Tổng quan: Các hệ thống vector adenovirus trong nghiên cứu liệu pháp gen

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> TỔNG QUAN: CÁC HỆ THỐNG VECTOR ADENOVIRUS<br /> TRONG NGHIÊN CỨU LIỆU PHÁP GEN<br /> Hoàng Quốc Trường*; Hồ Anh Sơn**<br /> Dương Thuận Thiên***; Nguyễn Lĩnh Toàn**<br /> TÓM TẮT<br /> Adenovirus vector được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về liệu pháp gen, vắc xin<br /> virut tái tổ hợp và trong nghiên cứu cơ bản. Adenovirus vector được sử dụng để chuyển trở các<br /> gen trị liệu vào tế bào (TB) bệnh để phục hồi chức năng bị mất của một số gen, tăng cường hệ<br /> thống miễn dịch của vật chủ, hoặc làm tăng tính nhạy cảm của TB ung thư với thuốc hóa trị<br /> liệu. Một số hệ thống vector adenovirus đã được nghiên cứu phát triển, bao gồm: thế hệ vector<br /> đầu tiên là những vector được xóa bỏ các gen E1a và E1b, thế hệ vector thứ hai là những<br /> vector được xóa bỏ vùng gen E1 và các gen khác của virut, helper-dependent adenovirus<br /> vector được thiết kế xóa bỏ tất cả các trình tự mang mã hóa cho protein của virut. Thế hệ<br /> vector thứ nhất và thứ hai thiết kế và sản xuất tương đối dễ dàng. Thế hệ vector thứ ba ưu việt<br /> hơn cả so với bất kỳ hệ thống adenovirus nào khác do hiệu suất biểu hiện và thời gian biểu<br /> hiện lâu dài của gen chuyển đạt được trong nghiên cứu in vivo. Bài tổng quan này thảo luận<br /> những ưu điểm và hạn chế của vector adenovirus để phát triển các hệ vector ưu việt hơn cho<br /> những nghiên cứu về gen trị liệu trong tương lai.<br /> * Từ khóa: Adenovirus; Liệu pháp gen; Vector.<br /> <br /> REVIEW: ADENOVIRAL VECTOR SYSTEMS FOR GENE THERAPY<br /> summary<br /> Adenoviral (Ad) vectors are widely used in gene therapies, recombinant viral vaccine, and<br /> basic science studies. The vectors can deliver therapeutic genes into cells to recover lost<br /> function of some genes, to enhance the ability of host immune systems, or to increase the<br /> sensitivity of cancer cells to chemotherapeutic drugs. Several adenoviral vector systems have<br /> been developed: first-generation vectors are those with deletion of the E1a and E1b genes,<br /> second-generation vectors with deletions of the E1 and another viral gene, and helperdependent adenovirus vectors removed all coding sequences for viral proteins. The first- and<br /> second-generation vectors are relatively easy to construct and produce. The helper-dependent<br /> adenovirus vectors are substantially superior to any other adenoviral systems for achieving<br /> high-level and longterm expression in vivo. This review focuses on the advantages and<br /> limitations of adenovirus vectors and discusses potential strategies for further improvement of<br /> vectors for gene therapy.<br /> * Key words: Adenovirus; Gene therapies; Vectors.<br /> * Bệnh viện TWQ§ 108<br /> ** Học viện Quân y<br /> *** Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Hoàng Quốc Trường (hqtruong2002@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 16/01/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 04/04/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 07/04/2014<br /> <br /> 1<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> ®Æt vÊn ®Ò<br /> Adenovirus được Rowe và CS phát<br /> hiện từ 1/2 thế kỷ trước qua các thí<br /> nghiệm nuôi cấy virut phân lập từ vùng<br /> vòm họng [1]. Mặc dù adenovirus gây các<br /> bệnh về đường hô hấp, mắt và đường<br /> tiêu hóa, nhưng virut này đã được tập<br /> trung nghiên cứu trong nhiều năm như<br /> một mô hình để tìm hiểu các cơ chế sinh<br /> học của TB có nhân bậc cao, bao gồm: quá<br /> trình phiên mã, xử lý ARN, khuếch đại<br /> ADN, dịch mã và cơ chế bệnh sinh ung<br /> thư. Adenovirus thuộc họ adenoviridae với<br /> 51 kiểu huyết thanh, được chia thành sáu<br /> nhóm (từ A - F) dựa trên trình tự tương<br /> đồng và khả năng ngưng kết TB hồng cầu<br /> người [2]. Hệ gen của adenovirus là chuỗi<br /> đôi có kích thước 36 Kb. Ở hai đầu tận<br /> cùng của hệ gen là hai trình tự lặp tận<br /> cùng đảo ngược (ITR - inverted terminal<br /> repeat) với kích thước từ 100 - 400 bp,<br /> liên kết với protein kết thúc (TP - terminal<br /> protein) bằng liên kết hóa trị. Về hình thái,<br /> adenovirus có vỏ và protein cấu trúc bao<br /> bọc hệ gen của virut với cấu trúc hình<br /> khối 20 mặt. Trên cấu trúc tiếp giáp giữa<br /> hai mặt của vỏ có cấu trúc penton base<br /> giữ vai trò neo giữ protein sợi (fibre<br /> protein) và làm cho virut bám dính với bề<br /> mặt của TB. Mỗi mặt của vỏ virut bao<br /> gồm 03 protein hexon và các protein pIIIa,<br /> pVI, pVIII và pIX (hình 1). Protein VII, có<br /> trình tự peptide nhỏ được gọi là mu [3],<br /> liên kết chặt chẽ với ADN virut, trong khi<br /> protein V được đóng gói với phức hợp<br /> ADN-protein cung cấp liên kết cấu trúc<br /> với vỏ qua protein VI [4]. Các thành viên<br /> của họ adenovirus có khả năng lây nhiễm<br /> TB sau phân bào, thậm chí cả mô biệt<br /> hóa cao như cơ vân, phổi, não và tim. Với<br /> khả năng vận chuyển hệ gen tới nhân và<br /> hiệu quả khuếch đại cao, adenovirus là<br /> <br /> ứng viên số một để biểu hiện và chuyên<br /> chở các gen trị liệu đến TB đích với phạm<br /> vi rộng.<br /> <br /> Hình 1: Cấu trúc của adenovirus: A) Cấu<br /> trúc mô phỏng của adenovirus dựa trên<br /> sự hiểu biết về thành phần polypeptide và<br /> ADN. B) Ảnh chụp kính hiển vi điện tử<br /> của adenovirus [3].<br /> Chu kú nh©n lªn cña<br /> adenovirus<br /> 1. Bám và xâm nhập vào bên trong TB.<br /> Trong tất cả các nhóm, loại trừ adenovirus<br /> nhóm B, hạt virut ban đầu bám vào bề<br /> mặt TB thông qua liên kết của sợi Knob<br /> với thụ thể bề mặt TB tương thích cho<br /> coxsackie B virut [5] được gọi là thụ thể<br /> coxsackie/adenovirus receptor (CAR). Đây<br /> là một protein huyết tương màng có trọng<br /> lượng phân tử 46 kDa thuộc siêu họ<br /> immunoglobulin, cấu trúc bao gồm các<br /> domain bên ngoài màng TB, xuyên màng<br /> và domain trong TB chất [6], với phần<br /> domain ngoại bào cần thiết để liên kết<br /> giữa virut với TB. CAR có chức năng như<br /> phân tử liên kết TB với TB trên bề mặt<br /> màng đáy của TB biểu mô [7]. Phân tử<br /> CD46, là protein điều hòa bổ trợ, được<br /> biết đến như một thụ thể TB cho adenovirus<br /> nhóm B [8]. Sau khi bám dính với bề mặt<br /> TB (hình 2), bộc lộ mô típ RGD trên penton<br /> tương tác với họ protein αν integrin cho<br /> <br /> 2<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> phép virut vào bên trong TB theo cơ chế<br /> phụ thuộc clathrin, thụ cảm thể qua trung<br /> gian nhập bào [8]. Integrins hình thành họ<br /> lớn thụ cảm thể dimer dị hợp như integrin<br /> ανβ3 và ανβ5, cả hai hỗ trợ cho adenovirus<br /> xâm nhập vào bên trong TB, ανβ5 biểu<br /> hiện ở TB biểu mô cuống phổi người, là vị<br /> trí chính của quá trình lây nhiễm adenovirus<br /> in vivo [9]. Tương tác giữa virut với màng<br /> TB cảm ứng một loạt đường truyền tín hiệu<br /> như hoạt hóa con đường phosphoinositide3-OH kinase (PI-3k), kích hoạt họ protein<br /> Rho của GTPases và polymer hóa, tái tổ<br /> chức cấu trúc của actin thuận lợi cho quá<br /> trình nhập bào [10].<br /> <br /> Hình 2: Bám và xâm nhập TB của adenovirus:<br /> A) Tương tác giữa virut và thụ thể TB liên<br /> quan đến liên kết ái lực mạnh qua phần<br /> nhô ra của sợi fibre. Thụ thể bề mặt TB<br /> để adenovirus serotype 5 nhận biết tương<br /> tự như thụ thể nhận biết của coxsackie B<br /> virut và được đặt tên là thụ thể Coxsackie/<br /> Adenovirus receptor (CAR). Sau khi tiếp<br /> xúc TB, B) Tương tác giữa penton base<br /> và αν integrin trên bề mặt TB cho phép<br /> virut xâm nhập vào TB qua quá trình nhập<br /> bào [10].<br /> Sau 20 phút xâm nhập, con đường<br /> truyền tín hiệu Raf/mitogen hoạt hóa<br /> protein kinase (MAPK) được kích hoạt và<br /> sản xuất IL-8 [11]. Đối với Ad2 và Ad5, do<br /> pH axit của thể nội bào (endosome) cảm<br /> <br /> ứng giải phóng hạt virut (virions) vào bên<br /> trong TB chất theo cơ chế chưa được biết<br /> rõ. Trong TB chất (hình 3), protein dynein<br /> chuyên trở các hạt virions theo suốt vi<br /> ống TB (microtubeles) tới nhân, tại đây<br /> chúng tiếp xúc với phức hệ lỗ nhân<br /> (nuclear pore complex, NPC). Loại bỏ vỏ<br /> capsid tại NPC cho phép hệ gen virut xâm<br /> nhập và bắt đầu quá trình phiên mã.<br /> <br /> Hình 3: Mô phỏng vận chuyển vào trong<br /> nhân TB của Ad2: Hạt virut Ad2 tập trung<br /> trên sợi TB chất của lỗ nhân bằng cách<br /> bám với phức hợp protein CAN/Nup214.<br /> Protein histone H1 giải phóng từ nhân và<br /> bám vào protein hexon trên bề mặt gần<br /> nhất của vỏ capsid. Protein importin <br /> hình thành liên kết dimer với protein<br /> importin 7 liên kết protein H1, cảm ứng<br /> xâm nhập phức hệ H1-hexon và kích hoạt<br /> tháo bỏ vỏ capsid. ADN virut được giải<br /> phóng gần vị trí mở của lỗ nhân để<br /> chuyển vào trong nhân TB [10].<br /> 2. Gen sớm và sao chép ADN.<br /> Chu kỳ lây nhiễm của adenovirus được<br /> chia thành 2 pha: Pha “sớm” và “muộn”<br /> tương ứng trước và sau quá trình sao<br /> chép ADN virut (hình 4). Pha sớm bao<br /> <br /> 3<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> gồm quá trình xâm nhập của virut vào<br /> bên trong TB và vận chuyển hệ gen của<br /> virut vào trong nhân, tiếp đến là quá trình<br /> phiên mã và dịch mã lựa chọn của những<br /> gen “sớm”. Quá trình này thúc đẩy các chức<br /> năng của TB, tạo điều kiện sao chép ADN<br /> virut, dẫn đến kết quả phiên mã và dịch<br /> mã các gen “muộn”. Điều này cũng dẫn<br /> đến sự hình thành protein cấu trúc và<br /> hình thành virut hoàn chỉnh. Pha sớm kéo<br /> dài từ 6 - 8 giờ, trong khi pha muộn<br /> thường diễn ra nhanh, thời gian tạo virut<br /> từ 4 - 6 giờ sau đó. Vùng gen được phiên<br /> mã đầu tiên là E1A để tạo ra rất nhiều<br /> mARN và protein bởi quá trình xử lý<br /> mARN khác nhau. Hai vùng gen phiên mã<br /> E1A được tạo ra suốt quá trình lây nhiễm<br /> sớm là: 13S mARN mã hóa cho 289R<br /> (R là ký hiệu cho các amino axit) protein<br /> của virut Ad5 và 12S mARN mã hóa cho<br /> 234R. Những protein này tồn tại vĩnh viễn<br /> trong TB nuôi cấy, khi chúng biểu hiện và<br /> kết hợp với protein E1B, gây hình thành<br /> khối u ở động vật gặm nhấm. Trong suốt<br /> quá trình xâm nhiễm, protein E1A có<br /> chức năng tăng cường hoạt hóa mức độ<br /> phiên mã của các vùng gen khác như:<br /> E1B, E2, E3 và E4 và cảm ứng TB đi vào<br /> pha S của chu kỳ TB, tạo môi trường tối<br /> ưu cho quá trình sao chép của virut.<br /> <br /> Hình 4: Phiên mã hệ gen adenovirus.<br /> Protein E1A được biết đến qua cơ chế<br /> tham gia vào quá trình kiểm soát chu trình<br /> của TB, E1A bám trực tiếp và ức chế các<br /> thành phần tham gia kiểm soát chu kỳ<br /> của TB như cyclin-dependent kinase inhibitor<br /> p21. E1A còn tương tác với một số protein<br /> vật chủ liên quan đến sự hình thành<br /> cấu trúc chromatin như p400 và histone<br /> acetyltransferases (HATs) p300/CBP, pCAF<br /> và TRRAP/GCN5. Giảm điều hòa chu kỳ<br /> TB bởi E1A, kết quả làm tích lũy protein<br /> ức chế u p53 và biểu hiện của E1A trong<br /> suốt quá trình lây nhiễm, thúc đẩy quá<br /> trình chết theo chương trình của TB làm<br /> cho TB nhạy cảm với yếu tố hoại tử u<br /> (TNF-α) và TRAIL (TNF - related apoptosisinducing ligand) theo con đường truyền<br /> tín hiệu death receptor pathways. Sản<br /> phẩm mã hóa bởi E1B-19K có khả năng<br /> ngăn tín hiệu xúc tác cho cả hai đường<br /> truyền tín hiệu kể trên, ngăn TB chết theo<br /> chương trình. Trong trường hợp TNF-α<br /> xúc tác quá trình apoptosis, protein E1B19K có thể bám trực tiếp với protein tiền<br /> apoptotic như Bak và Bax để ngăn chặn<br /> ty thể xúc tác TB chết theo chương trình.<br /> Bên cạnh chức năng ức chế TB chết theo<br /> chương trình, protein E1B-55K còn có vai<br /> trò vận chuyển mARN của virut đến TB<br /> chất trong suốt pha muộn của quá trình<br /> lây nhiễm. Vùng gen E2 mã hóa cho một<br /> số protein cần thiết cho quá trình nhân lên<br /> của hệ gen virut như: ADN polymerase,<br /> protein tiền kết thúc và protein với kích<br /> thước 72 kDa bám chuỗi đơn ADN.<br /> Những protein này là bắt buộc cho cơ chế<br /> nhân lên của virut, tiếp theo là quá trình<br /> sao chép của gen muộn, toàn bộ quá<br /> trình được xúc tác qua tương tác với các<br /> yếu tố nội bào. Sản phẩm vùng gen E3<br /> của virut có thể loại bỏ cho mục đích<br /> 4<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014<br /> <br /> nhân lên của virut trong môi trường nuôi<br /> cấy mô, với vai trò phá vỡ đáp ứng miễn<br /> dịch của vật chủ. Hệ thống miễn dịch phát<br /> triển cơ chế tiêu diệt TB nhiễm virut, bao<br /> gồm ly giải TB bởi TB lympho T gây độc<br /> và hoạt hóa thụ thể xúc tác con đường<br /> chết bào bởi chemokines. Protein E3gp19k hoạt động theo 2 cách để ngăn<br /> chặn trình diện của kháng nguyên virut<br /> bởi phức hợp hòa hợp mô tổ chức lớp I<br /> (MHC class I), sau đó là ly giải TB bởi TB<br /> T gây độc (cytotoxic T cells). E3-gp19k<br /> lần đầu được phát hiện do khả năng ngăn<br /> chặn quá trình chuyển vị của phân tử<br /> MHC lớp I tới bề mặt của TB bằng cách<br /> cô lập chúng trong mạng lưới nội chất.<br /> Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy E3gp19k liên kết với TAP (transporter associated<br /> with antigen processing), là protein chịu<br /> trách nhiệm vận chuyển kháng nguyên<br /> TB chất trong lòng ống, đây là protein ảnh<br /> hưởng trực tiếp đến tải lượng của peptide<br /> trên phức hệ hòa hợp mô tổ chức lớp I<br /> (MHC class I molecules). Các protein E310.4K, 14.5K và 14.7K có chức năng ức<br /> chế cảm ứng chết bào bởi chemokines<br /> TNF-α Fas ligand (FasL) và TRAIL.<br /> Vùng gen sao chép E4 mã hóa protein<br /> (ký hiệu orfs 1-6/7), là các protein giữ vai<br /> trò điều khiển chu trình TB và chuyển<br /> dạng. Protein E4orf1 của Ad9 được<br /> chứng minh có khả năng cảm ứng hình<br /> thành ung thư vú phụ thuộc estrogens trên<br /> chuột. Ở Ad2 và Ad5, E4orf3 và E4orf6<br /> có hoạt tính rất đa dạng, cả hai protein<br /> này đều làm tăng chức năng của gen E1<br /> gây chuyển dạng TB động vật gặm nhấm,<br /> làm tăng mức độ biểu hiện của gen muộn<br /> virut và ức chế hệ gen hình thành<br /> concatemerization bởi enzym đọc sửa<br /> ADN nội bào. Trong trường hợp protein<br /> E4orf6, làm tăng chuyển dạng của TB do<br /> <br /> protein này ngăn chặn protein p53 xúc tác<br /> trans-activation bằng cách ức chế liên kết<br /> các yếu tố phiên mã nội bào p53. Với<br /> nhiều chức năng sinh học đã được liệt kê,<br /> protein E4orf3 xúc tác cho hình thành cấu<br /> trúc nhân được gọi là PML oncogenic<br /> domains. Mặc dù chức năng của những<br /> domain này chưa được biết rõ, nhưng các<br /> số liệu nghiên cứu cho thấy vai trò quan<br /> trọng của chúng trong chuyển dạng TB,<br /> sao chép và chết theo chương trình ở TB<br /> lây nhiễm virut. Phần lớn sản phẩm của<br /> vùng gen E4 đều có hoạt tính kháng<br /> apoptotic, riêng protein E4orf4 tương tác<br /> với phosphatase 2A thúc đẩy quá trình<br /> chết bào không phụ thuộc p53.<br /> 3. Biểu hiện gen muộn và đóng gói<br /> virut.<br /> Promoter muộn chính (MLP, major late<br /> promoter) phiên mã cho gen muộn của<br /> adenovirus được biểu hiện từ 5 vùng gen<br /> (L1 - L5). Đơn vị sao chép muộn chính<br /> (MLTU - The major late transcription unit)<br /> mã hóa cho khoảng 15 - 20 mARN khác<br /> nhau, đều có nguồn gốc từ một tiền<br /> mARN bởi quá trình cắt lối khác nhau và<br /> polyadenylation. Những đơn vị phiên mã<br /> này ban đầu mã hóa cho protein cấu trúc<br /> của virut và protein khác tham gia vào<br /> quá trình đóng gói virut. Sự điều khiển<br /> của gen muộn mã hóa cho cấu trúc của<br /> lớp vỏ capsid đã được nghiên cứu phát<br /> hiện như một chiến lược để thay đổi định<br /> hướng của vector liệu pháp gen. Protein<br /> L1-52/55k là bắt buộc cho quá trình đóng<br /> gói của virut, trong khi protein L4-33K<br /> cũng tham gia vào quá trình lắp ráp virut,<br /> đột biến một phần hay đột biến mất đoạn<br /> gen này sẽ ảnh hưởng đến khả năng<br /> đóng gói của virut.<br /> <br /> 5<br /> <br />