Tối ưu hóa quy trình real-time PCR định lượng nồng độ ADN virut BK có độ nhạy cao ở bệnh nhân ghép thận

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2019<br /> <br /> TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH REAL-TIME PCR ĐỊNH LƢỢNG<br /> NỒNG ĐỘ ADN VIRUT BK CÓ ĐỘ NHẠY CAO<br /> Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN<br /> Đinh Thị Thu Hằng1; Lê Thị Bảo Quyên 1, 2<br /> Phạm Quốc Toản3; Hoàng Xuân Sử1<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: tối ưu hóa quy trình real-time PCR định lượng nồng độ ADN virut BK có độ nhạy<br /> cao trong huyết tương, nước tiểu ở bệnh nhân sau ghép thận. Vật liệu và phương pháp: kỹ<br /> thuật real-time PCR được phát triển, tối ưu với độ nhạy cao trên cơ sở phân tích trình tự vùng<br /> gen đặc hiệu VP1 của các chủng virut BK từ bệnh nhân sau ghép thận ở Việt Nam và đánh giá<br /> độ chính xác, độ ổn định trên mẫu chuẩn cũng như đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu trên 30 mẫu<br /> nhóm bệnh virut BK (+) và 30 mẫu nhóm chứng người hiến máu tình nguyện virut BK (-). Kết<br /> quả và kết luận: quy trình real-time PCR tối ưu có độ chính xác cao khi đánh giá trên các mẫu<br /> 4<br /> 3<br /> 2<br /> chuẩn nồng độ 10 , 10 , 10 (copy/µl) với hệ số biến thiên nội phản ứng lần lượt là 0,42%;<br /> 1,92% và 1,07%, hệ số biến thiên liên phản ứng lần lượt là 3,38%; 1,28% và 1,47%, độ ổn định<br /> o<br /> 4 tháng ở điều kiện -20 C. Khi đánh giá trên các mẫu nhóm bệnh và nhóm chứng, kỹ thuật đạt<br /> độ nhạy, độ đặc hiệu 100%. Đồng thời, kỹ thuật phù hợp tốt so với kít thương mại Realstar<br /> BKV PCR 1.0 (Hãng Altona) với hệ số Kappa 0,73 trong xác định virut BK. Kết quả bước đầu<br /> cho thấy, kỹ thuật real-time PCR này sử dụng phù hợp hơn trong chẩn đoán virut BK trên bệnh<br /> 2<br /> 4<br /> nhân ghép thận ở Việt Nam, đã định lượng được 8/30 mẫu virut BK (+) có nồng độ 10 - 10<br /> copies/ml mà kít Altona bỏ sót. Như vậy, đã tối ưu thành công quy trình real-time PCR định<br /> lượng virut BK, góp phần theo dõi, giám sát virut BK ở bệnh nhân sau ghép thận, giảm thiểu tối<br /> đa nguy cơ thải ghép do virut BK có nguy cơ dẫn đến bệnh thận.<br /> * Từ khóa: Virut BK; Bệnh thận do virut BK; Ghép thận; Real-time PCR.<br /> <br /> Optimization of a Novel Real-Time PCR Quantitative Assay for BK<br /> Polyomavirus in Renal Allograft Recipients<br /> Summary<br /> Objectives: To optimize a novel high sensitive real-time PCR quantitative assay in plasma and<br /> urine specimens for BK polyomavirus screening strategies and treatment options in renal allograft<br /> recipients. Materials and methods: A real-time PCR assay for BK polyomavirus quantification<br /> was developed and optimized based on sequence analysing of VP1 gene of BK virus strains<br /> isolated from the Northern Vietnamese renal transplant recipients, and evaluated the reproducibility,<br /> 1. Học viện Quân y<br /> 2. Trường Đại học Quốc gia Hà Nội<br /> 3. Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/12/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/01/2019<br /> Ngày bài báo được đăng: 22/01/2019<br /> <br /> 50<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2019<br /> 2<br /> <br /> 3<br /> <br /> 4<br /> <br /> stability on standard panels, including 10 , 10 , 10 copies/µL concentration (recombinant<br /> plasmid), as well as the sensitivity, specificity on control groups. Results and conclusion: Intra<br /> assay precision of optimized real-time PCR assay was excellent reproducibility based on the<br /> 4<br /> linear range of quantification with low CV values which were 0.42%, 1.92% and 1.07% of 10 ,<br /> 3<br /> 2<br /> 10 and 10 standards, respectively. Additionally, a high degree of inter assay precision of the<br /> 4<br /> 3<br /> 2<br /> assay was also identified (CV values were 3.38%, 1.28% and 1.47% of 10 , 10 and 10<br /> o<br /> standards, respectively), and the stability of 4 months when stored at -20 C. Both the sensitivity<br /> and specificity of our assay were 100% when we evaluated on 30 BK polyomavirus (+) samples<br /> and 30 BK polyomavirus (-) samples of volunteer blood donors. Furthermore, a comparison of<br /> 30 BK polyomavirus (+) samples showed a good agreement between this assay and RealStar<br /> BK polyomavirus PCR 1.0 kit results (Altona Diagnostics, Hamburg, Germany) when analyzed<br /> by Cohen's kappa statistic. Notably, 8 other positive BK polyomavirus samples which were<br /> quantified by our assay were undetermined by RealStar BKV PCR 1.0 kit. In conclusion, the<br /> real-time PCR assay is a reliable non-invasive method for measuring BK polyomavirus load in<br /> plasma and urine specimens, and identifying patients at risk of BK virus-associated nephropathy<br /> in Vietnamese renal post-transplant patients.<br /> * Keywords: BK polyomavirus; BK virus-associated nephropathy; Renal allograft recipient;<br /> Real-time PCR.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ghép thận là phương pháp điều trị<br /> thay thế hiệu quả nhất hiện nay cho bệnh<br /> nhân (BN) suy thận mạn giai đoạn cuối.<br /> Phẫu thuật ghép thận được thực hiện<br /> thành công lần đầu tiên ở Việt Nam vào<br /> năm 1992 tại Bệnh viện Quân y 103. Cho<br /> đến nay, nhiều cơ sở y tế trong nước đã<br /> triển khai thành công kỹ thuật này. Phẫu<br /> thuật ghép thận đã giúp những BN suy<br /> thận mạn giai đoạn cuối cải thiện rõ rệt về<br /> chất lượng cuộc sống cũng như hiệu quả<br /> kinh tế. Việc theo dõi điều trị BN sau ghép<br /> thận đóng vai trò rất quan trọng trong duy<br /> trì chức năng thận ghép, giảm thiểu tối đa<br /> nguy cơ mất mô ghép hay suy chức năng<br /> thận ghép. Tuy nhiên, hoạt động của virut<br /> BK (BKV) được cho là có vai trò quan trọng<br /> <br /> dẫn đến suy chức năng thận ghép, thậm<br /> chí mất mô ghép ở BN sau ghép thận [3].<br /> Điều này được lý giải: do BN ghép thận<br /> phải sử dụng các thuốc ức chế miễn dịch,<br /> BKV dạng tiềm ẩn trong tế bào biểu mô<br /> niệu đạo và biểu mô thận có khả năng tái<br /> hoạt động và gây bệnh. Ở những BN này,<br /> nếu không được phát hiện và điều trị kịp<br /> thời sẽ có nguy cơ dẫn đến bệnh thận do<br /> BKV (BK virus-associated nephropathy BKVN) và thải ghép. Tỷ lệ BKVN ước tính<br /> 1 - 10%, hầu hết các trường hợp xảy ra<br /> trong những năm đầu sau ghép thận và ><br /> 50% trường hợp thận ghép bị tác động<br /> bởi BKV [4, 5]. Vì vậy, cần có một công<br /> cụ giám sát BKV hiệu quả góp phần chẩn<br /> đoán sớm và theo dõi điều trị BN sau<br /> ghép thận, ngăn ngừa thải ghép.<br /> 51<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2019<br /> Hiện nay, vấn đề theo dõi và giám sát<br /> BKV ở BN ghép thận ở nước ta chưa<br /> được quan tâm đúng mức. Việc chẩn<br /> đoán ban đầu BKVN thường gặp nhiều<br /> khó khăn do các triệu chứng lâm sàng<br /> không đặc hiệu, có thể nhầm với giai<br /> đoạn thải ghép cấp khi sử dụng thuốc ức<br /> chế miễn dịch, dễ dẫn đến bỏ sót trong<br /> chẩn đoán. Sinh thiết thận ghép để chẩn<br /> đoán mô bệnh học được coi là tiêu chuẩn<br /> vàng trong chẩn đoán BKVN, tuy nhiên,<br /> đây là kỹ thuật xâm lấn dễ gây tổn<br /> thương thận ở BN, đòi hỏi chuyên gia giải<br /> phẫu bệnh có kinh nghiệm. Trong khi đó,<br /> việc xác định, giám sát tải lượng BKV<br /> bằng kỹ thuật real-time PCR trong huyết<br /> tương, nước tiểu BN ghép thận đã được<br /> công nhận là công cụ rất có giá trị trong<br /> giám sát BKV cũng như tiên lượng BKVN<br /> [3]. Chính vì vậy, để chủ động trong theo<br /> dõi, giám sát BKV trên BN ghép thận ở<br /> Việt Nam, chúng tôi thực hiện nghiên cứu<br /> này nhằm: Tối ưu hóa quy trình real-time<br /> PCR định lượng nồng độ BKV ADN có độ<br /> nhạy cao trong định hướng điều trị ở BN<br /> ghép thận.<br /> <br /> khẳng định bằng semi-nested PCR theo<br /> Arthur và CS, trình tự [6] (nhóm bệnh); 30<br /> mẫu máu ngoại vi của người hiến máu<br /> tình nguyện, semi nested PCR (-) (nhóm<br /> chứng) sử dụng để đánh giá độ nhạy, độ<br /> đặc hiệu, sự phù hợp của kỹ thuật realtime PCR định lượng BKV có độ nhạy<br /> cao - trên cơ sở tối ưu kỹ thuật real-time<br /> PCR đã được nhóm nghiên cứu phát triển<br /> trước đó [5]. Các mẫu bệnh phẩm được<br /> cung cấp nhờ hợp tác nghiên cứu giữa<br /> Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự,<br /> Học viện Quân y và Khoa Thận - Lọc<br /> máu, Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện<br /> Việt Đức.<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> <br /> dụng trong phản ứng khảo sát từ 3 - 5 - 9 l.<br /> <br /> 1. Mẫu bệnh phẩm.<br /> Lựa chọn 18 mẫu máu ngoại vi và 12<br /> mẫu nước tiểu của 30 BN sau ghép thận<br /> nhiễm BKV (mỗi BN được lựa chọn một<br /> loại mẫu bệnh phẩm, hoặc mẫu máu hoặc<br /> mẫu nước tiểu), trong đó 5 BN BKVN<br /> được khẳng định bằng chẩn đoán mô<br /> bệnh học, 25 trường hợp còn lại được<br /> 52<br /> <br /> 2. Tối ƣu quy trình real-time PCR<br /> định lƣợng BKV-ADN có độ nhạy cao.<br /> Kỹ thuật real-time PCR phát triển trước<br /> đó [2] được nghiên cứu tối ưu một số<br /> thông số liên quan đến quá trình tách<br /> chiết ADN tổng số cũng như phản ứng<br /> real-time PCR. Cụ thể, lượng mẫu bệnh<br /> phẩm đưa vào sử dụng thể tích là 0,5 ml,<br /> thể tích mẫu ADN thu hồi 54 µl, đảm bảo<br /> cô đặc mẫu tối đa, thể tích ADN khuôn sử<br /> <br /> 3. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR<br /> định lƣợng BKV-ADN trên bộ mẫu<br /> chuẩn.<br /> Đánh giá kỹ thuật real-time PCR trên<br /> bộ panel mẫu ADN - được thiết lập từ<br /> mẫu plasmid tái tổ hợp chứa gen VP1<br /> của BKV [2]. Để phân tích độ chính xác,<br /> ba mẫu chuẩn 102 - 104 (copy/µl) được<br /> chạy lặp lại 3 lần trong cùng một thí<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2019<br /> nghiệm. Sau đó, chạy lặp lại giữa các lần<br /> thí nghiệm, tính trị số trung bình và độ<br /> lệch chuẩn. Đánh giá độ chính xác qua hệ<br /> số biến thiên nội phản ứng và liên phản<br /> ứng [7]. Tương tự, khảo sát hàng tháng<br /> độ ổn định của kít theo thời gian bảo<br /> quản (điều kiện -20oC).<br /> 4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu<br /> của kỹ thuật real-time PCR.<br /> Khảo sát độ nhạy, độ đặc hiệu tương<br /> ứng trên 30 mẫu nhóm bệnh và 30 nhóm<br /> chứng ở trên, so sánh với kít thương mại<br /> RealStar<br /> BKV<br /> PCR<br /> 1.0<br /> (Altona<br /> Diagnostics, Đức). Sự phù hợp (thống<br /> nhất) xác định BKV giữa hai bộ kít được<br /> tính theo hệ số Kappa (K) [7].<br /> Tất cả các thử nghiệm tối ưu và định<br /> lượng đều tiến hành lặp lại 2 lần, lấy giá<br /> trị trung bình, mỗi lần chạy đều kèm theo<br /> chứng âm và chứng dương. Kỹ thuật<br /> real-time PCR định lượng BKV-ADN được<br /> tiến hành tối ưu đồng thời trên hai hệ<br /> thống máy real-time là LightCyler 2.0<br /> (Roche, Đức) và Rotor-Gene Q (Qiagen,<br /> Đức).<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Tối ƣu quy trình real-time PCR<br /> định lƣợng BKV-ADN có độ nhạy cao<br /> ở BN ghép thận.<br /> Quy trình real-time PCR định lượng có<br /> độ nhạy cao, ngoài phụ thuộc vào chiến lược<br /> thiết kế mồi, probe đặc hiệu của kỹ thuật<br /> mà quá trình tối ưu tách chiết ADN, thành<br /> phần phản ứng real-time PCR cũng góp<br /> phần rất quan trọng. Cụ thể, trong nghiên<br /> cứu này, mẫu ADN được tách chiết từ<br /> huyết tương và nước tiểu, ngoài BKV-ADN<br /> có thể còn chứa ADN người và các chất<br /> ức chế phản ứng PCR. Do đó, để tăng độ<br /> nhạy cho phản ứng real-time PCR, thử<br /> nghiệm thể tích BKV-ADN ở các mức 3, 5<br /> và 9 µl. Kết quả với thể tích đầu vào của<br /> mẫu là 9 µl cho chu kỳ ngưỡng sớm hơn<br /> so với các mức 3 µl và 5 µl (hình 1). Như<br /> vậy, kỹ thuật real-time PCR được tối ưu<br /> với thể tích BKV-ADN trong 1 lần chạy<br /> lớn (9 µl) giúp tăng ngưỡng phát hiện và<br /> giảm sai số trong quá trình thực hiện.<br /> Quá trình tối ưu kỹ thuật real-time PCR<br /> thực hiện trên cả hai hệ thống (LightCyler<br /> 2.0 và Rotor-Gene Q) đều cho kết quả<br /> tương đương (dữ liệu không trình bày).<br /> <br /> 9 µl<br /> 5 µl<br /> 3 µl<br /> NC<br /> <br /> Hình 1: Tối ưu thể tích mẫu trong kỹ thuật real-time PCR.<br /> (NC: Đối chứng âm là nước khử ion)<br /> 53<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2019<br /> <br /> 4<br /> <br /> 3<br /> <br /> 2<br /> <br /> 10 10 10<br /> <br /> NC<br /> <br /> Hình 2: Xác định hệ số biến thiên nội phản ứng ở 3 mức nồng độ<br /> 102 - 104 copies/µl bằng kỹ thuật real-time PCR tối ưu.<br /> (NC: Đối chứng âm là nước khử ion)<br /> Bảng 1: Xác định hệ số biến thiên và độ ổn định ở 3 mức nồng độ 102 - 104 copies/µl<br /> bằng kỹ thuật real-time PCR tối ưu.<br /> * Nội phản ứng:<br /> 104<br /> <br /> Nồng độ<br /> Ct<br /> <br /> 20,93<br /> <br /> 21,11<br /> <br /> 103<br /> 21,02<br /> <br /> 23,92<br /> <br /> 24,44<br /> <br /> 102<br /> 24,86<br /> <br /> 27,46<br /> <br /> 26,94<br /> <br /> Ct Mean<br /> <br /> 21,02<br /> <br /> 24,40<br /> <br /> 27,27<br /> <br /> SD<br /> <br /> 0,09<br /> <br /> 0,47<br /> <br /> 0,29<br /> <br /> CV<br /> <br /> 0,42<br /> <br /> 1,92<br /> <br /> 1,07<br /> <br /> 27,43<br /> <br /> * Liên phản ứng:<br /> Nồng độ<br /> <br /> 54<br /> <br /> Lần 1<br /> <br /> Lần 2<br /> <br /> Lần 3<br /> <br /> Lần 4<br /> <br /> Lần 5<br /> <br /> Lần 6<br /> <br /> Lần 7<br /> <br /> Ct<br /> Mean<br /> <br /> SD<br /> <br /> CV (%)<br /> <br /> 10<br /> <br /> 4<br /> <br /> 20,99<br /> <br /> 21,48<br /> <br /> 21,54<br /> <br /> 22,07<br /> <br /> 21,07<br /> <br /> 20,71<br /> <br /> 22,84<br /> <br /> 21,52<br /> <br /> 0,72<br /> <br /> 3,38<br /> <br /> 10<br /> <br /> 3<br /> <br /> 24,45<br /> <br /> 24,71<br /> <br /> 24,87<br /> <br /> 24,77<br /> <br /> 24,22<br /> <br /> 23,99<br /> <br /> 24,57<br /> <br /> 24,51<br /> <br /> 0,31<br /> <br /> 1,28<br /> <br /> 10<br /> <br /> 2<br /> <br /> 27,84<br /> <br /> 28,19<br /> <br /> 28,14<br /> <br /> 27,88<br /> <br /> 27,88<br /> <br /> 27,15<br /> <br /> 28,46<br /> <br /> 27,93<br /> <br /> 0,41<br /> <br /> 1,47<br /> <br />