Tinh sạch và nuôi cấy tế bào diệt tự nhiên (nk) cho ứng dụng lâm sàng

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> TINH SẠCH VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO DIỆT TỰ NHIÊN (NK)<br /> CHO ỨNG DỤNG LÂM SÀNG<br /> Natalia Lapteva1, Susann M. Szmania2, Frits van Rhee2, Cliona M. Rooney1<br /> 1<br /> <br /> Trung tâm nghiên cứu Gene và Tế bào, Đại học Y Baylor, Houston, TX 77030;<br /> 2<br /> Đại học Y Arkansas, Little Rock, AK 72205<br /> <br /> Người dịch: BS. Lương Hoàng Long<br /> Hiệu đính: TS.BS. Nguyễn Thanh Bình<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> *Bản dịch này người dịch đã cố gắng truyền tải thông tin một cách sát nghĩa và dễ hiểu nhất đến với bạn<br /> đọc. Tuy nhiên cũng có thể xảy ra sai sót do chưa thống nhất về một số thuật ngữ và khái niệm mới. Chúng<br /> tôi không chịu trách nhiệm về bất kỳ sai sót y khoa nào khi tham khảo, trích dẫn bài dịch này. Mọi thông tin<br /> chính xác và đầy đủ nhất xin xem bài báo nguyên gốc theo link dưới đây: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/<br /> pubmed/24941378 (Critical Reviews™ in Oncogenesis, 19(1 - 2): 121 – 132 (2014)).<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Tế bào diệt tự nhiên Natural Killer (NK) đã được chứng minh có vai trò quan trọng trong đáp ứng chống<br /> lại khối u và do đó đã được ứng dụng như là một liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư. Trong nghiên<br /> cứu này chúng tôi khái quát các phương pháp hiện có dùng để kích hoạt, làm giàu, nhân dòng và vận<br /> chuyển các chế phẩm tế bào NK dùng cho mục đích lâm sàng.<br /> Từ khóa: tế bào diệt tự nhiên, sản xuất, sản phẩm lâm sàng<br /> Từ viết tắt: AML: Leukemia cấp dòng tủy; B-ALL: Leukemia cấp dòng lympho B; C-ALL: Leukemia cấp<br /> dòng lympho thông thường; H-SCT: Ghép tế bào gốc tạo máu; IL: interleukin; N/A: Không có thông tin; NK:<br /> Tế bào diệt tự nhiên; PBMC: Tế bào đơn nhân máu ngoại vi; SCGM: Môi trường nuôi cấy tế bào gốc.<br /> <br /> I. TỔNG QUAN<br /> Trong vòng 3 thập kỷ qua, đã có rất nhiều<br /> <br /> dung nạp tốt, đồng thời tế bào NK được<br /> <br /> nỗ lực của các nhà nghiên cứu cơ bản và lâm<br /> <br /> truyền có khả năng duy trì với nồng độ cao ở<br /> <br /> sàng để làm sáng tỏ chức năng tế bào diệt tự<br /> <br /> người nhận trong vài tháng dẫn đến các đáp<br /> <br /> nhiên NK trong đáp ứng miễn dịch chống lại<br /> <br /> ứng trên lâm sàng [2 - 4]. Một phác đồ lý<br /> <br /> các tế bào ung thư và để hiểu cơ chế hoạt<br /> <br /> tưởng ứng dụng tế bào NK trên lâm sàng cần<br /> <br /> động của chúng [1]. Các nghiên cứu này đã<br /> <br /> phải tạo ra được các tế bào NK có độ tinh<br /> <br /> dẫn đến các thử nghiệm lâm sàng ứng dụng<br /> <br /> sạch và tiềm năng với số lượng đủ lớn để có<br /> <br /> tế bào NK trong điều trị ung thư. Kết quả của<br /> <br /> thể truyền nhiều lần cùng một sản phẩm. Tế<br /> <br /> các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy việc<br /> <br /> bào NK được truyền cần phải có khả năng<br /> <br /> truyền tế bào NK là an toàn và có khả năng<br /> <br /> nhân lên ở người nhận và chống lại, tiêu diệt<br /> khối u. Một điều cần lưu ý nữa là tế bào NK có<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Lương Hoàng Long, Trường Đại học Y<br /> Hà Nội<br /> Email: longluong.fsh@gmail.com<br /> Ngày nhận: 7/5/2018<br /> Ngày được chấp thuận: 30/6/2018<br /> <br /> 120<br /> <br /> đặc tính kích hoạt miễn dịch chủ động, do đó<br /> có khả năng thu hút các tế bào miễn dịch, kích<br /> hoạt và nhân lên các tế bào T đặc hiệu với<br /> khối u.<br /> <br /> TCNCYH 112 (3) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> II. NGUỒN TẾ BÀO NK VÀ CÁC QUY<br /> TRÌNH NUÔI CẤY<br /> <br /> 108 tế bào diệt tự nhiên (CD3-CD56+)/kg cân<br /> <br /> Đa phần các thử nghiệm lâm sàng ứng<br /> <br /> với ~80% của tổng số tế bào T và B), do đó có<br /> <br /> dụng tế bào NK trong điều trị ung thư đều yêu<br /> <br /> nhiều phương pháp đã được phát triển nhằm<br /> <br /> cầu một lượng tế bào truyền lớn, khoảng 5 x<br /> <br /> làm giàu từ một thể tích lớn máu ngoại vi, như<br /> <br /> 6<br /> <br /> 7<br /> <br /> nặng [7]. Bởi vì tế bào NK chỉ chiếm tỷ lệ nhỏ<br /> trong quần thể tế bào bạch cầu (~1 - 20% so<br /> <br /> 10 đến 5 x 10 tế bào NK (CD3-CD56+) cho 1<br /> <br /> chế phẩm phân tách máu (apheresis), hoặc<br /> <br /> kilogram cân nặng bệnh nhân [2; 3; 5; 6]. Gần<br /> <br /> nhân lên từ một lượng mẫu nhỏ hơn hoặc từ<br /> <br /> đây, có báo cáo đã sử dụng liều cao tới 1 x<br /> <br /> nguồn tế bào gốc (hình 1).<br /> <br /> Loại bỏ tế bào T&B hoặc<br /> làm giàu CD56+ bằng<br /> CliniMACS và hoạt hóa<br /> qua đêm với cytokines<br /> <br /> Chỉ có cytokines<br /> trong 4 - 10 tuần<br /> <br /> Với tế bào nuôi<br /> được tia xạ trong<br /> 10 - 14 ngày<br /> <br /> Tế bào nuôi<br /> <br /> Hình 1. Tế bào NK ứng dụng trên lâm sàng thường thu được từ chế phẩm<br /> phân tách máu tươi hoặc đông lạnh<br /> (A) Máy CliniMACS có thể làm giàu CD56+ bằng việc loại bỏ các dòng tế bào không phải tế<br /> bào diệt tự nhiên, chọn lọc dương tính sử dụng hạt từ gắn anti-CD56 hoặc cả hai phương pháp có<br /> thể được sử dụng để tăng độ tinh sạch tế bào NK. Sau khi trải qua làm giàu bằng CliniMACS, tế<br /> bào NK được truyền trực tiếp hoặc kích hoạt qua đêm bằng IL-2. Thay vào đó, tế bào NK có thể<br /> được nhân lên từ một lượng nhỏ chế phẩm phân tách máu in vitro sử dụng (B) hỗn hợp Cytokine<br /> hoặc (C) bổ sung tế bào nuôi để tăng hiệu quả nhân lên và giảm thời gian cần nuôi cấy để chế<br /> phẩm có thể truyền được.<br /> Các biện pháp tạo dòng tế bào NK dùng<br /> <br /> tăng nhu cầu số lượng tế bào cần ban đầu,<br /> <br /> cho ghép đồng loại thường cố gắng loại bỏ<br /> <br /> nhất là khi khâu loại bỏ nằm cuối cùng trong<br /> <br /> dòng lympho T-CD3+ do chúng có khả năng<br /> <br /> quy trình [8]. Do đó, đa phần các quy trình sử<br /> <br /> gây hội chứng mảnh ghép chống vật chủ<br /> <br /> dụng chế phẩm phân tách máu (apheresis)<br /> <br /> (Graft-vesus-host disease–GVHD) nên làm<br /> <br /> cần 1 - 20 x 109 tế bào đơn nhân làm nguyên<br /> <br /> TCNCYH 112 (3) - 2018<br /> <br /> 121<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> liệu khởi đầu; tuy nhiên, có các quy trình phân<br /> <br /> có thể được xác định bằng máy đếm tế bào<br /> <br /> tách từ các chế phẩm khác như từ lớp buffy<br /> <br /> dòng chảy với các marker CD45+CD56+CD3-<br /> <br /> coats, máu cuống rốn [9; 10]. Tế bào NK trong<br /> <br /> (hình 2).<br /> <br /> máu ngoại vi và từ chế phẩm phân tách máu<br /> <br /> Hình 2. Xác định tế bào diệt tự nhiên trong chế phẩm<br /> phân tách máu bằng máy đếm tế bào dòng chảy<br /> Quần thể tế bào lympho/mono được đánh giá qua các bước (A) biểu đồ FSC và SSC và sau<br /> đó (B) định lượng các tế bào qua cổng CD45+ (C) tế bào NK được định danh là các tế bào<br /> CD56+CD3-.<br /> Trong phương pháp “nhanh”, tế bào NK<br /> <br /> tinh sạch > 95% mà vẫn giữ lại các dòng tế<br /> <br /> được thu từ chế phẩm phân tách máu nhờ 1<br /> <br /> bào CD56+CD3+ (tế bào T giống NK–NKT),<br /> <br /> hoặc 2 lượt loại bỏ tế bào T-CD3+ sử dụng<br /> <br /> cũng có khả năng góp phần vào đáp ứng<br /> <br /> hạt từ CliniMACS gắn thụ thể anti-CD3<br /> <br /> miễn dịch chống lại khối u. Nếu loại trừ thêm<br /> <br /> (CliniMACS, hóa chất CD3), có thể có hoặc<br /> <br /> tế bào CD3+ sẽ tạo ra sản phẩm có độ tinh<br /> <br /> không kích hoạt qua đêm bằng IL-2 hoặc IL-<br /> <br /> sạch lên đến 99%. Tất cả các phương pháp<br /> <br /> 15 [11; 12]. Phương pháp này tạo được đến<br /> <br /> phân tách trên đều dẫn đến giảm số lượng<br /> <br /> 2 x 109 tế bào NK với độ tinh sạch 20%, do<br /> <br /> mong muốn của tế bào NK, do vậy việc đạt<br /> <br /> các tế bào B-CD19+ và tế bào Mono-CD14+<br /> <br /> được độ tinh sạch cao cần phải cân bằng với<br /> <br /> chiếm tới hơn 50% lượng sản phẩm. Việc loại<br /> <br /> tính hiệu quả và an toàn.<br /> <br /> bỏ tế bào B-CD19+ với hạt từ gắn kháng thể<br /> <br /> Bởi các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng<br /> <br /> anti-CD19 (CliniMACS, hóa chất CD19) làm<br /> tăng thêm độ tinh sạch cho sản phẩm tế bào<br /> <br /> sử dụng trong điều trị ung thư cần liều lượng<br /> tế bào NK lớn và nhiều lần truyền nên một lần<br /> <br /> NK,<br /> <br /> dòng<br /> <br /> lọc máu có thể chưa đủ số lượng tế bào NK<br /> <br /> CD56+CD3- vào khoảng 40%. Một cách khác<br /> <br /> yêu cầu. Do vậy, một số phương pháp phức<br /> tạp hơn nhằm nuôi cấy tế bào NK ngoài cơ<br /> <br /> dẫn<br /> <br /> đến<br /> <br /> độ<br /> <br /> tinh<br /> <br /> sạch của<br /> <br /> để làm giàu tế bào NK là phân lập các tế bào<br /> CD56+ với hóa chất CliniMACS CD56 (kháng<br /> thể đơn dòng anti-CD56), có hoặc không có<br /> <br /> thể đã được phát triển. Nuôi cấy tế bào NK<br /> với IL-2 hoặc IL-15 hoặc cả hai để tăng gấp<br /> <br /> bước loại bỏ tế bào T-CD3+, phương pháp<br /> <br /> 1000 lần sản phẩm ban đầu cần thời gian nuôi<br /> cấy lên đến 12 tuần [16 - 18]. Thay vào đó,<br /> <br /> này có thể tạo ra sản phẩm tế bào NK có độ<br /> <br /> phương pháp nuôi cấy tế bào sử dụng “tế bào<br /> <br /> loại bỏ tế bào T-CD3+ [13; 14]. Không cần<br /> <br /> 122<br /> <br /> TCNCYH 112 (3) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> nuôi” (feeder cells) đem lại hiệu quả tốt hơn<br /> <br /> 80 mL. Các túi trữ lạnh được chuyển từ địa<br /> <br /> trong thời gian ngắn hơn, và tạo ra lượng lớn<br /> tế bào NK đủ để truyền trong vòng 10 - 14<br /> <br /> điểm thử nghiệm lâm sàng tới địa điểm xử lý<br /> <br /> ngày [8]. Phương pháp “tế bào nuôi” yêu cầu<br /> sử dụng các cytokine cũng như các tế bào<br /> <br /> odist và Bệnh viện Nhi Texas) ở Houston,<br /> <br /> nuôi qua xử lý phóng xạ, ví dụ như dòng EBV<br /> - LCL hoặc dòng tế bào K562 biến đổi gene,<br /> <br /> cấy, chúng tôi rã đông tế bào đã được phân<br /> <br /> để tạo ra lượng lớn tế bào CD3-56+ với độ<br /> <br /> bò (gấp 3 lần lượng dung dịch lưu trữ) và sử<br /> <br /> tinh sạch trên 70% từ tế bào đơn nhân trong<br /> máu ngoại vi [8; 19; 20]. Berg và cộng sự đã<br /> phát triển một phương pháp trong đó tế bào<br /> NK CD3-CD56+ từ máu ngoại vi được nuôi<br /> cấy cùng với tế bào nuôi EBV-LCL trong môi<br /> trường X-VIVO 20 có bổ sung 10% huyết<br /> thanh người AB bất hoạt, 500 U/mL IL-2 và 2<br /> mM Glutamax. Tế bào NK nhân lên 490 ± 260<br /> lần trong vòng 21 ngày nuôi cấy với độ tinh<br /> sạch tế bào 84,3 ± 7,8% CD56+ [19].<br /> Là một trong các trung tâm hỗ trợ sản xuất<br /> cho liệu pháp tế bào (PACT), nhóm của chúng<br /> tôi phụ trách sản xuất tế bào NK sử dụng điều<br /> <br /> (Đại học Y Baylor, Bệnh viện Houston MethTexas. Vào ngày bắt đầu của quy trình nuôi<br /> tách, rửa trong PBS với 5% huyết thanh phôi<br /> dụng cột Ficoll để loại bỏ tế bào chết và các<br /> tạp chất [22]. Môi trường nuôi cấy được thiết<br /> lập dựa trên số lượng tế bào diệt tự nhiên<br /> CD56+CD3- đếm được bằng máy đếm tế bào<br /> dòng chảy. Mỗi một bình G-Re x 100 (diện<br /> tích bề mặt 100 cm2, thể tích 40 mL) được cấy<br /> một lượng nhất định tế bào lọc chứa 5 x 106 tế<br /> bào NK kết hợp với 5 x 107 tế bào nuôi K562 41BBL-mbIL-15 đã xử lý phóng xạ (100 Gy)<br /> với tỉ lệ tế bào NK so với tế bào K562 là 1: 10<br /> trong môi trường SCGM (CellGenix, Portsmouth, NH) chứa 10% FBS.<br /> <br /> trị các bệnh đa u tủy xương cho các nghiên<br /> <br /> Vào ngày thứ 6 hoặc 7 của chu trình nuôi<br /> <br /> cứu viên tại khoa Y Trường Đại học Arkansas.<br /> <br /> cấy, tế bào NK được phân lập và định lượng<br /> <br /> Chúng tôi đang áp dụng một kỹ thuật nhân<br /> <br /> bằng máy đếm tế bào dòng chảy để xác định<br /> <br /> dòng tế bào NK cải biến được mô tả bởi nhóm<br /> <br /> sự nhân lên và số lượng tế bào NK. Thông<br /> <br /> nghiên cứu của Dario Campana; sử dụng tế<br /> <br /> thường, nếu nuôi cấy trong bình G-Rex,<br /> <br /> bào K562 biến đổi gene để biểu hiện 4-1BBL<br /> <br /> chúng tôi thu hoạch tế bào NK vào ngày thứ 8<br /> <br /> và biểu hiện IL-15 gắn màng (k562-41BBL-<br /> <br /> - 10. Ban đầu, quy trình yêu cầu một nồng độ<br /> <br /> mbIL-15) làm tế bào nuôi [20; 21]. Chúng tôi<br /> <br /> nhỏ IL-2 vào khoảng 10U/mL để kích thích<br /> <br /> đã tối ưu hóa quy trình này cho việc nuôi cấy<br /> <br /> nhân dòng tế bào NK; tuy nhiên, để đánh giá<br /> <br /> tế bào NK trong máy G-Rex (Wilson Wolf<br /> <br /> xem với nồng độ IL-2 lớn hơn liệu có cho số<br /> <br /> manufacturing, Minneapolis, MN) và máy<br /> <br /> lượng và chất lượng tế bào NK nhân lên lớn<br /> <br /> WAVE bioreactor (GE Healthcare Life Sci-<br /> <br /> hơn hay không, chúng tôi đã thử nghiệm liều<br /> <br /> ences, Piscataway, NJ), tạo ra dòng tế bào<br /> <br /> lên tới 1000 U/mL. Nồng độ IL-2 cao hơn đã<br /> <br /> NK được kích hoạt và có khả năng đáp ứng<br /> <br /> không làm tăng khả năng nhân lên hay sức<br /> <br /> cao. Nguyên liệu ban đầu chúng tôi sử dụng<br /> <br /> sống của tế bào NK, tuy nhiên biểu hiện của<br /> <br /> là chế phẩm phân tách máu, trữ lạnh tại nồng<br /> <br /> các thụ thể kích hoạt trên bề mặt tế bào tăng<br /> <br /> độ ~5 x 10 tế bào có nhân/mL trong Plasma-<br /> <br /> lên đáng kể và cải thiện khả năng đáp ứng<br /> <br /> Lyte (CSS) với 10% dimethyl sulfoxide và 5%<br /> <br /> của tết bào NK đối với tế bào ung thư OPM-2<br /> <br /> human albumin trong một số túi (3 - 5 túi) 70 -<br /> <br /> và tế bào K562 (hình 3, không thể hiện dữ liệu).<br /> <br /> 7<br /> <br /> TCNCYH 112 (3) - 2018<br /> <br /> 123<br /> <br /> % ly giải đặc hiệu<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> Hình 3. Tăng hiệu quả tiêu diệt tế bào ung thư OPM-2 bằng tế bào NK<br /> nhân lên cùng với tế bào K562-mbIL15 với liều cao (500 và 1000 U/mL) IL-2<br /> Nuôi cấy tế bào NK trong bình G-Rex có<br /> <br /> 10 x 105 tế bào/mL, các tế bào được đưa vào<br /> <br /> nhiều lợi thế hơn so với các túi và bình thông<br /> <br /> trong các túi WAVE phù hợp và pha loãng đến<br /> <br /> thường khác [23]. Bao gồm tăng sản lượng tế<br /> <br /> 2 x 105 tế bào/mL trong môi trường mới. Môi<br /> <br /> bào nhờ có sự trao đổi khí tốt hơn và giảm<br /> <br /> trường được lắc nghiêng 6°, 6 lần một phút<br /> <br /> thiểu thiếu hụt chất dinh dưỡng, giảm thể tích<br /> <br /> trong vòng 4 - 5 ngày và được thu hoạch bởi<br /> <br /> dịch phải thu hoạch nhờ khả năng rút đi đến<br /> <br /> máy CellSaver5+ instrument (Haemonetics<br /> <br /> 80% dịch thừa mà không gây ảnh hưởng đến<br /> <br /> Corporation, Braintree, MA). Nuôi cấy đồng<br /> <br /> tế bào trên bề mặt nuôi cấy. Với mật độ nuôi<br /> <br /> thời tế bào NK trong bình G - Rex và máy<br /> <br /> cấy khởi điểm của chúng tôi là 1,25 x 104/mL<br /> <br /> WAVE bioreactor cho sản phẩm có số lượng,<br /> <br /> tế bào NK, cả quá trình nuôi cấy không yêu<br /> <br /> chất lượng và tiềm năng tốt hơn (được đo<br /> <br /> cầu thêm 1 lần thay thế môi trường nào.<br /> <br /> bằng đánh giá kiểu hình và đánh giá độc tính).<br /> <br /> Thông thường một bình G-Rex100 có thể thu<br /> <br /> Tuy nhiên, máy WAVE tạo ra sản phẩm chứa<br /> <br /> 8<br /> <br /> được lên đến 5 x 10 tế bào NK. Để đạt được<br /> <br /> ít tế bào T-CD3+ và nhiều tế bào CD56+CD3-<br /> <br /> số lượng tế bào lớn hơn cần nhiều bình G -<br /> <br /> hơn, có lẽ bởi tế bào T ưa môi trường tĩnh.<br /> <br /> Rex, điều này làm tăng giá thành và công sức<br /> <br /> Thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh lý đa u tủy<br /> <br /> bỏ ra. Do vậy, chúng tôi đã tối ưu quy trình<br /> <br /> xương yêu cầu cả tế bào NK tự thân và đồng<br /> <br /> nhân dòng tế bào NK trong máy WAVE biore-<br /> <br /> loại. Trong chế phẩm đồng loại, tế bào T-<br /> <br /> actor khi cần số lượng tế bào NK cao hơn.<br /> <br /> CD3+ được loại bỏ (cũng như tế bào<br /> <br /> Đầu tiên, một môi trường nuôi cấy tĩnh được<br /> <br /> CD3+CD56+) bằng hóa chất CD3 CliniMACS,<br /> <br /> thiết lập trong các túi với mật độ tế bào NK 3 -<br /> <br /> giảm nồng độ tế bào T-CD3+ từ 19 ± 9%<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5 x 10 /mL và tế bào K562-41BBL-mbIL-15 đã<br /> <br /> xuống còn 0,4 ± 0,5% (n = 5). Việc loại bỏ này<br /> <br /> xử lý 100Gy phóng xạ (tỉ lệ 1: 10; NK: K562)<br /> <br /> dẫn đến nồng độ tế bào CD3+CD56- thấp hơn<br /> <br /> trong môi trường SCGM với 10% FBS và<br /> <br /> 5 x 105 tế bào/kg dùng cho sản phẩm truyền<br /> <br /> 500U/mL IL-2. Khi tổng lượng tế bào đạt 8 -<br /> <br /> theo quy định lâm sàng.<br /> <br /> 124<br /> <br /> TCNCYH 112 (3) - 2018<br /> <br />