.<br /> Sản phẩm cắt đoạn vùng A4889G trên gen CYP1A1 bằng enzym MspI trên các mẫu bệnh<br /> nhân ung thư phổi và nhóm chứng có kích thước khác nhau phù hợp với tính toán lý thuyết. Mẫu<br /> mang kiểu gen GG gồm một băng DNA có kích thước 204 bp. Mẫu mang kiểu gen AG gồm 3<br /> băng DNA có kích thước 204 bp, 149 bp, 55 bp. Mẫu mang kiểu gen AA gồm 2 băng DNA có kích<br /> thước 149 bp và 55 bp (hình 1).<br /> Nghiên cứu tiến hành đánh giá sự phân bố kiểu gen AA, AG, GG giữa nhóm bệnh nhân ung<br /> thư phổi so sánh nhóm đối chứng (bảng 2).<br /> Bảng 2. So sánh sự phân bố kiểu gen ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm đối chứng<br /> Kiểu gen<br /> <br /> Nhóm ung thư phổi n1 (%)<br /> <br /> Nhóm đối chứng n2 (%)<br /> <br /> AA<br /> <br /> 85 (38,6%)<br /> <br /> 90 (45,0%)<br /> <br /> AG<br /> <br /> 103 (46,8%)<br /> <br /> 85 (42,5%)<br /> <br /> GG<br /> <br /> 32 (14,6%)<br /> <br /> 25 (12,5%)<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 220<br /> <br /> 200<br /> <br /> p<br /> <br /> > 0,05<br /> <br /> 420<br /> <br /> Kết quả bảng 2 cho thấy sự phân bố kiểu gen AA, AG, GG của nhóm bệnh nhân ung thư<br /> phổi lần lượt là 85 (38,6%), 103 (46,8%), 32 (14,6%), không có sự khác biệt so với nhóm chứng,<br /> p > 0,05.<br /> Để tìm sự khác biệt giữa nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm chứng, chúng tôi tiếp tục so<br /> sánh các kiểu gen với nhau.<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br /> 51<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 3. So sánh sự phân bố kiểu gen AG với kiểu gen AA<br /> ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm đối chứng<br /> Kiểu gen<br /> <br /> Nhóm ung thư phổi n1 (%)<br /> <br /> Nhóm đối chứng n2 (%)<br /> <br /> Kết quả<br /> <br /> AG<br /> <br /> 103 (54,8%)<br /> <br /> 85 (45,8%)<br /> <br /> OR = 1,283<br /> <br /> AA<br /> <br /> 85 (45,2%)<br /> <br /> 90 (54,2%)<br /> <br /> (95% CI = 0,849 - 1,939)<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 188<br /> <br /> 175<br /> <br /> Bảng 3 cho thấy kiểu gen AG và AA của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không có sự khác biệt<br /> so với nhóm chứng với tỷ suất chênh OR = 1,283 với độ tin cậy (95% CI = 0,849 - 1,939),<br /> p > 0,05.<br /> Bảng 4. So sánh sự phân bố kiểu gen GG với kiểu gen AA ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi<br /> và nhóm đối chứng<br /> Kiểu gen<br /> <br /> Nhóm ung thư phổi n1 (%)<br /> <br /> Nhóm đối chứng n2 (%)<br /> <br /> Kết quả<br /> <br /> GG<br /> <br /> 32 (27,4%)<br /> <br /> 25 (21,7%)<br /> <br /> OR = 1,355<br /> <br /> AA<br /> <br /> 85 (72,6%)<br /> <br /> 90 (78,3%)<br /> <br /> (95% CI = 0,743 - 2,473)<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 117<br /> <br /> 115<br /> <br /> Bảng 4 cho thấy kiểu gen GG so với kiểu gen AA của nhóm bệnh nhân ung thư phổi không có<br /> sự khác biệt so với nhóm chứng với tỷ suất chênh OR = 1,355 với độ tin cậy (95% CI = 0,743 2,743), p > 0,05.<br /> Chúng tôi tiến hành đánh giá sự phân bố của 2 kiểu gen AG - GG kết hợp (kiểu gen đột biến)<br /> so với kiểu gen nguyên thủy AA (wild type) và so sánh các kiểu gen này với nguy cơ hút thuốc lá.<br /> Bảng 5. So sánh sự phân bố kiểu gen AG, GG với kiểu gen AA ở nhóm bệnh nhân ung thư<br /> phổi và nhóm đối chứng<br /> Kiểu gen<br /> <br /> Nhóm ung thư phổi n1 (%)<br /> <br /> Nhóm đối chứng n2 (%)<br /> <br /> Kết quả<br /> <br /> AG - GG<br /> <br /> 135 (61,4%)<br /> <br /> 110 (55,0%)<br /> <br /> OR = 1,299<br /> <br /> AA<br /> <br /> 85 (38,6%)<br /> <br /> 90 (45,0%)<br /> <br /> (95% CI = 0,881 - 1,917)<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 220<br /> <br /> 200<br /> <br /> Bảng 5 cho thấy kiểu gen AG, GG so với kiểu gen AA giữa nhóm bệnh nhân ung thư phổi<br /> không có sự khác biệt so với nhóm chứng với tỷ suất chênh OR = 1,299 với độ tin cậy (95% CI =<br /> 0,881 - 1,917), p > 0,05.<br /> <br /> 52<br /> <br /> TCNCYH 106 (1) - 2017<br /> <br />