Tổng quan nhuộm soi AFB, cấy vi khuẩn lao và kháng sinh đồ kháng lao

Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> <br /> TỔNG QUAN NHUỘM SOI AFB, CẤY VI KHUẨN LAO<br /> VÀ KHÁNG SINH ĐỒ KHÁNG LAO<br /> Ngô Thanh Bình*<br /> <br /> PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỬ, BẢO nghiệm trong vòng một tuần nhưng tốt nhất là<br /> QUẢN VÀ VẬN CHUYỂN chuyển ngay trong ngày. Để khử trùng mẫu thử,<br /> người ta dùng một số dd để loại bỏ VK ngoại<br /> Mẫu thử được nhuộm soi trực tiếp tìm<br /> nhiễm như: dung dịch (dd) Zepharin gồm<br /> AFB (acid fast bacilli) và cấy tìm vi khuẩn (VK)<br /> Benzalkonium + Trisodium phosphate hoặc<br /> lao được đựng trong những dụng cụ vô trùng<br /> NaOH2%, NaOH4%; dd NaOH2% +<br /> nhanh chóng đem đến phòng xét nghiệm và xử<br /> dithiothreitol; dd NaOH2% + N-Acetyl-L-<br /> lý ngay. Mẫu thử thường được lấy để tìm VK lao<br /> Cysteise (NALC); dd NaOH4% + Dithiothreitol;<br /> là đàm (nếu có nghi ngờ lao phổi). Đàm được lấy<br /> dd NaOH4% + NALC (NALC và Dithiothreitol<br /> làm 3 mẫu liên tục vào sáng sớm khi mới ngủ<br /> dùng ly giải chất nhầy). Mẫu thử sau khi được<br /> dậy. Bệnh nhân (BN) được hướng dẫn để khạc<br /> xử lý bằng dd khử trùng sẽ được quay ly tâm với<br /> ra đàm nhớt từ đường hô hấp dưới hoặc cho BN<br /> vận tốc 3.000 vòng/phút. Sau khi ly tâm, các chất<br /> thở khí dung với nước muối sinh lý ưu trương,<br /> lipids thành tế bào nổi lên sẽ được loại bỏ, chỉ lấy<br /> sau đó lấy mẫu đàm. BN hít sâu 2 - 3 lần, cố gắng<br /> phần cặn lắng chứa các Mycobacteria(2,3,7,34).<br /> ho khạc sâu từ trong lồng ngực. Mở lọ đàm, đưa<br /> PHƯƠNG PHÁP NHUỘM SOI AFB TRỰC<br /> lại gần miệng và nhổ đàm vào lọ (chú ý không<br /> TIẾP<br /> lấy nước bọt hoặc nước mũi). Đóng nắp lọ lại<br /> Quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi (KHV)<br /> một cách chắc chắn. Chất lượng mẫu đàm tốt là<br /> sau khi mẫu thử đã nhuộm acid nhanh (AFB) là<br /> đàm đặc, được khạc sâu từ trong phổi, đàm nhầy<br /> phương pháp (PP) nhanh nhất để tìm VK lao.<br /> mủ, ít nhất là 2 ml đàm. Mẫu đàm có chất lượng<br /> Nếu AFB (+) sẽ hỗ trợ cho bằng chứng bị bệnh<br /> tốt sẽ làm tăng khả năng phát hiện AFB. Trong<br /> lao trước khi có kết quả xác định VK lao bằng PP<br /> trường hợp BN không khạc ra đàm được, nhất là<br /> cấy mẫu thử. Chất lipid cao ở thành tế bào<br /> trẻ nhỏ hoặc BN hôn mê, thì có thể lấy dịch dạ<br /> Mycobacterium ngăn cản sự thấm thuốc nhuộm<br /> dày; nếu BN thở máy có đặt ống nội khí quản thì<br /> anilin. Do đó, VK lao không nhuộm được bằng<br /> có thể lấy đàm qua ống nội khí phế quản. Dịch<br /> kỹ thuật nhuộm Gram mà chỉ có thể nhuộm với<br /> dạ dày được xử lý trong 4 giờ, nên cho thêm<br /> phương pháp (PP) nhuộm acid nhanh. Có 2 PP<br /> Sodium Carbonate hoặc một muối đệm khác<br /> nhuộm acid nhanh thường dùng: (1) Nhuộm<br /> trung hòa acid dịch vị để bảo vệ VK lao hiện<br /> Carbol-fuchsin gồm kỹ thuật Ziehl-Neelsen và<br /> diện trong mẫu thử. Có thể lấy mẫu thử là dịch<br /> kỹ thuật Kinyoun; và (2) Nhuộm Fluorochrome<br /> rửa qua soi rửa phế quản. Các mẫu thử khác<br /> dùng thuốc nhuộm Auramin –<br /> cũng được lấy để soi cấy tìm VK lao (tùy trường<br /> Rhodamine (2,3,7,10,14,23,34).<br /> hợp bệnh lý cụ thể) như: máu, dịch màng phổi,<br /> dịch màng bụng, dịch khớp, nước tiểu, tủy Phương pháp nhuộm Carbol-fuchsin<br /> xương, dịch não tủy, mủ, mô bệnh… Tất cả các Nhuộm Ziehl-Neelsen và nhuộm Kinyoun<br /> mẫu thử nếu không xử lý ngay được nên bảo khác nhau trong kỹ thuật nhuộm là chủ yếu. Kỹ<br /> quản ở 4 – 100C, tốt nhất là để ngăn mát tủ lạnh, thuật Ziehl-Neelsen đòi hỏi hâm nóng Cabol-<br /> cho đến khi chuyển đi. Tránh nhiệt độ cao và fuchsin để thấm vào thành tế bào Mycobacteria.<br /> ánh sáng mặt trời. Chuyển đến phòng xét Kỹ thuật Kinyoun là PP nhuộm “lạnh” bằng<br /> <br /> * Bộ môn Lao và Bệnh phổi - Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: TS Ngô Thanh Bình ĐT: 0908955945, Email: bsthanhbinh@yahoo.com<br /> <br /> 26 Chuyên Đề Nội Khoa I<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan<br /> <br /> cách cho nhiều phenol vào dd nhuộm để tăng mặt tiêu bản hầu như hoàn toàn biến mất<br /> tính thấm vào thành tế bào Mycobacteria. Cả 2 PP đi.<br /> nhuộm đều cho kết quả VK lao bắt màu đỏ nổi (8) Rửa tiêu bản nhẹ nhàng với nước sạch để<br /> bật trên nền xanh methylene. Kính phết được tẩy hết dd thuốc nhuộm, và nghiêng tiêu<br /> quan sát dưới KHV vật kính 100 có ngâm dầu. bản cho chảy hết nước khỏi tiêu bản. Nếu<br /> Kỹ thuật Ziehl-Neelsen tìm AFB trực tiếp trong bề mặt tiêu bản còn màu hồng phải tiến<br /> đàm vẫn được đánh giá là một PP nhanh nhất hành tẩy màu lần thứ hai (từ 1–3 phút), sau<br /> (chỉ sau vài chục phút), dễ làm và rẻ tiền nên đó rửa lại với nước sạch và nghiêng tiêu<br /> được sử dụng rộng rãi. Nhược điểm của PP này bản để nước chảy ra hết.<br /> chỉ cho kết quả soi AFB (+) khi có ít nhất 105 VK (9) Nhỏ Bleu methylen 0,3% phủ kín bề mặt<br /> lao trên một lam kính. tiêu bản và để trong một phút.<br /> Quy trình tiến hành kỹ thuật Ziehl-Neelsen (10) Rửa tiêu bản nhẹ nhàng với nước sạch và<br /> nghiêng tiêu bản cho chảy hết nước khỏi<br /> để nhuộm soi tìm AFB trong đàm<br /> tiêu bản, rồi để khô tự nhiên trong không<br /> (1) Ghi số lên tiêu bản vào bên trái lam kính,<br /> khí. Không làm khô lam bằng giấy thấm.<br /> đảm bảo số tên mỗi tiêu bản tương ứng với<br /> (11) Soi lam dưới KHV với vật kính dầu x100<br /> số ghi trên thành lọ đàm.<br /> (trong khoảng 5 phút) và đọc kết quả. Bắt<br /> (2) Dàn tiêu bản: dùng que lấy mẫu đàm tươi<br /> đầu đọc từ phần giữa đầu trái tiêu bản qua<br /> phết trực tiếp trên lam kính với kích thước<br /> phải, chuyển dòng khác từ phải qua trái.<br /> 1 x 2 cm. Dàn đàm trải đều, mịn ra trên lam<br /> VK lao có hình que, thanh mảnh, hơi cong,<br /> kính, theo đường xoáy ốc liên tục từ trong<br /> bắt màu đỏ đứng riêng biệt hay xếp đôi<br /> ra ngoài. Vết dàn cân đối ở giữa lam, với độ<br /> hoặc từng đám dễ nhận biết trên nền xanh.<br /> dày vừa phải. Để tiêu bản khô tự nhiên<br /> Đếm số lượng AFB và ghi kết quả. Kết quả<br /> trong 15 – 30 phút. Không dùng ngọn lửa<br /> (+) tính phải ghi bằng mực đỏ.<br /> để làm khô.<br /> (3) Cố định tiêu bản: đưa tiêu bản nhanh qua Bảng 1: Cách đọc kết quả của PP nhuộm Carbol-<br /> phía bên trên ngọn lửa đèn cồn từ 3 – 5 lần, Fuchsin<br /> mỗi lần 3 – 4 giây, mặt lam kính có chứa Kết quả soi Kết quả đọc Phân loại<br /> > 10 AFB/1 vi trường Dương tính (+++)<br /> mẫu thử được đặt hướng lên phía trên.<br /> 1-10 AFB/1 vi trường Dương tính (++)<br /> (4) Các tiêu bản được xếp theo thứ tự lên giá 10-99 AFB/100 vi Dương tính (+)<br /> nhuộm, cách nhau mỗi 0,5 cm. Sau đó, trường<br /> nhuộm tiêu bản bằng cách nhỏ dd carbol 4-9 AFB/100 vi trường Dương tính Ghi số VK cụ thể<br /> fuchsin 0,3% lên phủ kín toàn bộ bề mặt 1-3 AFB/100 vi trường Âm tính Xin thử lại<br /> 0 AFB/ 100 vi trường Âm tính 0<br /> tiêu bản và để trong 5 phút. Mỗi lần nhuộm<br /> không quá 12 tiêu bản. Phương pháp nhuộm Fluorchrome<br /> (5) Hơ nóng tiêu bản từ phía dưới cho tới lúc Nhuộm Auramine 0, VK lao có màu vàng<br /> Fuchsin bắt đầu bốc hơi khoảng 5 phút<br /> sáng trên nền đen và dễ dàng thấy dưới vật kính<br /> (không để ngọn lửa lâu và Fuchsin sôi).<br /> 25. Nhuộm Auramine - Rhodamine bằng cách<br /> (6) Rửa tiêu bản với nước sạch, nhẹ nhàng<br /> dưới vòi nước máy để loại bỏ Fuchsin thừa cho thêm Rhodamine vào sẽ cho kết quả màu<br /> và nghiêng tiêu bản cho chảy hết nước khỏi hơi vàng của VK lao. Kỹ thuật này dùng nhuộm<br /> tiêu bản. Lúc này tiêu bản có màu hồng. những mặt cắt mô để tìm VK lao. Đếm số lượng<br /> (7) Tẩy màu tiêu bản đã nhuộm bằng cách nhỏ AFB trên những lam nhuộm Fluorochrome dưới<br /> dd H2SO4 25% (hoặc dd HCL 3%) lên tiêu KHV vật kính 25.<br /> bản và để trong 3 phút. Màu hồng trên bề<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa I 27<br /> Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Bảng 2: Cách đọc kết quả của PP nhuộm Dàn tiêu bản không quá dày hoặc quá mỏng.<br /> Fluorochrome Cố định tiêu bản đủ thời gian. Nhuộm Carbol<br /> Số lượng VK thấy được Kết quả Fuchsin đủ trong 5 phút và phải đọc đủ 100 vi<br /> 0 AFB / lam kính âm tính trường.<br /> 1-2 AFB /lam (+)<br /> Lọ đàm, tiêu bản và phiếu xét nghiệm phải<br /> 3-9 AFB /lam (++)<br /> (+++)<br /> ghi chính xác. Đối chiếu sổ xét nghiệm chính xác<br />  10 AFB /lam<br />  1 AFB /quang trường (++++) trước khi ghi kết quả. Ghi và báo cáo kết quả<br /> chính xác.<br /> PP nhuộm Fluorochrome nhạy hơn PP<br /> nhuộm Carbol-fuchsin. Kính phết nhuộm PHƯƠNG PHÁP CẤY ĐỊNH DANH VI<br /> Fluorochrome có thể được quan sát dưới KHV KHUẨN LAO<br /> vật kính 25. Trong khi vật kính dầu dùng để Mẫu thử sau khi được nhuộm soi AFB trực<br /> quan sát kính nhuộm Carbol-fuchsin. PP nhuộm tiếp, cho dù kết quả dương hay âm, cũng đều<br /> Fluorochrome là PP nhuộm không phân biệt nên cấy để xác định VK lao. Xác định sớm tình<br /> được những vi sinh vật chết. trạng VK lao kháng thuốc là một trong những<br /> Ngoài ra, VK lao đã được điều trị bằng hóa ưu tiên của chương trình chống lao nhằm giúp<br /> trị liệu có thể nhuộm bằng PP huỳnh quang. đề ra chiến lược điều trị lao thích hợp và giám<br /> Tuy nhiên, thầy thuốc lâm sàng nên chú ý sát chặc chẽ sự kháng thuốc. Xác định VK lao<br /> rằng sự hiện diện của VK lao qua PP soi trực kháng thuốc được thực hiện bằng những PP<br /> tiếp không thể chắc chắn chẩn đoán bệnh lao xét nghiệm cổ điển dựa vào việc xác định sự<br /> (dương tính giả). phát triển của VK lao với sự có mặt của thuốc<br /> Phòng ngừa đọc sai kết quả nhuộm soi AFB kháng lao. Tuy nhiên, PP này đòi hỏi phải có<br /> thời gian dài cần thiết để cho kết quả. Những<br /> Phòng ngừa đọc sai kết quả dương tính<br /> năm gần đây, nhiều kỹ thuật mới đã được tiếp<br /> Đảm bảo không có thức ăn hoặc chất xơ cận bao gồm các PP dựa vào kiểu hình và PP<br /> trong mẫu đàm. Tốt nhất cho BN súc miệng dựa vào kiểu gen. Các PP xác định VK lao<br /> bằng nước sạch trước khi khạc đàm để không bị kháng thuốc(2,3,6,7,10,11,14,17,20,21,23,34):<br /> lẫn thức ăn.<br /> Môi trường nuôi cấy kinh điển<br /> Dùng tiêu bản (lam kính) mới, không có vết<br /> trầy xước. Sử dụng que phết đàm riêng cho từng Có 4 loại môi trường cấy kinh điển khác<br /> bệnh phẩm. Dùng Carbol Fuchsin đã được lọc và nhau được dùng để nuôi cấy VK lao như môi<br /> còn hạn sử dụng. Không để Carbol Fuchsin khô trường trứng, môi trường agar, môi trường<br /> trong khi nhuộm. Tẩy màu bằng cồn acid. chất lỏng và môi trường chọn lọc.<br /> <br /> Không để vật kín dầu chạm vào tiêu bản. Môi trường trứng (egg-based)<br /> Lau vật kính dầu sau mỗi lần soi tiêu bản (+). Chứa các thành phần như trứng, khoai tây,<br /> Các lọ đàm, tiêu bản và phiếu xét nghiệm muối, glycerol và malachite green (một loại<br /> phải được ghi chính xác. Đối chiếu sổ xét nghiệm thuốc nhuộm). Môi trường này được làm đặc bởi<br /> chính xác trước khi ghi kết quả. Ghi và báo cáo nhiệt độ 85 - 900C trong 30 - 45 phút, gồm: (1)<br /> kết quả chính xác. môi trường Lowenstein - Jensen thường dùng<br /> nhất; (2) môi trường Petragnani ức chế VK tạp<br /> Phòng ngừa đọc sai kết quả âm tính nhiễm mạnh nhất dùng trong những tạp khuẩn<br /> Đảm bảo bệnh phẩm là đàm, không phải mạnh; (3) môi trường American Throracic<br /> nước bọt. Chọn mẫu đàm đặc, mủ để làm tiêu Society là môi trường hữu dụng cho Mycobacteria<br /> bản. Đủ số lượng đàm cần thiết (ít nhất là 2 ml). mọc và phát triển đối với mẫu thử không bị<br /> <br /> <br /> <br /> 28 Chuyên Đề Nội Khoa I<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan<br /> <br /> ngoại nhiễm. Môi trường Thành phần Tác nhân ức chế<br /> Middlebrook Muối, glycerol, albumine, Malachite-green<br /> Môi trường thạch (agar –based) 7H11 vitamines, cofactors, oleic 0,0025%<br /> Gồm Middle brook 7H10; Middle brook acid, catalase,<br /> 0,1%casein hydrolysate.<br /> 7H11; Middle brook 7H12. Các môi trường Middlebrook 7H9 broth, casein 5 loại KS.<br /> Middle brook 7H10 và 7H11 là môi trường chứa 7H12 hydrolysate, bovine<br /> serum albimine, catalase,<br /> agar, hợp chất hữu cơ, muối, glycerol, và 14<br /> C.-palmitic acid.<br /> albumine. Môi trường Middle brook 7H11 khác<br /> Bảng 4: Các môi trường cấy tìm VK lao có chọn lọc<br /> với 7H10 vì có cho thêm 0,1% casein hydrolysate,<br /> Môi trường Tác nhân ức chế<br /> chất này làm tăng tốc độ phát triển có chọn lọc<br /> Mycobacterium. Nói chung, VK lao phát triển tốt Lowenstein-Jensen Penicilline, Nalidixic acid, và<br /> trong môi trường Middle brook 7H11 hơn là môi Gruft Malachite green.<br /> trường Lowenstein-Jensen. Middlebrook 7H11 Carbenicilline, Polymycine B,<br /> chọn lọc Trimethoprim lactate, Amphotericin<br /> Môi trường chất lỏng B, và Malachite green.<br /> R<br /> Mycobactosel Lincomycine, Cycloheximide,<br /> Được dùng trong kỹ thuật MODS Lowenstein-Jensen Nalidixic acid, và Malachite green.<br /> (Microscopic observation broth-drug Middlebrook 7H12 Polymyxin, Azlocilline, Nalidixic acid,<br /> susceptibility assay) dùng để phát hiện sớm M. bức xạ Trimethoprim, và Amphotericin B.<br /> <br /> tuberculosis mọc trong môi trường chất lỏng, rút Kỹ thuật cấy tìm VK lao qui ước<br /> ngắn thời gian chẩn đoán và làm kháng sinh Sau khi quay ly tâm mẫu thử lấy 0,25 ml<br /> (KS) đồ. PP này dựa trên quá trình tạo thành lõi phần cặn lắng của mẫu thử phết trên bề mặt<br /> đặc trưng của M. tuberculosis trong môi trường môi trường cấy chứa trong ống nghiệm và hòa<br /> chất lỏng được quan sát dưới KHV với mặt thấu 0,5 ml nếu trên môi trường cấy trong đĩa. Nắp<br /> kính lồi. đậy ống nghiệm để hé mở để cung cấp đủ khí<br /> Môi trường chọn lọc CO2 cho môi trường cấy. Còn đĩa chứa môi<br /> Là môi trường cấy được cho thêm KS để ức trường cấy được đặt trong túi nhựa<br /> chế VK ngoại nhiễm. Một số môi trường chọn polyethylene có thể thấm được CO2. Tất cả<br /> lọc thường dùng gồm: Lowenstein-Jensen Gruft; môi trường cấy được ủ trong 8 tuần ở nhiệt độ<br /> Mycobactosel® (BBL Microbiology Systems, 350C, trong đó 3 - 4 tuần đầu tiên của thời gian<br /> Cockeysville, MD); Selective Middle brook 7H11 ủ nên để 5 - 10% áp lực CO2 trong môi trường<br /> (S7H11); BACTEC® Middle brook 7H12. cấy. Những mẫu thử có AFB dương tính,<br /> nhưng kết quả cấy âm tính sau 8 tuần ủ thì<br /> Bảng 3: Các môi trường cấy tìm VK lao:<br /> nên ủ thêm 8 tuần nữa. Trong 4 tuần đầu tiên<br /> Môi trường Thành phần Tác nhân ức chế<br /> Môi trường trứng (Egg based)<br /> thì phải kiểm tra hai lần mỗi tuần, và 4 tuần<br /> Lowenstein- Trứng đông lạnh, muối, Malachite-green còn lại thì tối thiểu một lần mỗi tuần. Khi<br /> Jensen glycerol, khoai tây lát. 0,025% những khúm Mycobacteria mọc quan sát được<br /> Petragnani Trứng đông lạnh, khoai Malachite-green thì các kỹ thuật khác có thể được thực hiện<br /> tây, glycerol, sữa, khoai 0,052%<br /> tây lát. dựa trên các khúm VK lao đang mọc như: lam<br /> American Lòng đỏ trứng đông lạnh, Malachite-green kính phết nhuộm acid nhanh, KS đồ, xét<br /> Thoracic glycerol, khoai tây miếng. 0,02%<br /> Society<br /> nghiệm hóa sinh, xét nghiệm khảo sát acid<br /> Môi trường thạch (Agar based) nucleic. Cấy tìm M. tuberculosis có thể được<br /> Middlebrook Muối, glycerol, dextrose, Malachite-green phát hiện 12 ngày sau khi tiêm trên môi<br /> 7H10 albumine, vitamines, 0,0025% trường trứng hoặc trên môi trường không<br /> cofactors, oleic acid,<br /> catalase. chọn lọc trong đĩa cấy. Tuy nhiên, thời gian<br /> mọc trung bình trong môi trường thuận lợi là<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa I 29<br /> Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> 3 - 4 tuần. Có những chủng đòi hỏi 6 tuần có ống đèn lọc huỳnh quang. Ống đèn lọc này<br /> trước khi những khúm VK có thể phát hiện rõ tạo ra khí Cyanogen chloride phản ứng với<br /> ràng. Tốc độ mọc thật sự của Mycobacteria Niacin tự do trong dịch chiết xuất và cho ra kết<br /> được xác định bởi nuôi cấy cấp hai trong môi quả màu vàng. Kết quả này được gọi là xét<br /> trường canh cấy Middlebrook 7H9 và ghi nghiệm Niacin dương tính chứng tỏ mẫu thử có<br /> nhận thời gian cần thiết cho sự phát triển VK chứa M. tuberculosis. Mặt khác, M. tuberculosis<br /> lao. Những khúm M. tuberculosis thì gồ ghề, không thể chuyển hoá chất niacin sản xuất ra,<br /> giống như bông cải và có màu da bò nhạt. bài xuất vào môi trường nuôi cấy. Có nhiều<br /> Các PP khác cấy tìm VK lao phương pháp phát hiện Niacin và các phương<br /> pháp này đều phải cho thêm cyanogen bromide.<br /> Phát hiện bằng đo bức xạ kế<br /> Xét nghiệm khử Nitrat<br /> Là một kỹ thuật tự động đã được phát<br /> triển trong việc phát hiện nhanh VK lao mọc Cho biết khả năng của một chủng sản xuất ra<br /> trên các mẫu thử. Hệ thống BACTEC® enzym khử nitrate thành nitrite, dùng để phân<br /> (Johnston Laboratories Inc., Cockeysville, MD) biệt M. tuberculosis với Mycobacteria tạo sắc tố<br /> dùng môi trường Middle brook 7H12 lỏng trong tối (scotochromogenic Mycobacteria) và M.<br /> chứa acid palmatíc đánh dấu C14 để phát hiện avium-intracellular complex. M. tuberculosis có<br /> VK lao mọc bằng bức xạ kế. C đánh dấu được chứa men nitroreductase và cho kết quả dương<br /> tạo ra như CO2 trong suốt quá trình mọc và tính mạnh. Một loopful Mycobacteria đang mọc<br /> trao đổi khí. Khi sự phát triển VK lao đạt đến có hoạt tính được nhũ tương hóa trong dd<br /> sự phát triển được quyết định trước là số mũ<br /> Sodium Nitrat và ủ trong 2 giờ ở 370C trong một<br /> 10, như được quyết định bởi số lượng CO2<br /> bồn nước. Những chất phản ứng thử xét nghiệm<br /> được tạo ra, một kết quả dương tính được ghi<br /> (gồm dd Sulfanilamide và Noun-<br /> nhận bởi hệ thống BACTEC®. Thuận lợi của kỹ<br /> naphthylenediamine) được cho vào môi trường<br /> thuật này rút ngắn thời gian phát hiện sự tăng<br /> trưởng của VK lao và phân biệt M. tuberculosis sau khi ủ. Nếu xuất hiện màu đỏ thì kết quả xét<br /> với các loại Mycobacterium không điển hình nghiệm được xem là dương tính. Ngược lại, thì<br /> khác trong 4 – 6 ngày. cho thêm bột kẽm vào, nếu màu đỏ xuất hiện thì<br /> kết quả xét nghiệm âm tính thật sự. Các xét<br /> PP sinh hóa để nhận dạng VK lao<br /> nghiệm này cho kết quả nhanh, dễ thực hiện và<br /> Nhận dạng M. tuberculosis đã dựa trên một<br /> là hai xét nghiệm xác định về mặt sinh hóa<br /> số tiêu chuẩn cổ điển bao gồm: nhuộm acid<br /> nhanh, tỉ lệ mọc, hình thái khúm VK, sự tiết thường dùng nhất để định danh M. tuberculosis.<br /> niacin, sự giảm tiết nitrat, bất hoạt hóa men Một chủng có phản ứng (+) với cả xét nghiệm<br /> catalase ở 680C và tính nhạy cảm với Thiophene- niacin và xét nghiệm khử nitrate có thể định<br /> 2-Carboxylic Hydrazide (TCH). danh khá chắc chắn là M. tuberculosis.<br /> Xét nghiệm Niacin Xét nghiệm P Nitro--acetylamino--<br /> Niacin là một chất chuyển hóa tan được hydroxypropiophenone (NAP)<br /> trong nước của các mẫu thử có chứa Dùng để phân biệt phức hợp M. tuberculosis<br /> Mycobacteria, và được sản xuất ra sau 3-4 tuần với các loại khác. Cơ chế: dựa trên sự ức chế<br /> nuôi cấy. Hầu hết các mẫu thử đều có chứa men phức hợp M. tuberculosis bởi NAP. PP này được<br /> chuyển hóa Niacin tự do thành Niacin dùng trong hệ BACTECR bức xạ kế, cho phép xác<br /> ribonucleotide. Những M. tuberculosis thiếu vắng định phức hợp M. tuberculosis trong 5 ngày sau<br /> men này thì chất Niacin tự do sẽ được chiết xuất khi đã được cấy mọc trong môi trường Middle<br /> từ môi trường nuôi cấy và cho vào ống nghiệm brook 7H12.<br /> <br /> <br /> 30 Chuyên Đề Nội Khoa I<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan<br /> <br /> Xét nghiệm nhạy cảm với Thiophene -2-Carboxylic theo dõi sự phát hiện acid tuberculostearic và<br /> acid hydrazide (TCH) acid mycocerosic trong mẫu đàm được cấy 5<br /> Dùng để phân biệt M. tuberculosis và M.bovis. ngày được báo cáo là hữu ích cho việc chẩn đoán<br /> M. bovis nhạy cảm với TCH, còn M. tuberculosis lao trong thời gian gần đây. Tuy nhiên, PP này<br /> thì đề kháng. TCH được hợp nhất vào môi không thực tiễn cho phòng xét nghiệm lâm sàng<br /> trường cấy agar 7H11 với tỉ lệ nồng độ là 1 và 5 thường quy.<br /> /ml. Môi trường được cấy VK lao và ủ trong Xác định bằng khảo sát acid Nucleic<br /> thời gian từ 14 - 21 ngày ở 370C, với áp suất CO2 Khảo sát acid nucleic đã mở ra một kỷ<br /> là 5 - 10%. Sự nhạy cảm với TCH được quyết nguyên mới đối với phòng xét nghiệm lâm<br /> định khi khúm VK lao mọc trên môi trường agar sàng trong việc xác định nhiều loại<br /> 7H11 có chứa KS tự do và không mọc trên môi Mycobacteria. Khảo sát này được thực hiện<br /> trường TCH. nhanh chóng và dễ dàng mà bất cứ phòng xét<br /> Xét nghiệm Catalase nghiệm lâm sàng nào cũng có thể dùng khảo<br /> Hầu hết các Mycobacteria bao gồm cả M. sát này để xác định môi trường cấy. Đồng thời<br /> tuberculosis đều sản xuất ra men catalase. Tuy hiện nay dùng PP PCR (Polymerase Chain<br /> nhiên, số lượng men catalase được sản xuất ra và Reaction) để tìm VK lao bằng cách phóng đại<br /> tính ổn định của nó ở 680C thì phụ thuộc tùy loại những đoạn ADN của Mycobacterium có trong<br /> Mycobarterium. (1) Xét nghiệm định lượng: cho dd mẫu thử lên gấp nhiều lần, rồi dùng những<br /> Tween-80-peroxydase (có chứa hydrogen đoạn ADN mẫu đã được sản xuất của phòng<br /> peroxide 30%) vào môi trường cấy Lowenstein- xét nghiệm đem so sánh, cho phép xác định<br /> Jensen được để nghiêng có các khúm tế bào được chủng Mycobacteria. Độ nhạy của xét<br /> Mycobacterium đang mọc. Phản ứng được quan nghiệm này khoảng 70% nhưng độ chuyên<br /> sát sau 5 phút, xuất hiện những cột khí và đo biệt thì rất cao từ 98 - 99%. Những kỹ thuật dò<br /> kích thước các cột khí này. Kết quả: nếu < 50mm tìm phóng đại trực tiếp chuỗi ADN giúp xác<br /> là M. Tuberculosis; nếu  50mm là M. Fortuitum. định sự hiện diện của M.tuberculosis trong vài<br /> (2) Tính ổn định: M. tuberculosis tiết ra men giờ. Hai xét nghiệm được sử dụng rộng rãi, đó<br /> catalase không ổn định với nhiệt. Ở nhiệt độ là xét nghiệm Gen-Probe MTD (Gen-Probe,<br /> 680C trong 20 phút thì men catalase bất hoạt. Còn Incorporated; San Diego) và xét nghiệm<br /> M. Fortuitum tiết ra men catalase ổn định với Amplicor M.tuberculosis (Roche Diagnosis<br /> nhiệt. Do đó, khi lấy một mẫu thử đun nóng ở Systems, Branchburg, NJ), có độ nhạy và độ<br /> 680C trong 20 phút và cho dd Tween 80-peroxide chuyên biệt rất cao đối với mẫu AFB (+)<br /> vào. Nếu không tạo thành bọt khí thì đó là mẫu nhưng giá trị tiên đoán dương tính thấp mẫu<br /> thử có chứa M. tuberculosis. soi AFB (-). Những xét nghiệm này chỉ có giá<br /> trị đối với mẫu đàm, dịch mà không có giá trị<br /> Xác định bằng PP sắc ký phát hiện các tổn thương lao ngoài phổi.<br /> Lipids thành tế bào Mycobacteria được chiết<br /> PP phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên<br /> xuất bằng một kỹ thuật chiết xuất ether-hexane<br /> của VK lao trong máu<br /> đòi hỏi chỉ một looful VK (0,001ml). Chất chiết<br /> xuất được ly giải bởi một sắc ký khí được trang Khi bị nhiễm lao, cơ thể sẽ tạo ra đáp ứng<br /> bị với một cột thủy tinh và một máy dò ion hóa kháng thể và đáp ứng trung gian tế bào. Để phát<br /> bằng ngọn lửa. PP đơn giản và có kết quả sau 2 hiện các kháng nguyên VK lao hoặc kháng thể<br /> giờ. Một tiêu chuẩn tham khảo được kiểm tra tương ứng trong máu, người ta đã dùng kỹ thuật<br /> hàng ngày để cung cấp cho người làm sắc ký miễn dịch hiện đại như miễn dịch huỳnh quang,<br /> một kết quả chính xác nhất. Ion được chọn lọc miễn dịch phóng xạ, miễn dịch men (ELISA),<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa I 31<br /> Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> ngưng tụ hồng cầu thụ động, ngưng kết tế bào ở những vùng có tần suất lao kháng thuốc cao.<br /> toàn bộ, điều chế kháng thể đơn dòng. Hiện nay,  BN hiện là phạm nhân đang bị ở tù.<br /> những PP này không thực hiện trong các phòng<br />  Bị nhiễm từ BN lao đa kháng thuốc.<br /> thí nghiệm để chẩn đoán lao.<br /> Các phương pháp thực hiện KS đồ kháng<br /> KHÁNG SINH ĐỒ KHÁNG LAO<br /> thuốc lao<br /> Định nghĩa PP dựa vào kiểu hình qui ước<br /> Kháng sinh đồ là PP đánh giá khả năng nhạy Các PP xác định VK lao kháng thuốc dựa vào<br /> cảm đối với từng loại thuốc kháng sinh (KS) của kiểu hình qui ước: PP tỉ lệ, PP tỉ số đề kháng, PP<br /> VK đã được xác định qua môi trường cấy. Về nồng độ tuyệt đối.<br /> phương diện sinh học, một dòng VK lao gọi là<br /> PP tỉ lệ<br /> kháng thuốc lao khi số lượng VK kháng thuốc<br /> lao đạt tỉ lệ  1%(1,4,9,11,13,15,22,25,34). Cho phép xác định chính xác tỉ lệ đột biến<br /> kháng thuốc của VK đối với từng loại thuốc KS.<br /> Chỉ định Nồng độ thuốc KS sử dụng trong PP tỉ lệ (µg/ml)<br />  Những BN thất bại hoặc tái điều trị với được trình bày ở bảng 5. Mẫu thử chứa VK phân<br /> AFB(+). lập pha loãng 100 lần để dễ dàng đếm số lượng<br />  Những BN đang điều trị mà AFB chuyển khúm VK mọc được cho vào môi trường có<br /> dương. thuốc KS và cả ống chứng (không có thuốc KS).<br />  Những BN mà AFB không chuyển sang Nuôi cấy trên môi trường Lowenstein-Jensen, ủ<br /> âm tính sau 2-3 tháng điều trị. ở nhiệt độ 370C và đọc kết quả sau 28 và 42 ngày.<br />  Những BN sau 4-6 tháng điều trị mà kết Nuôi cấy trên môi trường Middlebrook 7H10/11<br /> quả cấy vẫn (+). cho kết quả sau 21 ngày hoặc thậm chí sớm hơn.<br />  Số lượng VK lao tăng qua nhuộm soi acid Kết quả dựa vào tỉ lệ phần trăm khúm VK mọc<br /> nhanh trực tiếp sau khi bệnh khởi phát. trên môi trường có KS (R) so với môi trường<br />  Những BN nghi ngờ mắc lao kháng thuốc không chứa KS. PP này được thiết lập để phát<br /> mới. hiện sự kháng thuốc ở mức 1% trở lên.<br />  Những BN nhiễm HIV và hoặc đang sống<br /> <br /> Số khuẩn lạc mọc ở ống có KS<br /> R = 100% x<br /> Trung bình cộng số khuẩn lạc mọc ở ống chứng<br /> <br /> <br /> <br /> Xác định kháng thuốc khi tỉ lệ VK lao kháng Kanamycin 20,0 5,0 6,0<br /> Ethionamide 20,0 5,0 10,0<br /> thuốc có R > 1% đối với INH, RIF, PAS hoặc 10%<br /> Ofloxacin 2,0 2,0 2,0<br /> đối với các thuốc khác.<br /> Capreomycin 20,0 10,0 10,0<br /> Bảng 5: Nồng độ thuốc KS sử dụng trong PP tỉ lệ Cycloserine 40,0 - -<br /> (µg/ml) PP tỉ số đề kháng<br /> Thuốc kháng lao Lowenstein- 7H10 7H11 agar<br /> Jensen agar Là tỉ số giữa MIC của chủng VK phân lập<br /> INH 0,2 0,2 – 1,0 0,2 – 1,0 (mẫu thử) và chủng tham khảo nhạy cảm H37Rv<br /> RIF 40,0 1,0 1,0 (dòng chuẩn của phòng xét nghiệm) tại cùng<br /> EMB 2,0 5,0 7,5 một thời điểm. Sử dụng bộ ống tương đương có<br /> SM 4,0 2,0 2,0 – 10,0 chứa thuốc KS pha loãng gấp 2 lần ủ với chủng<br /> PZA 100 - -<br /> VK phân lập và chủng tham khảo của phòng xét<br /> PAS 0,5 2,0 8,0<br /> <br /> <br /> <br /> 32 Chuyên Đề Nội Khoa I<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan<br /> <br /> nghiệm H37Rv ở 370C. Đọc kết quả sau 4 tuần. kiểm soát bởi thiết bị MIGT 960. Đọc kết quả sẽ<br /> Ống có  20 khúm VK được coi là dương tính và được thực hiện bởi máy với một chương trình đã<br /> MIC được định nghĩa là nồng độ thuốc tối thiểu được cài đặt để giải thích sự nhạy cảm hay<br /> có < 20 khúm VK mọc. Mẫu thử có tỉ số đề kháng kháng thuốc của VK lao. Thuận lợi lớn nhất của<br />  2 được coi là nhạy cảm, và kháng thuốc khi tỉ kỹ thuật này là cho kết quả sớm trong vòng 4-6<br /> số đề kháng  8. ngày so với 21 ngày của PP qui ước. Ngoài ra, hệ<br /> PP nồng độ tuyệt đối thống BACTEC cũng có thể được sử dụng cho<br /> việc làm KS đồ. Nên tiến hành làm KS đồ sau khi<br /> Tính đề kháng của một chủng VK được biểu<br /> phân lập được M.tuberculosis. Cấy MGIT có thể<br /> hiện dựa vào MIC toàn bộ hoặc gần như toàn bộ<br /> trả lời KS đồ trong vòng 2 – 4 tuần kể từ lúc tiếp<br /> của thuốc đối với sự phát triển của VK. Nồng độ<br /> nhận mẫu thử so với 6 – 8 tuần nếu dùng môi<br /> thuốc KS tương tự như trong PP tỉ lệ nhưng<br /> trường Lowenstein-Jensen cổ điển.<br /> nồng độ thuốc KS cần thiết sẽ được xác định tùy<br /> theo phòng xét nghiệm. Đọc kết quả sau 4 tuần PP dựa vào kiểu gen<br /> và sau 5 - 6 tuần. Xác định kết quả dựa vào sự Các PP dựa vào kiểu gen để phát hiện VK<br /> phát triển của VK trên môi trường có thuốc KS lao kháng thuốc hay nhạy cảm là do dựa trên<br /> được pha loãng hai lần và môi trường không có sự khuếch đại gen của vùng chốt những gen<br /> thuốc KS (nhóm chứng). Chủng VK được coi là phối hợp với hiện tượng kháng thuốc đã biết<br /> nhạy cảm khi số khúm trên môi trường có thuốc (PCR). Sau đó, tiến hành đánh giá những sản<br /> KS < 20 và môi trường không có thuốc KS là phẩm khuếch đại để xác định tính kháng<br /> (+++) hoặc (++++). Kết quả của PP nồng độ tuyệt thuốc của VK lao.<br /> đối được xác định như sau: Giải mã trình tự gen<br /> Bảng 6: Kết quả của PP nồng độ tuyệt đối Giải mã trình tự gen của sản phẩm khuếch<br /> Môi trường nuôi cấy Kết quả đại PCR là PP chính xác và đáng tin cậy, được sử<br /> Mọc 20 - 50 khuẩn lạc (+)<br /> dụng rộng rãi nhất trong các PP dựa vào kiểu<br /> Mọc > 50 khuẩn lạc (++)<br /> gen, để xác định tính kháng thuốc của VK lao.<br /> Khuẩn lạc nhiều nhưng không mọc thành đám (+++)<br /> Mọc thành đám (++++) Đây là chuẩn tham khảo phát hiện đột biến gen.<br /> Ngày nay, PP này được thực hiện bằng hệ thống<br /> PP đo bức xạ kế BACTEC tự động và thường được dùng mô tả đột biến<br /> Hệ thống BACTEC TB-460 dùng môi trường gen rpoB trong đề kháng RIF và những đột biến<br /> lỏng Middlebrook 7H9 có chứa axít palmatic 14C gen kháng thuốc của các thuốc lao khác. Xác<br /> là nguồn carbon duy nhất. Khi VK lao phát triển định tính kháng thuốc của VK lao cũng được mô<br /> sẽ sử dụng axít béo đánh dấu 14C để tạo ra 14CO2 tả bằng kỹ thuật giải mã đoạn gen ngắn để tìm<br /> và được phát hiện bằng hệ thống BACTEC biểu những điểm đột biến và những điểm đa hình.<br /> hiện như là chỉ số mọc. Tính nhạy cảm của VK Kỹ thuật này dựa trên việc định lượng<br /> với thuốc KS có thể được đánh giá qua sự hạn pyrophosphate được phóng thích theo sau sự<br /> chế gia tăng chỉ số mọc hàng ngày. Mẫu thử gắn kết nucleotid vào chuỗi ADN.<br /> chứa VK phân lập được pha loãng 100 lần, ủ ở<br /> Kỹ thuật lai phân tử phase đặc (Solid-phase<br /> 370C trong ống có chứa KS và ống chứng. Kết<br /> hybridization technique)<br /> quả được giải thích tương tự như trong PP tỉ lệ<br /> với tỉ lệ mọc là 1%. Thuận lợi lớn nhất của kỹ Phát hiện nhanh sự kháng thuốc của VK lao,<br /> thuật này là cho kết quả sớm hơn PP qui ước gồm 2 kỹ thuật: (1) Line Probe Assay để phát<br /> trong môi trường thạch. BACTEC MGIT 960 dựa hiện kháng RIF (INNO-LiPA Rif TB Assay); (2)<br /> trên nguyên tắc của sự tiêu thụ oxy và dấu hiệu GenoType MTBDR Assay phát hiện đồng thời<br /> phát huỳnh quang. Mẫu thử và chứng được ủ và kháng INH và RIF.<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa I 33<br /> Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Kỹ thuật PCR thời gian thực (Real-time PCR) VK lao kháng RIF. Chất Resazurin là thành phần<br /> Sản phẩm PCR được theo dõi ngay sau mỗi chính của alamar blue cũng được sử dụng để<br /> chu kỳ khuếch đại bằng cách gắn sản phẩm phát hiện sự đề kháng thuốc lao. Kỹ thuật<br /> khuếch đại với chất phát huỳnh quang: gồm (1) REMA (Resazurin Microtiter Assay) cho phép<br /> Chất màu gắn không đặc hiệu vào chuỗi đôi phát hiện nhanh VK lao đa kháng thuốc với độ<br /> ADN; (2) Đầu dò đặc hiệu phát huỳnh quang. chính xác là 97% so với PP tỉ lệ trong môi trường<br /> Ưu điểm: cho kết quả nhanh khoảng 1,5 - 2 giờ đặc. REMA cũng giúp phát hiện sự đề kháng<br /> sau khi ly trích đoạn ADN từ mẫu thử và giúp thuốc của các thuốc kháng lao khác như: các<br /> xác định nhanh sự đề kháng thuốc của VK lao. thuốc kháng lao hàng thứ hai, Fluoroquinolones<br /> Đồng thời, kỹ thuật này có nguy cơ ngoại nhiễm và PZA.<br /> thấp. Hạn chế: trang thiết bị, thuốc thử đắt tiền, PP khử Nitrate (Nitrate Reductase Assay-NRA)<br /> và đòi hỏi kỹ thuật viên phải có chuyên môn. Là kỹ thuật khá đơn giản dựa vào khả năng<br /> PP dựa vào kiểu hình mới khử Nitrate thành Nitrite của VK lao và được<br /> PP dựa vào giai đoạn (Phage-based) xác định bằng cách cho thêm chất phản ứng hóa<br /> học vào môi trường cấy. VK lao được cấy trong<br /> Gen luciferase của đom đóm được đưa vào<br /> môi trường Lowenstein-Jensen có KS và phản<br /> VK lao qua thể thực khuẩn. Khi VK lao phát<br /> ứng khử Nitrate được xác định sau 10 ngày ủ.<br /> triển trong môi trường nuôi cấy, lượng luciferase<br /> Đối với chủng VK lao kháng thuốc, VK lao sẽ<br /> cũng nhân lên tương ứng. Luciferase trong môi<br /> phát triển và phản ứng khử Nitrate xảy ra làm<br /> trường có ATP, Mg++ và oxy sẽ hoạt hóa<br /> cho ống môi trường có màu đỏ hồng, trong khi<br /> luciferine thành lucifenyl-adenosine<br /> đối với chủng VK lao còn nhạy cảm thì không có<br /> monophosphate, cuối cùng thành oxyluciferine.<br /> vì VK lao bị ức chế bởi KS.<br /> Đồng thời, ánh sáng sẽ phát ra và được phát<br /> hiện bằng hệ thống phát hiện ánh sáng cảm ứng. PP MODS<br /> Qua đó, có thể phát hiện sự có mặt của VK lao Là kỹ thuật phát hiện sớm sự phát triển và<br /> trong môi trường cấy, sự phát triển của VK lao nhanh KSĐ của VK lao dựa vào việc quan sát sự<br /> cũng như đánh giá hiệu quả của thuốc kháng hình thành yếu tố thừng đặc trưng của VK lao<br /> lao. Sự phát sáng sẽ bị ức chế nếu chủng VK còn trong môi trường lỏng với KHV đảo ngược.<br /> nhạy cảm với KS. Trong khi ở chủng VK lao PP cấy trong môi trường thạch 7H11 lớp mỏng (Thin<br /> kháng thuốc, sự phát sáng vẫn tiếp tục. Layer 7H11 agar method, TL7H11)<br /> PP đo chất chỉ thị màu Bệnh phẩm được nuôi cấy trên môi trường<br /> Được sử dụng để phát hiện nhanh sự kháng thạch Middlebrook 7H11 lớp mỏng và xác định<br /> thuốc của VK lao. PP này dựa vào sự thay đổi khuẩn lạc mọc bằng KHV. PP TL7H11 cũng xác<br /> của chất chỉ thị màu như alamar blue (là chất định nhanh VK lao đa kháng thuốc trực tiếp từ<br /> đầu tiên được sử dụng) hoặc muối tetrazolium các mẫu đàm với thời gian nhận biết trong<br /> được cho thêm vào trong môi trường cấy để khoảng một tuần.<br /> phát hiện VK lao mọc. Khi VK lao phát triển,<br /> QUI TRÌNH CẤY ĐÀM VÀ LÀM KS ĐỒ<br /> phản ứng oxy hóa khử xảy ra, chất alamar blue<br /> TẠI BỆNH VIỆN PHẠM NGỌC THẠCH(24)<br /> từ màu xanh chuyển sang màu hồng hoặc muối<br /> tetrazolium từ màu vàng thành tinh thể màu tía Mẫu đàm được khử tạp khuẩn bằng dd N-<br /> không hòa tan. Chất alamar blue được sử dụng Acetyl-L-Cystein (NALC) - NaOH<br /> để đánh giá hoạt tính của INH, RIF, EMB, SM, Dd được dùng khử tạp khuẩn<br /> đặc biệt là dùng để phát hiện VK lao kháng INH<br /> Gồm dd 1 là dd NaOH 4% (chứa 20 gr<br /> và RIF. Muối tetrazolium giúp phát hiện nhanh<br /> <br /> <br /> 34 Chuyên Đề Nội Khoa I<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan<br /> <br /> NaOH và 500 ml nước cất. Dd 2 là dd Sodium Nhuộm soi AFB trong đàm bằng kỹ thuật<br /> citrat dihydrate 2,9% (chứa 14,5 gr Sodium citrat Ziehl Neelsen<br /> dihydrate và 500 ml nước cất). Dd 3 là dd Đánh giá kết quả theo hướng dẫn của<br /> NaOH-Nacitrat (chứa 500 ml dd 1 và 500 ml dd chương trình chống lao quốc gia.<br /> 2). Dd khử tạp khuẩn gồm dd 3 và NALC (pha<br /> dùng trong ngày). Mỗi mẫu đàm cần 5ml dd khử Nuôi cấy trên môi trường MGIT và theo dõi<br /> tạp khuẩn. tự động sự phát triển của VK lao trong môi<br /> trường bằng hệ thống BACTEC MGIT 960<br /> Cách tính lượng NALC cần dùng<br /> Lượng NALC (mg) = số ml NaOH-Nacitrat Nguyên tắc<br /> x 5. Chẳng hạn, trong 10 ml NaOH-Nacitrat, Khi có VK lao mọc, sử dụng oxy, làm oxy<br /> lượng NALC cần dùng là 50 mg; tương tự, trong trong ống nghiệm giảm và sẽ phát huỳnh quang<br /> 20 ml NaOH-Nacitrat, lượng NALC cần dùng là thông báo kết quả dương tính. Ngưỡng để máy<br /> 100 mg; trong 30 ml NaOH-Nacitrat, lượng thông báo kết quả dương tính là 104 – 107.<br /> NALC cần dùng là 150 mg;... Thời gian đọc kết quả<br /> Cách tiến hành khử tạp khuẩn Từ 7 – 42 ngày (nếu có kết quả dưới 1 tuần<br /> Cho 3 – 5 ml đàm vào ống ly tâm nhựa 50 ml thường là do ngoại nhiễm hoặc do nhiễm<br /> nắp xoáy. Thêm dd khử tạp tương đương với thể Mycobacterium khác M. tuberculosis (MOTT).<br /> tích đàm, đóng chặt nắp ống ly tâm. Lắc trên Ngoại nhiễm<br /> máy Votex cho đến khi đàm nhuyễn hóa hoàn Nhiễm VK<br /> toàn (5 – 20 giây), lộn ngược các ống để toàn bộ<br /> Thường xảy ra trong 24 - 48 giờ trên cả hai<br /> bề mặt trong ống được tiếp xúc với dd khử tạp<br /> ống nuôi cấy do khử tạp khuẩn chưa đạt. Khi<br /> khuẩn. Để đứng các ống trong 15 phút ở nhiệt<br /> nhiễm trùng rầm rộ, bề mặt môi trường nhày,<br /> độ phòng thí nghiệm (thỉnh thoảng lắc nhẹ). Bổ<br /> ướt, thậm chí vữa toàn bộ môi trường. Khi<br /> sung dd đệm vô trùng tới vạch 30 – 40 ml. Đóng<br /> nhiễm VK, môi trường chuyển màu, sự<br /> chặt nắp ống ly tâm, lắc đều. Quay ly tâm 3.000<br /> chuyển hóa của VK sinh ra acid làm pH môi<br /> vòng/15 phút (100 C nếu là máy ly tâm lạnh). Bỏ<br /> trường giảm, chất chỉ thị Malachite đổi màu<br /> hết phần nước nổi, giữ lại cặn. Thêm 0,5 – 1 ml<br /> xanh tối, đậm độ màu xanh phụ thuộc vào<br /> dd đệm vô trùng vào cặn, lắc đều, tạo thành<br /> lượng VK nhiễm trên môi trường cấy. Khi<br /> huyền dịch để nuôi cấy.<br /> nhiễm toàn bộ ống nuôi cấy, M.tuberculosis<br /> Các dung dich đệm không thể mọc trong điều kiện pH thấp, phải<br /> Có thể dùng 1 trong 2 dd sau: (1) Dd đệm hủy bỏ ống nuôi cấy.<br /> phosphate bufer 0,067M pH 6,8: gồm dd A:<br /> (2) Nhiễm nấm<br /> 9,47gr Na2HPO4 và 1.000 ml nước cất; dd B:<br /> Thường xảy ra muộn trong quá trình ủ ấm,<br /> 9,07gr K2HPO4 và 1.000 ml nước cất. Trộn dd A<br /> thường do từ ngoài vào. Nếu phát hiện sớm khi<br /> và B theo tỉ lệ 1:1 và chỉnh pH=5,6 bằng cách<br /> nấm mọc rải rác có thể phân lập được chủng VK<br /> thêm A nếu cần tăng pH và thêm B nếu cần<br /> lao mọc lẫn trên môi trường, phát hiện muộn<br /> giảm pH. Hấp ở 1210C /15 phút, bảo quản ở nhiệt<br /> thường mất chủng VK vì nấm mọc kín toàn bộ<br /> độ phòng thí nghiệm trong 1 tuần. (2) Dd đệm<br /> môi trường. Nhiễm nấm sớm thường do bệnh<br /> NaCl 0,85% gồm 8,5 g NaCl tinh thể và 1.000 ml<br /> phẩm bị nhiễm nấm hoặc do dụng cụ hay thao<br /> nước cất. Hòa tan, hấp ở 1210C/15 phút. Bảo<br /> tác, nấm mọc phong phú sau vài ngày đến 1<br /> quản ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 1 tuần.<br /> tuần, phải hủy ống nuôi cấy.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Nội Khoa I 35<br /> Tổng Quan Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013<br /> <br /> Kết quả dương tính khi có khuẩn lạc mọc Ethionamide: 40 µg/ml; Cycloserine: 30 µg/ml;<br /> kiểu thô ráp (Rough, R) Kanamycin: 20 µg/ml; PAS: 0,5 µg/ml; và PZA:<br /> Lúc đầu tròn nhẵn, sau đó, sần sùi như hoa 200 µg/ml (theo phương pháp Wayne).<br /> súp lơ, màu kem. Đọc kết quả cấy đàm tìm VK * Kết quả KSĐ<br /> lao:  Nhạy cảm: khi có khuẩn lạc mọc ở ống<br /> Bảng 7: Đọc kết quả cấy đàm tìm VK lao chứng nhưng không có khuẩn lạc mọc ở các<br /> Cấy đàm Kết quả ống có KS.<br /> Không thấy khuẩn lạc (-)  Kháng thuốc: có khuẩn lạc mọc ở cả ống<br /> 1 - 19 khuẩn lạc ghi số khuẩn lạc chứng và các ống có KS. Đồng thời, có chỉ số<br /> 20 - 100 khuẩn lạc (+) R >10% đối với PZA và > 1% đối với các<br /> 100 - 200 khuẩn lạc (++) thuốc còn lại.<br /> 200 - 500 khuẩn lạc (+++)<br /> > 500 khuẩn lạc (++++) KẾT LUẬN<br /> Định danh Mycobacterium sau nuôi cấy (cổ Nhuộm soi AFB trực tiếp, cấy tìm VK lao<br /> và thực hiện KS đồ kháng thuốc lao là những xét<br /> điển)<br /> nghiệm quan trọng trong chẩn đoán bệnh lao,<br /> Dựa vào xác định tốc độ mọc, nhiệt độ mọc,<br /> đặc biệt trong tình hình lao đa kháng thuốc ngày<br /> hình thái khuẩn lạc (nhìn bằng mắt thường và<br /> càng gia tăng. Ngày nay, với sự tiến bộ của lĩnh<br /> bằng KHV), sự sinh sắc tố, các tính chất sinh vật<br /> vực sinh học phân tử, đã giúp phát triển nhiều<br /> hóa học, các đặc điểm hóa sinh (các test sinh<br /> phương pháp, kỹ thuật giúp xác định VK lao gây<br /> hóa). Có thể nghĩ đến M. tuberculosis nếu VK<br /> bệnh trong các mẫu thử cũng như có được kết<br /> mọc chậm, không có sắc tố, không sinh sắc tố<br /> quả KS đồ nhanh, chính xác, dễ thực hiện trong<br /> ngoài ánh sáng, khuẩn lạc mọc xù xì, có khuynh<br /> một thời gian ngắn nhất. Đây cũng chính là yêu<br /> hướng tạo thừng, sản sinh ra niacin: test niacin<br /> cầu cấp thiết của chương trình chống lao trong<br /> (+), test khử nitrat dương tính, test NAP (P<br /> tầm soát, phát hiện, quản lý và kiểm soát tốt<br /> Nitro-alpha-acetylamino-beta) nhạy và test TCH<br /> bệnh lao trong cộng đồng.<br /> (Thiophene-2-carboxylic acid hydrazide) kháng.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Thực hiện KS đồ kháng lao 1. Anandi M et al (2007), “Drug resistance and Drug resistance<br /> detection”, Textbook of Tuberculosis, pp. 635-660.<br /> Cấy bệnh phẩm vào ống môi trường 2. Bộ Y tế và Chương trình chống lao quốc gia (2001), Phát hiện<br /> (Lowenstein-Jensen) có chứa KS và ống chứng (2 và điều trị bệnh lao (sách dịch), Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.<br /> 221-235.<br /> ống) sau khi đã định danh là M. tuberculosis và ủ 3. Bộ Y tế và Chương trình chống lao quốc gia (2009), Hướng dẫn<br /> ở nhiệt độ 35 – 370C. Thường xuyên theo dõi quản lý bệnh lao, Nhà xuất bản Y học, Hà nội.<br /> nhiệt độ ủ. Kiểm tra tình trạng nhiễm khuẩn sau 4. Butt T, Ahmad RN, Afzal RK, Mahmood A, Anwar M (2004),<br /> “Rapid detection of rifampicin susceptibility of Mycobacterium<br /> 24 – 48 giờ. Sau 72 giờ, kiểm tra bề mặt môi tuberculosis in sputum specimens by mycobacteriophage<br /> trường phải khô, xoáy nắp chặt vừa phải tránh assay”, J. Pak. Med. Asso. 2004, 54(7), pp. 379-382.<br /> 5. Cavusoglu C, Turhan A, Akinci P, Soyler I (2006), “Evaluation<br /> bay hơi làm khô môi trường. Đọc kết quả hàng<br /> of the Genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin<br /> tuần. Theo dõi xét nghiệm trong vòng 7 ngày để and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates”,<br /> phát hiện MOTT và trả lời kết quả sau 8 tuần. J. Clin. Microbiol 2006, 44(7), pp. 2338-2342.<br /> 6. Cirillo DM, Piana F, Frisicale L, Quaranta M, Riccabone A,<br /> Xét nghiệm KS đồ được tiến hành với các thuốc: Penati V, Vaccarino P, Marchiaro G (2004), “Direct rapid<br /> INH, RIF, EMB, PZA, SM, Ofloxacin, PAS, TB1, diagnosis of rifampicin-resistant M. tuberculosis infection in<br /> Ethionamide, Cycloserine, Kanamycin theo clinical samples by line probe assay (INNO LiPA Rif-TB)”,<br /> New Microbiol, 27(3), pp. 221-227.<br /> phương pháp tỉ lệ với các nồng độ sau: SM: 4 7. Crofton J (1999), “Các xét nghiệm nhuộm soi AFB, cấy tìm vi<br /> µg/ml; INH: 0,2 µg/ml; RIF: 40 µg/ml; EMB: 2 khuẩn lao”, Bệnh lao lâm sàng, Viện lao và bệnh phổi Trung<br /> µg/ml; TB1: 10 µg/ml; Ofloxacin: 2 µg/ml; ương, tr.235-250.<br /> 8. Didi B, Andersen AB, et al (2006), “Rapid Genotypic Detection<br /> <br /> <br /> <br /> 36 Chuyên Đề Nội Khoa I<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Tổng Quan<br /> <br /> of Rifampin- and Isoniazid-Resistant Mycobacterium 175-183.<br /> tuberculosis Directly in Clinical Specimens”, J. Clin. Microbiol, 22. Pai M, Kalantri S, Pascopella L, Riley LW, Reingold AL (2005),<br /> 44(7), pp. 2605-2608. “Bacteriophage-based assays for the rapid detection of<br /> 9. Espasa M, Gonzalez-Martin J, Alcaide F, et al (2005), “Direct rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a meta-<br /> detection in clinical samples of multiple gene mutations analysis”, J. Infect. 2005, 51(3), pp. 175-187.<br /> causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid 23. Philips JA, Rubin EJ (2008), “The microbiology, virulence, and<br /> and rifampicin using fluorogeneic probes”, J. Antimicrob. immunology of mycobacteria”, Fishman’s pulmonary diseases<br /> Chemother. (55), pp.860-5. and disorders, 4th ed., chapter 139,