Tối ưu quy trình khuếch đại hệ gen trong xét nghiệm di truyền tiền làm tổ không xâm lấn

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày đánh giá tính khả thi của việc áp dụng quy trình PGT-A của bộ Kit Ion ReproSeq PGS Kits vào xét nghiệm di truyền tiền làm tổ không xâm lấn niPGT; Tối ưu thể tích buffer lysis phục vụ quá trình khuếch đại DNA tự do từ dịch nuôi cấy.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tối ưu quy trình khuếch đại hệ gen trong xét nghiệm di truyền tiền làm tổ không xâm lấn

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 539 - THÁNG 6 - SỐ CHUYẤN ĐỀ - 2024 TỐI ƯU QUY TRÌNH KHUẾCH ĐẠI HỆ GEN TRONG XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TIỀN LÀM TỔ KHÔNG XÂM LẤN Đặng Tiến Trường1, Nguyễn Lệ Thuỷ2, Lê Liên Hương2, Nguyễn Thanh Tùng1, Trần Hồng Loan3, Bùi Thu Anh1, Nguyễn Thị Nga1, Ngô Văn Nhật Minh1, Trịnh Thế Sơn2 TÓM TẮT 38 (1) Xét nghiệm di truyền tiền làm tổ không xâm Mục tiêu: (1) Đánh giá tính khả thi của việc lấn niPGT với bộ Kit Ion ReproSeq PGS Kits có áp dụng quy trình PGT-A của bộ Kit Ion thể ứng dụng vào lâm sàng. (2) 5µL SCM và 5µL ReproSeq PGS Kits vào xét nghiệm di truyền CEB là thể tích tối ưu được đề nghị sử dụng để tiền làm tổ không xâm lấn niPGT. (2) Tối ưu thể tăng hiệu suất tạo thư viện DNA. tích buffer lysis phục vụ quá trình khuếch đại Từ khóa: Xét nghiệm tiền làm tổ không lấm; DNA tự do từ dịch nuôi cấy. Đối tượng và niPGT; cfDNA phương pháp nghiên cứu: 6 mẫu dịch nuôi cấy của các phôi ngày 5 có kết quả PGT-A bất SUMMARY thường được sử dụng để đánh giá tính khả thi OPTIMIZING THE WHOLE GENOME trong việc áp dụng quy trình PGT-A bộ Kit Ion AMPLIFICATION PROTOCOL IN ReproSeq PGS Kits vào niPGT-A cũng như tối NON-INVASIVE PREIMPLANTATION ưu hoá thể tích buffer lysis phục vụ quy trình GENETIC TESTING (niPGT) này. Kết quả: Quy trình với 5µL môi trường Objective: (1) Evaluate the feasibility of nuôi cấy phôi (SCM) và 2,5µL CEB có nồng độ applying the Ion ReproSeq PGS Kits into the thư viện DNA thấp hơn hiệu suất quy trình tiêu non-invasive preimplantation genetic test niPGT. chuẩn (2,5µL SCM và 2,5µL CEB). Quy trình (2) Optimize lysis buffer volume for whole với 5 µL SCM và 5µL CEB có nồng độ thư viện genome amplification in niPGT. Research DNA cao hơn hiệu suất quy trình tiêu chuẩn. subjects and methods: 6 spent culture mediums Quy trình với 5µL SCM và 5µL CEB có nồng độ of day-5 embryos with abnormal PGT-A results thư viện DNA không ổn định. Biểu đồ CNV thu were used to evaluate the feasibility of applying được từ việc giải trình tự các mẫu được khuếch the Ion ReproSeq PGS Kits for PGT-A into đại bằng các quy trình khác nhau đều xác định niPGT-A as well as optimizing the lysis buffer được các bất thường NST của phôi. Kết luận: volume for this process. Results: DNA library concentration in the protocol with 5µL SCM và 2.5 µL CEB is lower than its standard protocol. 1 Học Viện Quân Y DNA library concentration in the protocol with 2 Bệnh viện Đa khoa Tâm Anh Hà Nội 5µL SCM và 5 µL CEB is higher than its 3 Đơn vị xét nghiệm Genome standard protocol. In the protocol with 10µL Chịu trách nhiệm chính: Trịnh Thế Sơn SCM và 5 µL CEB, the efficiency of producing Email: trinhtheson@vmmu.edu.vn DNA library concentration is unstable. The CNV Ngày nhận bài: 19/04/2024 charts indicated that the protocol of using Ion Ngày phản biện khoa học: 9/05/2024 SingleSeq™ (Thermo Fisher) to perform the Ngày duyệt bài: 22/05/2024 277
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC THƯỜNG NIÊN HỘI HÌNH THÁI HỌC VIỆT NAM - 2024 whole genome amplification of cfDNA extracted (Spent culture medium, SCM) [4-7]. Bộ Kit from SCM and Ion Proton™ Sequencer system Ion ReproSeq PGS Kits với hệ thống giải to sequence WGA samples was able to detect trình tự Ion Proton™ Sequencer của Thermo chromosome abnormalities. Conclusion: (1) The Fisher là quy trình tiên tiến nhất trên thế giới Thermo Ion ReproSeq PGS Kit together Ion hiện này được sử dụng trong lâm sàng đối Proton™ Sequencer system can be used for với xét nghiệm PGT-A. Đây là một một quy performing Non-invasive preimplantation genetic trình thương mại với nhiều tính năng ưu việt testing (niPGT) in clinical trials. (2) The protocol như thao tác đơn giản, thời gian thực hiện with 5µL SCM and 5µL CEB is recommended to quy trình ngắn. Để mở rộng tính ứng dụng use. quy trình này, nhóm nghiên cứu của chúng tôi muốn khảo sát việc sử dụng quy trình I. ĐẶT VẤN ĐỀ trong xét nghiệm niPGT. Lượng cfDNA đầu Xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi vào hạn chế cũng là một thách thức của xét là xét nghiệm kiểm tra những đặc điểm di nghiệm niPGT-A. Khuếch đại toàn bộ hệ gen truyền của phôi IVF, giúp lựa chọn phôi (Whole genome amplification-WGA) đã khỏe mạnh không mang gen bệnh trước khi được áp dụng để giải quyết vấn đề này. thực hiện chuyển phôi [1]. Xét nghiệm này Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hóa đặc biệt quan trọng trong trường hợp người chất khuếch đại toàn bộ hệ gen (WGA) Ion mẹ mang thai khi đã lớn tuổi, chất lượng SingleSeq™ (Thermo Fisher). Đây là bộ hóa trứng bị suy giảm [2]. Tuy nhiên, xét nghiệm chất tiêu chuẩn được khuyến cáo sử dụng PGT vẫn tồn tại một số giới hạn kỹ thuật. cho các mẫu phôi. Để ứng dụng bộ hóa chất Quá trình sinh thiết phôi gây ra những tác này với mẫu cfDNA trong dịch nuôi cấy, động tiêu cực lên sự phát triển của phôi là việc tối ưu hóa quy trình làm việc là yêu cầu một vấn đề gây ra những quan ngại về bắt buộc. Mục tiêu của nghiên cứu này là phương pháp này [3]. Ngoài ra, phôi khảm đánh giá tính khả thi của việc ứng dụng bộ với sự có mặt của hai hoặc nhiều dòng tế bào hóa chất Ion ReproSeq PGS Kits (Thermo khác biệt về mặt di truyền ở trong cùng một Fisher) trong phân tích bộ nhiễm sắc thể của phôi có thể gây dương tính giả và âm tính giả phôi từ mẫu dịch chiết nuôi cấy phôi, tối ưu trong PGT-A. Phân tích môi trường nuôi cấy hóa thể tích dịch nuôi cấy và buffer lysis phôi đã qua sử dụng (Spent embryo culture phục vụ quá trình khuếch đại. media, SCM) phục vụ phân tích di truyền trước làm tổ là phương pháp xét nghiệm II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU không xâm lấn tiềm năng đang được phát 2.1. Đối tượng nghiên cứu triến tại nhiều trung tâm di truyền trên thế Đối tượng nghiên cứu bao gồm 6 mẫu giới. Một số nghiên cứu Capalbo, Katz-Jaffe, dịch nuôi cấy phôi sau khi thực hiện quy Huang ... tập trung vào việc đánh giá một số trình IVF, có chỉ định làm PGT-A cho kết các phân tử nhất định do phôi tiết ra như quả bất thường nhiễm sắc thể. Phôi nang protein, interleukins, micro-RNAs đã đặt nền đang phát triển, có chỉ định làm PGT-A do móng cho hướng nghiên cứu về chẩn đoán tiền sử bố, mẹ có nguy cơ. Phôi nang sau tình trạng di truyền của phôi thông qua các sinh thiết TE, chẩn đoán lệch bội, thể khảm thành phần có trong môi trường nuôi cấy 278
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 539 - THÁNG 6 - SỐ CHUYẤN ĐỀ - 2024 được hiến tặng hoặc bệnh nhân đồng ý tham Hóa chất giải trình tự (dung dịch Ion S5™ gia nghiên cứu. ExT Sequencing, Thermo Fisher); 2.2. Địa điểm nghiên cứu Isopropanol 99% (Merk); một số hóa chất Nghiên cứu được thực hiện chủ yếu tại thông dụng khác dùng trong sinh học phân Phòng Phân tích ADN – Bộ môn Giải phẫu, tử. Học viện Quân Y từ tháng 04/2021 đến Thiết bị thí nghiệm bao gồm: E-Gel™ tháng 06/2021. Power Snap Electrophoresis System 2.3. Hóa chất thiết bị nghiên cứu (Invitrogen); Hệ thống tạo thư viện tự động Hóa chất dùng cho nghiên cứu này bao Ion Chef (Thermo Scientific); Hệ thống giải gồm: Hóa chất đo nồng độ DNA: Qubit trình tự Ion GeneStudio™ S5 Prime; Máy đo dsDNA HS Assay kit (Invitrogen); Bộ Kit Qubit Flurosent 4.0 (Invitrogen); Các thiết bị Ion ReproSeq PGS Kits bao gồm: bộ kit Hóa khác dùng cho xét nghiệm sinh học phân tử. chất khuếch đại toàn bộ hệ gen (WGA) Ion Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên SingleSeq™ (Thermo Fisher),Hóa chất tạo cứu thuộc Phòng Phân tích ADN - Bộ môn thư viện: Ion S5™ Chef Solutions; Chip bán Giải Phẫu, Học viện Quân Y. dẫn Ion 520™ hoặc 530™(Thermo Fisher), III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Thiết kế thí nghiệm Hình 1: Thiết kế thí nghiệm Theo quy trình tiểu chuẩn của bộ hóa chất mẫu dịch nuôi cấy SCM. Chúng tôi sử dụng Ion SingleSeq™, 2,5 µL of cell extraction 2,5 µL SCM và 2,5 µL CEB như quy trình buffer (CEB) được thêm vào ống chứa tế bào tiêu chuẩn (control). Thể tích SCM và CEB phôi với 2,5 µL dung dịch đệm. Trong bước được thay đổi và đánh giá hiệu suất tạo nồng đầu tiên tối ưu hóa quy trình, chúng tôi mô độ thư viện DNA so với quy trình tiêu chuẩn phỏng quy trình PGT-A của mẫu phôi trên (2,5 µL SCM và 2,5 µL CEB). 279
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC THƯỜNG NIÊN HỘI HÌNH THÁI HỌC VIỆT NAM - 2024 3.2. Khảo sát quy trình với 5µL SCM : 2,5µL CEB Bảng 1: Nồng độ thư viện DNA – Khảo sát quy trình với 5µL SCM được sử dụng Hình 2: Biểu đồ CNV – Khảo sát quy trình với 5µL SCM : 2,5µL CEB 280
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 539 - THÁNG 6 - SỐ CHUYẤN ĐỀ - 2024 Nồng độ thư viện DNA của VB1 và VH4 hơn so với quy trình tiêu chuẩn. Biểu đồ lần lượt là 6,7 và 31 ng/µL (Bảng 1). Trong CNV của mẫu tạo thư viện bằng quy trình lúc, nồng độ thư viện DNA của VB1 và VH4 khảo sát và tiêu chuẩn là tương tư nhau khi thực hiên bằng quy trình tiêu chuẩn lần (Hình 2). lượt là 13,2 và 40,6 ng/µL. (Bảng 1). Kết quả 3.3. Khảo sát quy trình với 5µL SCM: này cho thấy quy trình với 5µL SCM và 5µL CEB 2,5uL CEB cho nồng độ thư viện DNA thấp Hình 3: Biểu đồ CNV – Khảo sát quy trình với 5µL SCM: 5µL CEB 281
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC THƯỜNG NIÊN HỘI HÌNH THÁI HỌC VIỆT NAM - 2024 Nồng độ thư viện DNA của NA3 và NL2 DNA cao hơn so với quy trình tiêu chuẩn. lần lượt là 10,4 và 21,2 ng/µL (Bảng 1). Biểu đồ CNV của mẫu tạo thư viện bằng quy Trong lúc, nồng độ thư viện DNA của NA3 trình khảo sát và tiêu chuẩn là tương tư nhau và NL2 khi thực hiên bằng quy trình tiêu (Hình 3). chuẩn lần lượt là 6,25 và 12,8 ng/µL. (Bảng 3.4. Khảo sát quy trình với 10µL SCM 1). Kết quả này chỉ ra rằng quy trình với 5µL : 5µL CEB SCM và 5uL CEB cho nồng độ thư viện Bảng 2: Nồng độ thư viện DNA – Khảo sát quy trình với 10sµL SCM được sử dụng Hình 4: Biểu đồ CNV – Khảo sát quy trình với 10µL SCM: 5µL CEB 282
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 539 - THÁNG 6 - SỐ CHUYẤN ĐỀ - 2024 Nồng độ thư viện DNA của LS1 và LS4 các thành phần trong lysis buffer có thể tạo lần lượt là 13,7 và 17,4 ng/µL (Bảng 2). ra bộ đệm cần thiết cho các phản ứng tiếp Trong lúc, nồng độ thư viện DNA của LS1 theo của bước tiền khuếch đại và khuếch đại. và LS4 khi thực hiên bằng quy trình tiêu Do vậy, thí nghiệm được thiết kế để đánh giá chuẩn lần lượt là 9,95 và 28,2 ng/µL (Bảng vai trò của bước Lysis đối với quy trình 2). Đối với mẫu LS1, nồng độ thư viện DNA WGA của mẫu dịch nuôi cấy, nhằm tối ưu thực hiện với quy trình được khảo sát (10µL lượng cell extraction buffer cũng như rút SCM) cao hơn quy trình tiêu chuẩn 1,5 lần ngắn quy trình xét nghiệm. (Bảng 2). Đối với mẫu LS4 nồng độ thư viện Chúng tôi không kiểm tra quy trình với DNA thực hiện với quy trình được khảo sát 10µL SCM : 10µL CEB bởi vì thể tích mẫu (10µL SCM) thấp hơn quy trình tiêu chuẩn đầu vào tăng lên sẽ làm tăng thể tích hóa chất (Bảng 2). Kết quả biểu đồ CNV tương như cần sử fung, cũng như điều kiện thí nghiệm nhau giữa quy trình đang được khảo sát và của các bước tiếp theo cũng cần phải điều quy trình tiêu chuẩn (Hình 4). Kết quả này chỉnh để phù hợp với một thể tích rất lớn. cho thấy thế tích 10µL SCM cho kết quả tạo Trong thực tế triển khai xét nghiệm niPGT thư viện không ổn định. trong lâm sàng, tăng thể tích hóa chất cần sử dụng sẽ làm tăng chi phí xét nghiệm, những IV. BÀN LUẬN điều chỉnh quá mức của quy trình cũng là Chúng tôi chỉ sử dụng mẫu dịch nuôi cấy một khía cạnh cần xem xét kỹ lưỡng. của phôi đã được xác định mang bất thường Trong bước tiếp của nghiên cứu, chúng NST trong nghiên cứu này. Câu hỏi chính tôi muốn triển khai đánh giá quy trình dã tối chúng tôi muốn trả lời là bộ Kit Ion ưu 5µL SCM: 2,5µL CEB bộ Kit Ion ReproSeq PGS Kits với hệ thống giải trình tự ReproSeq PGS Kits với hệ thống giải trình tự Ion Proton™ Sequencer của Thermo Fisher Ion Proton™ Sequencer của Thermo Fisher có thể phát hiện được phôi mang bất thường trên một số lượng lớn các mẫu lâm sàng. Cỡ NST từ mẫu dịch nuôi cấy hay không. Để trả mẫu lâm sàng đủ lớn là một yếu tố rất quan lời câu hỏi này, mẫu từ phôi mang bất trọng để đánh giá khả năng ứng dụng của thường NST là model nghiên cứu phù hợp. một quy trình trong lâm sàng. Theo lý thuyết tại bước lysis, hoạt động Nhóm nghiên cứu của chúng tôi là nhóm của Enzyme lysis sẽ phá vỡ màng tế bào để đầu tiên tại Việt Nam tiến hành những giải phóng DNA vào môi trường. Vì mẫu nghiên cứu liên quan đến xét nghiệm sàng dịch nuôi cấy phôi đã tồn tại các DNA tự do lọc tiền làm tổ không xâm lấn niPGT. Mục nên bổ sung lysis buffer là không cần thiết. tiêu của nghiên cứu là có thể triển khai xét Tuy nhiên, theo kết quả một số thử nghiệm nghiệm sàng lọc tiền làm tổ không xâm lấn tiền đề của nghiên cửu này cho thấy, bỏ qua niPGT vào lâm sàng giúp vượt qua những bước Lysis để trực tiếp thực hiện bước Tiền giới hạn của xét nghiệm sàng lọc tiền làm tổ khuếch đại sẽ làm giảm hiệu suất của phản xâm lấn, cung cấp thêm nhiều lựa chọn cho ứng WGA. Nguyên nhân được cho là đến từ bác sĩ HTSS trong quá trình làm việc. 283
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC THƯỜNG NIÊN HỘI HÌNH THÁI HỌC VIỆT NAM - 2024 V. KẾT LUẬN 3. Cimadomo, D., et al., The Impact of Biopsy Bộ Kit Ion ReproSeq PGS Kits có thể on Human Embryo Developmental Potential ứng dụng vào lâm sàng trong xét nghiệm di during Preimplantation Genetic Diagnosis. truyền tiền làm tổ không xâm lấn niPGT. (2) Biomed Res Int, 2016. 2016: p. 7193075. Quy trình với 5µL môi trường nuôi cấy 4. Katz-Jaffe, M.G., et al., The role of (SCM) và 5µL buffer lysis tế bào (CEB) là proteomics in defining the human embryonic thể tích tối ưu được đề nghị sử dụng để tăng secretome. Mol Hum Reprod, 2009. 15(5): p. hiệu suất tạo thư viện DNA. 271-7. 5. Fang, F., et al., MicroRNAs secreted by TÀI LIỆU THAM KHẢO human embryos could be potential 1. Feichtinger, M., et al., Non-invasive biomarkers for clinical outcomes of assisted preimplantation genetic screening using array reproductive technology. J Adv Res, 2021. comparative genomic hybridization on spent 31: p. 25-34. culture media: a proof-of-concept pilot study. 6. Huang, G., et al., Evaluation of in vitro Reprod Biomed Online, 2017. 34(6): p. 583- fertilization outcomes using interleukin-8 in 589. culture medium of human preimplantation 2. Haviland, M.J., et al., Comparison of embryos. Fertil Steril, 2017. 107(3): p. 649- pregnancy outcomes following 656. preimplantation genetic testing for 7. Sánchez-Ribas, I., et al., NGS Analysis of aneuploidy using a matched propensity score Human Embryo Culture Media Reveals design. Hum Reprod, 2020. 35(10): p. 2356- miRNAs of Extra Embryonic Origin. Reprod 2364. Sci, 2019. 26(2): p. 214-222. 284