Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
TỐI ƯU HOÁ QUI TRÌNH THUỶ PHÂN FLAVONOID VÀ XÂY DỰNG<br />
QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID TỪ DỊCH THUỶ PHÂN<br />
LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC<br />
Hoàng Anh Việt*, Dương Thị Đan Thanh*,Nguyễn Thị Kim Oanh, *Nguyễn Hữu Lạc Thủy*,<br />
Võ Thị Bạch Huệ*<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: Nghiên cứu các điều kiện thủy phân flavonoid toàn phần để thu được flavonoid dạng aglycon và<br />
áp dụng phần mềm tối ưu hoá để xác định các điều kiện thuỷ phân flavonoid tối ưu. Từ đó xây dựng qui trình<br />
định lượng quercetin và kaempferol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).<br />
Phương pháp: Khảo sát các phương pháp chiết xuất flavonoid toàn phần và tối ưu hoá các điều kiện<br />
thủy phân flavonoid toàn phần từ lá TNHC. Từ mẫu thử là flavonoid aglycon thu được, xây dựng và thẩm<br />
định qui trình định lượng đồng thời quercetin và kaempferol trong lá TNHC bằng phương pháp HPLC.<br />
Kết quả: Tìm được phương pháp chiết xuất flavonoid bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn và các điều<br />
kiện thủy phân flavonoid đến dạng aglycon. Xây dựng được qui trình định lượng đồng thời quercetin và<br />
kaempferol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và tối ưu hóa các thông số thủy phân flavonoid theo mô<br />
hình Box-Behnken.<br />
Kết luận: Các kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng chiết flavonoid toàn phần và thuỷ phân dịch chiết với<br />
điều kiện tối ưu nhất để thu được flavonoid aglycon với lượng lớn, qui trình định lượng đạt các yêu cầu thẩm<br />
định nên có thể sử dụng để kiểm tra chất lượng nguyên liệu TNHC.<br />
Từ khóa: Trinh Nữ Hoàng Cung, flavonoid, chiết lỏng siêu tới hạn, sắc ký lỏng hiệu năng cao, kaempferol,<br />
quercetin...<br />
<br />
ABSTRACT<br />
OPTIMIZED FLAVONOID HYDROLYSIS AND CONSTRUCTION FLAVONOID QUANTITATIVE<br />
PROCESS BY HPLC FROM HYDROLYSIS EXTRACT OF CRINUM LATIFOLIUM LEAVES<br />
Hoang Anh Viet, Dương Thi Dan Thanh, Nguyen Thi Kim Oanh, Nguyen Huu Lac Thuy,<br />
Vo Thi Bach Hue* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 455 - 462<br />
Objectives: In oder to improve the quality control as well as to isolate flavonoid compounds from Crinum<br />
latifolium L. Conditions for flavonoid extraction and simultaneous quantitation of quercetin and kaempferol in<br />
the leaf extract by HPLC was established.<br />
Methods: Study on conditions for total flavonoid extraction by super - critical fluid and hydrolysis<br />
conditions for flavonoid in the leaf powder of Crinum latifolium L was done. The simultaneous quantitation<br />
quercetin and kaempferol in leaf extract by HPLC was established.<br />
Results: The assay simultaneous of 2 theses flavonoids was studied by LC-DAD method. We also presented<br />
the optimization of the hydrolysis procedure (Box-Behnken schema).<br />
<br />
Conclusions: The simultaneous quantitation method of quercetin and kaempferol in leaf extract<br />
*Bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm - Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp. HCM<br />
Tác giả liên hệ: ThS. Hoàng Anh Việt<br />
ĐT: 0908260987<br />
Email: viethoanganh82@yahoo.com.vn<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Khoa<br />
<br />
455<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br />
<br />
was built and validated with all requirements such as specificity, repeatability, accuracy, linearity and<br />
system suitability. This is the first time of fast, simple HPLC method is reported for the simultaneous<br />
quantitative determination of quercetin and kaempferol in Crinum latifolium L. material.<br />
Key words: Crinum latifolium, flavonoid, HPLC, quercetin, kaempferol…<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
<br />
Phương pháp nghiên cứu:<br />
<br />
Cho đến nay, có nhiều công trình nghiên<br />
cứu lâm sàng đã chứng minh lá Trinh Nữ<br />
Hoàng Cung (TNHC) có tác dụng chữa khỏi<br />
bệnh u phì đại lành tính tuyến tiền liệt góp phần<br />
mang lại niềm tin của bệnh nhân đối với cao<br />
chiết từ lá cây TNHC. Đã có nhiều báo cáo về<br />
thành phần hóa học của lá TNHC thuộc các<br />
nhóm hoạt chất chính như alkaloid, flavonoid(4,5)<br />
và với định hướng chiết cũng như ứng dụng<br />
phần mềm tối ưu hóa(1,2,3) nhằm xác định các<br />
điều kiện thuỷ phân flavonoid toàn phần tốt<br />
nhất để thu được flavonoid aglycon với hiệu<br />
suất cao, nên chúng tôi chọn đề tài “Tối ưu hoá<br />
qui trình thuỷ phân flavonoid và xây dựng qui<br />
trình định lượng flavonoid từ dịch thuỷ phân<br />
lá Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.<br />
Amaryllidaceae) bằng phương pháp HPLC”<br />
<br />
Khảo sát quy trình chiết flavonoid toàn phần<br />
Bột lá Trinh Nữ Hoàng Cung được chiết xuất<br />
bằng cách thăm dò 2 phương pháp khác nhau.<br />
<br />
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
Đối tượng nghiên cứu:<br />
Lá Trinh Nữ Hoàng Cung thu hái tại Bình<br />
Định vào tháng 5 năm 2010.<br />
<br />
Chất đối chiếu, hóa chất, dung môi<br />
- Chất đối chiếu: quercetin do Viện kiểm<br />
nghiệm cung cấp, độ tinh khiết 91,34 % và<br />
kaempferol do Sigma - Aldrich, Singapore cung<br />
cấp, độ tinh khiết ≥ 96%.<br />
- Trang thiết bị: máy HPLC hiệu Waters,<br />
Model Alliance 2695; Detector PDA; Cột<br />
Phenomenex Luna 5u C18(2) 100A0, 250 x 4,6<br />
mm, 5 μm; bể siêu âm Elma (Đức); máy đo pH<br />
hiệu Metrohm (Đức); cân phân tích Sartorius CP<br />
224S (độ nhạy 0,1 mg); nồi cách thủy Memmert<br />
WB -14. Hệ thống chiết lỏng siêu tới hạn của<br />
Công ty TNHH Công nghệ hóa học T. C. L<br />
thuộc Sở Khoa học và công nghệ Tp. Hồ Chí<br />
Minh, Viện công nghệ hóa học, hiệu HS 064 - 08.<br />
<br />
456<br />
<br />
- Ngấm kiệt: làm ẩm một lượng bột lá Trinh<br />
Nữ Hoàng Cung với cồn 96%, để qua 24 giờ, thu<br />
dịch chiết và lắc dịch với cyclohexan 2lần (125 và<br />
75 ml) để xử lý tạp, sau đó cô thu hồi dung môi<br />
(cồn 96%) thu được cao lỏng.<br />
- Chiết lỏng siêu tới hạn: làm ẩm một<br />
lượng bột với cồn theo tỉ lệ 1:1, nạp vào hệ<br />
thống chiết lỏng siêu tới hạn (nhiệt độ 300C, áp<br />
suất 100 bar, khí CO2 đạt trạng thái siêu tới<br />
hạn) và sau đó thu dịch chiết, cô thu hồi dung<br />
môi thu được cao lỏng.<br />
Cân lượng cao thu được sau khi chiết; hiệu<br />
suất chiết được tính theo tỷ lệ của khối lượng<br />
cao lỏng thu được so với lượng lá khô sử dụng,<br />
quan sát thể chất và màu sắc cao lỏng cũng như<br />
thực hiện các phản ứng hóa học để định tính<br />
flavonoid nhằm chọn phương pháp chiết xuất<br />
tốt nhất.<br />
<br />
Thăm dò qui trình chiết xuất flavonoid toàn<br />
phần bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới<br />
hạn và thủy phân flavonoid từ lá TNHC<br />
Sau khi chọn lựa chiết flavonoid toàn phần<br />
bằng phương pháp siêu tới hạn, việc tạo<br />
flavonoid dạng aglycon được nghiên cứu bằng<br />
cách thủy phân flavonoid toàn phần đã chiết từ<br />
lá Trinh Nữ Hoàng Cung trong môi trường acid.<br />
Lượng cao chứa flavonoid dạng aglycon thu<br />
được sau khi thủy phân sẽ được xử lý để triển<br />
khai HPLC<br />
Qui trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ<br />
lá TNHC được tiến hành qua nhiều giai đoạn:<br />
- Giai đoạn 1: Chiết flavonoid toàn phần<br />
bằng phương pháp siêu tới hạn, lặp lại quy trình<br />
đã nghiên cứu với quy mô lớn hơn<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Khoa<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br />
- Giai đoạn 2: Thủy phân flavonoid từ dịch<br />
chiết siêu tới hạn (sử dụng môi trường acid HCl<br />
20%, với nhiệt độ 850C trong thời gian 3 giờ)<br />
- Giai đoạn 3: Chiết flavonoid dạng aglycon<br />
bằng dung môi EtOAc<br />
- Giai đoạn 4: Tinh chế flavonoid dạng<br />
aglycon<br />
- Giai đoạn 5: Phân tích bằng hệ thống HPLC<br />
<br />
Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng<br />
quercetin và kaempferol trong lá TNHC<br />
bằng phương pháp HPLC<br />
Thăm dò các điều kiện để tách quercetin và<br />
kaempferol có trong cao chiết flavonoid đã<br />
thủy phân bằng phương pháp HPLC với đầu<br />
dò PDA. Thưc hiện việc khảo sát tính tương<br />
thích hệ thống; thẩm định quy trình định<br />
lượng rồi xây dựng tiêu chuẩn định lượng<br />
quercetin và kaempferol trong lá TNHC bằng<br />
phương pháp HPLC.<br />
Tối ưu hóa quy trình thủy phân flavonoid<br />
toàn phần trong lá TNHC bằng phần mềm<br />
JMP 4.0<br />
Thay đổi các thông số trong điều kiện thủy<br />
phân như nhiệt độ, thời gian, nồng độ acid để<br />
khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố trên đến<br />
hàm lượng quercetin và kaempferol có trong lá<br />
Trinh Nữ Hoàng Cung trong quá trình chiết xuất.<br />
Phần mềm JMP là phần mềm của SAS<br />
Institute Inc., được phát triển bởi John Sall có<br />
nhiều tính năng từ việc phân tích dữ liệu với<br />
những thuật toán về xác suất thống kê, những<br />
minh họa cụ thể bằng hình ảnh (đồ thị, biểu<br />
đồ…), cung cấp nhiều công cụ để xử lý số liệu,<br />
được sử dụng để tối ưu hoá các điều kiện thuỷ<br />
phân thông qua các thông số hiệu suất chiết xuất<br />
flavonoid (Y %) khi thay đổi các điều kiện thủy<br />
phân ( Xi ): nồng độ acid (X1), thời gian thủy<br />
phân (X2) và nhiệt độ thủy phân (X3).<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Khoa<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br />
Kết quả khảo sát qui trình chiết xuất<br />
flavonoid toàn phần<br />
Bảng 1. Khối lượng và thể chất cao của các phương<br />
pháp chiết<br />
Phương pháp<br />
chiết<br />
Ngấm kiệt<br />
Chiết lỏng siêu tới<br />
hạn<br />
<br />
Khối lượng Khối lượng<br />
Hiệu suất<br />
bột lá ban<br />
cao thu<br />
(%)<br />
đầu (g)<br />
được (g)<br />
700<br />
98,0<br />
14<br />
700<br />
<br />
141,33<br />
<br />
20,19<br />
<br />
Nhận xét: với cùng một lượng dược liệu,<br />
phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn cho hiệu<br />
suất cao hơn so với phương pháp ngấm kiệt.<br />
Phương pháp<br />
chiết<br />
<br />
Màu dịch<br />
chiết<br />
<br />
Ngấm kiệt<br />
<br />
Vàng nâu<br />
<br />
Chiết lỏng siêu tới<br />
hạn<br />
<br />
Xanh lá<br />
<br />
Tốc độ phản Thể chất<br />
ứng hóa học<br />
dịch<br />
định tính<br />
chiết<br />
Chậm<br />
Lỏng<br />
Đậm đặc<br />
Rõ ràng và<br />
dù chưa<br />
nhanh<br />
cô thu hồi<br />
<br />
Do đó phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn<br />
được chọn để xây dựng qui trình định lượng<br />
flavonoid toàn phần có trong lá TNHC.<br />
<br />
Thăm dò qui trình chiết xuất flavonoid<br />
toàn phần bằng phương pháp chiết longr<br />
siêu tới hạn và thủy phân flavonoid từ lá<br />
TNHC<br />
Qui trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ<br />
lá TNHC được tiến hành qua nhiều giai đoạn:<br />
- Giai đoạn 1: Chiết 141,33 gam flavonoid<br />
toàn phần bằng phương pháp siêu tới hạn được<br />
- Giai đoạn 2: Thủy phân flavonoid từ dịch<br />
chiết siêu tới hạn (acid HCl 20%, nhiệt độ 850C;<br />
trong thời gian 3 giờ)<br />
- Giai đoạn 3: Chiết flavonoid dạng aglycon<br />
- Giai đoạn 4: Tinh chế flavonoid dạng<br />
aglycon<br />
- Giai đoạn 5: Phân tích bằng hệ thống HPLC<br />
<br />
457<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Xây dựng và thẩm định qui trình định<br />
lượng quercetin và kaempferol trong lá<br />
TNHC<br />
Thăm dò điều kiện để triển khai HPLC với<br />
đầu dò PDA<br />
<br />
Sau khi tiến hành thăm dò, điều kiện sắc ký<br />
được chọn như sau:<br />
Cột Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 100 A0;<br />
250 x 4,6 mm; 5 μm; pha động: Acetonitril :<br />
H3PO4 (pH = 2,5) = (23,5 : 76,5); nhiệt độ cột:<br />
400C; Thể tích bơm mẫu: 10 μl; Tốc độ dòng: 1<br />
ml/ phút; Bước sóng phát hiện: 355 nm<br />
<br />
Hình 1. Sắc ký đồ của chất đối chiếu quercetin và kaempferol theo điều kiện đã chọn<br />
<br />
Khảo sát tính phù hợp hệ thống<br />
Bảng 2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu đối chiếu quercetin<br />
α<br />
Số lần bơm<br />
t<br />
S<br />
H<br />
K>2<br />
R<br />
<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
TB<br />
SD<br />
RSD%<br />
<br />
18,21<br />
18,20<br />
18,28<br />
18,27<br />
18,25<br />
18,26<br />
18,24<br />
0,03<br />
0,18<br />
<br />
2398536<br />
2396844<br />
2427682<br />
2435825<br />
2454094<br />
2409690<br />
2420445<br />
22689<br />
0.94<br />
<br />
86530<br />
87573<br />
86301<br />
86622<br />
86356<br />
86301<br />
86614<br />
488<br />
0,56<br />
<br />
12,01<br />
12,00<br />
12,06<br />
12,05<br />
12,03<br />
12,05<br />
12,03<br />
0,02<br />
0,19<br />
<br />
1,05 2000<br />
<br />
10.04<br />
10.11<br />
9.87<br />
10.08<br />
10.43<br />
10.02<br />
10.09<br />
0.19<br />
1.86<br />
<br />
1.20<br />
1.19<br />
1.14<br />
1.17<br />
1.15<br />
1.18<br />
1.17<br />
0.02<br />
1.81<br />
<br />
15663<br />
15518<br />
15342<br />
15294<br />
15407<br />
15185<br />
15401<br />
170<br />
1,10<br />
<br />
Bảng 3. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu đối chiếu kaempferol<br />
Rs<br />
α<br />
Số lần bơm<br />
<br />
tR<br />
<br />
S<br />
<br />
H<br />
<br />
K’>2<br />
<br />
1<br />
2<br />
3<br />
4<br />
5<br />
6<br />
TB<br />
SD<br />
RSD%<br />
<br />
35.44<br />
35.62<br />
35.60<br />
35.44<br />
35.45<br />
35.82<br />
35.56<br />
0.15<br />
0.42<br />
<br />
3284688<br />
3270266<br />
3290887<br />
3204003<br />
3190312<br />
3312896<br />
3258842<br />
49901.45<br />
1.53<br />
<br />
73618<br />
72880<br />
72634<br />
73474<br />
72235<br />
71765<br />
72768<br />
712.71<br />
0.98<br />
<br />
24.20<br />
24.08<br />
24.39<br />
24.84<br />
24.53<br />
24.70<br />
24.46<br />
0.29<br />
1.18<br />
<br />
1,05
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
