Tổng quan về quy trình tạo phôi heo nhân bản vô tính từ trứng heo chín in vitro

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Việc thiết lập quy trình tạo phôi heo nhân bản vô tính bao gồm một tổ hợp các kỹ thuật hiện đại, chuyên sâu. Nghiên cứu quá trình tạo phôi heo nhân bản vô tính có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật y sinh, hỗ trợ sinh sản, và nghiên cứu về tái biệt hóa tế bào.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tổng quan về quy trình tạo phôi heo nhân bản vô tính từ trứng heo chín in vitro

TỔNG QUAN VỀ QUY TRÌNH TẠO PHÔI HEO NHÂN BẢN VÔ TÍNH TỪ TRỨNG HEO CHÍN IN VITRO Nguyễn Bá Tư 1 1. Viện Phát triển ứng dụng, trường Đại học Thủ Dầu Một TÓM TẮT Quy trình nhân bản vô tính heo cũng như các loài khác đều phải hướng đến việc tối ưu hóa quy trình nhằm thỏa mãn các yếu tố cần thiết phục vụ cho các sự kiện sẽ diễn ra xuyên suốt quá trình tái lập trình hệ gene tế bào sinh dưỡng của động vật cho nhân bên trong bào tương của trứng động vật chuyển nhân. Có thể chia quy trình nhân bản vô tính heo thành các đoạn: (1) Thiết lập dòng tế bào cho nhân và nuôi trứng chín trong phòng thí nghiệm (in vitro); (2) Thiết lập quy trình lấy nhân và chuyển nhân; (3) Thiết lập quy trình kích hoạt trứng chuyển nhân phát triển in vitro; (4) Thiết lập quy trình nuôi phôi chuyển nhân; và (5) Thiết lập quy trình chuyển phôi vào cơ thể heo mẹ mang thai hộ. Từ khóa: chuyển nhân, , lấy nhân, nhân bản vô tính, phôi heo, trứng heo chín in vitro 1. THIẾT LẬP DÒNG TẾ BÀO CHO NHÂN VÀ NUÔI TRỨNG CHÍN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM (IN VITRO) 1.1. Thiết lập dòng tế bào cho nhân Dòng tế bào cho nhân (donor cell line) được thiết lập bao gồm nhiều loại khác nhau tùy theo yêu cầu và mục đích của từng nghiên cứu. Đặc điểm quan trọng nhất của tế bào cho nhân mà các nhà khoa học quan tâm chính là trạng thái toàn năng (totipotency) của dòng tế bào đó, nói chung các dòng tế bào càng ở trạng thái toàn năng cao thì sự kỳ vọng khả năng tái lập trình càng cao, các dòng tế bào hiện nay đang được sử dụng là phôi thai, tế bào sợi trưởng thành từ các mẫu vật như tai (heo, bò, dê, cừu…), tế bào đuôi (chuột), thậm chí tế bào máu cũng có thể làm nguồn cho nhân (Prather et al. 1989). Các nghiên cứu gần đây cho thấy, chu kỳ tế bào cho nhân có ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng hòa hợp với các yếu tố tái biệt hóa bên trong bào tương của trứng chuyển nhâ, cụ thể, hiệu quả phát triển phôi tốt nhất khi chu kỳ tế bào cho nhân ở trạng thái G0 hoặc G1. Thông thường trong một quần thể tế bào, sẽ có rất nhiều trạng thái chu kỳ khác nhau, vì vậy, để thuận lợi cho việc lựa chọn tế bào khi chuyển nhân, các nhà khoa học thường thiết lập một quy trình đưa chu kỳ tế bào về trạng thái mong muốn gọi là “đồng bộ hóa chu kỳ tế bào- Synchronization) nhờ việc nuôi tế bào trong môi trường DMEM chỉ với 0.5% FBS (phương pháp Starvation), hoặc thậm chí có thể dùng phương pháp cắt bỏ nguồn oxygen (hypoxia) nhằm đưa trạng thái tế bào về trạng thái cùng cực cũng đã được chứng minh giúp tăng khả năng tái lập trình gene và phát triển phôi nhân bản vô tính. Tuy nhiên, các phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định do trong điều kiện in vitro thiếu dinh dưỡng và oxy có thể gây stress tạo điều kiện cho quá trình lão hóa và chết theo chương trình (appoptosis) được kích hoạt (Macháty and Prather 1998); (Hyun et al. 2016; Dang et al. 2020). 343
1.2. Thiết lập quy trình nuôi trứng heo chín in vitro (In-vitro maturation, IVM) Trứng chuột trong các nghiên cứu thường đường thu nhận trực tiếp in vivo nhờ quy trình kích hoạt bằng tiêm hormone sinh dục (thường được sử dụng hiện nay là PMSG (pregnant mare serum gonadotropin) và hCG (human chorionic gonadotropin). Tuy nhiên, đối với heo và các loài thú lớn khác, việc dùng hormone sẽ ảnh hưởng đến chất lượng thịt, vì vậy, trứng chủ yếu được thu nhận từ lò giết mổ gia súc sau đó sẽ được nuôi chín nhân tạo trong phòng thí nghiệm. Trứng heo thu từ lò mổ sẽ ở nhiều giai đoạn khác nhau, thường sẽ ở giai đoạn giảm phân I, sau đó nhờ hệ thống nuôi nhân tạo sẽ tiến triển đến khi chín tại kỳ giữa của giảm phân II. Chính vì vậy, việc thiết lập quy trình nuôi chín trứng heo in vitro thường gặp nhiều khó khăn xuất phát từ điều kiện kỹ thuật cũng như cơ sở vật chất, ngoài ra việc bổ sung các yếu tố sinh trưởng (growth factors) sẽ đóng vai trò quyết định thúc đẩy trứng heo chín in vitro. Chất lượng trứng heo chín in vitro sẽ quyết định trực tiếp đến khả năng tái lập trình bộ gene của tế bào cho nhân bên trong bào tương trứng, vì vậy, việc thiết lập quy trình nuôi trứng heo chín có ý nghĩa đặc biệt quan trọng (Kikuchi et al. 2000; Hirao et al. 1994) 1.2.1. Thu nhận và nuôi trứng chin (Silvestri et al. 2021) Buồng trứng heo được thu từ lò mổ tại địa phương, được bảo quản trong bình giữ nhiệt chứa dung dịch PBS-PVA trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm. Thu nhận trứng heo bằng kỹ thuật chọc hút (aspiration method) Phức hợp tế bào hạt và trứng được thu nhận bằng phương pháp chọc hút sử dụng syringe với đầu kim G18. Hình 1. Thu nhận trứng heo bằng kỹ thuật chọc hút Chú ý: - Chỉ hút các nang trứng có kích thước 4-6 mm. - Trứng được lựa chọn có đủ lớp tế bào hạt (cumulus cells) và kích thước như nhau - Trứng sau khi hút phải rửa sạch trong các vi giọt chứa Hepes ít nhất 3 lần bằng mouthpepete - Thao tác chuyển rửa trứng trong các vi giọt cần nhẹ nhàng nhằm đảm bảo giữa nguyên các lớp tế bào hạt (ít nhất còn 4-5 lớp). Ưu điểm: Ưu điểm của phương pháp thu nhận trứng bằng kỹ thuật chọc hút là nhanh, dễ làm, có thể thu được lượng trứng nhiều trong thời gian ngắn Nhược điểm: Thu nhận trứng bằng kỹ thuật chọc hút có những nhược điểm: (1) Khó phân biệt được chất lượng trứng do trong nang trứng có những trứng đã bị thoái hóa và nổi lên (floating) nhưng sau khi hút thì khó phân biệt và loại trừ; (2) Áp lực syringe sẽ có thể gây tổn hại đến mối liên kết lớp tế bào hạt và trứng (Gap-junction) đây là vị trí đặc biệt nơi diễn ra sự trao đổi các tín hiệu tế bào giữa trứng và các tế bào hạt, khi hệ thống tín hiệu bị tổn thương sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình chín sinh lý của trứng; và (3) Kỹ thuật chọc hút trứng sẽ chỉ thu được trứng và một số lớp tế bào hạt (cumulus cell layers), trong khi đó còn các lớp tế bào granulosa rất quan trọng lại không thể được thu nhận bằng kỹ thuật này. Lớp tế bào granulosa được xem như lớp tế bào gốc có nhiều nhiệm vụ quan trọng cung cấp các yếu tố sinh trưởng (growth factors) cho trứng như Lif (Leukemia inhibitory factor); FSH (Follicle stimulating hormone). 344
Thu nhận trứng heo bằng kỹ thuật cắt trứng (Dissection methods) Hình 2. Quy tình thu nhận và nuôi chín trứng heo bằng kỹ thuật cắt trứng Với nhiều ưu điểm vượt trội, phương pháp thu nhận trứng bằng kỹ thuật cắt trứng hiện nay được áp dụng rộng rãi nhất. Chú ý: - Chỉ lựa chọn cắt các nang trứng có độ đồng đều như nhau về kích thước (4-6 mm) và màu sắc - Tránh làm vỡ các nang trứng trong quá trình cắt và bóc vỏ nang trứng - Xác định 1 điểm đen bên trong nang trứng sau đó lật ngược lại và xé nang trứng; dùng forcep lấy cả trứng và các lớp tế bào Granulosa để đảm bảo sẽ thu được các trứng có đầy đủ phức hợp (oocyte–cumulus–granulosa cell complexes( OCGCs). Nhược điểm: Phương pháp thu nhận trứng bằng kỹ thuật cắt trứng đòi hỏi công phu, tốn thời gian Ưu điểm: Phương pháp này cho phép lựa chọn các trứng có chất lượng đồng đều, tốt nhất. Đặc biệt, kỹ thuật này cho phép thu nhận trứng với phước hợp (OCGCs) sẽ được kỳ vọng cung cấp dầy đủ các yếu tố cần thiết giúp trứng phát triển tốt nhất (Dang, Duy et al. 2018) 1.2.2 Nuôi trứng chín in vitro (Linh and Hiep 2020; Zhao et al. 2022) Môi trường: TCM199 (Sigma Chemical Co., USA) bổ sung 10% dịch chiết nang trứng, 0.1 IU/ml hCG (Human chorionic gonadotropin), 5ug/ml Sodium pyruvate, 10% FBS (Fetal bovine serum) Cách thu nhận dịch chiết nang trứng: Sử dụng syringe G18 thu nhận dịch chiết nang trứng tương tự như kỹ thuật chọc hút trứng; lựa chọn các nang trứng to đồng đều, trong suốt, dịch nang trứng sau khi thu nhận được ly tâm 4000 vòng/phút 2-3 lần mỗi lần 10 phút; sau đó đem lọc 0.22um, chia nhỏ cho mỗi lần sử dụng và bảo quản -20 độ. Cách làm vi giọt môi trường Kỹ thuật làm vi giọt trong nuôi trứng in vitro rất quan trọng Vi giọt hiện đang được áp dụng phổ biến trên thế giới là vi giọt nổi (floating drop) với lượng môi trường khoảng 120-150µl/giọt cho 10-15 trứng, tại phòng thí nghiệm của chúng tôi tiến hành nâng cấp lên 500µl/giọt cho 20 trứng giúp hỗ trợ không gian và lượng môi trường dinh dưỡng cho trứng phát triển. 345
Trước hết dùng pipete tạo 1 giọt 200 µl dưới đáy đĩa, sau đó phủ tràn dầu (mineral oil); tiếp tục bổ sung thêm 300 µl sẽ có được 1 vi giọt nổi 500 µl (hình 2,H). Lưu ý: Vi giọt môi trường cần được ủ trong tủ CO2 ít nhất 1 giờ trước khi nuôi trứng. Thời gian nuôi trứng Hiện nay trên thế giới thường có 2 quy trình nuôi chín trứng heo in vitro - Nuôi liên tục: Toàn bộ trứng heo được nuôi liên tục trong tủ nuôi 40-42 giờ - Nuôi thay đổi: Trứng heo được nuôi trong môi trường có đầy đủ các yếu tố trong suốt 20 giờ đầu, sau đó sẽ chuyển trứng sang môi trường mới không sử dụng hormone trong 20-22 giờ sau Tiêu chuẩn đánh giá trứng chín Có hai tiêu chuẩn đánh giá hình thái sự trưởng thành của tế bào trứng (Van Thuan, Harayama et al. 2002): - Dựa vào sự giãn nở của các lớp tế bào hạt (lớp tế bào cumulus) + Tế bào trứng chín không tốt hoặc chưa chín: Lớp tế bào hạt giãn nở nhỏ, không đều, ít, độ kết dính với trứng lỏng lẻo (hình 3 a) + Tế bào trứng chín tốt: Lớp tế bào hạt giãn nở rộng, đều, độ kết dính với trứng chặt chẽ (hình 3 b) - Dựa vào sự xuất hiện thể cực thứ nhất: Tế bào trứng chín thể hiện thể cực thứ nhất (1 PB) xuất hiện rõ, tròn đều (hình 3 c) st Hình 3. Tiêu chuẩn đánh giá sự trưởng thành của trứng trong điều kiện nuôi cấy in vitro Trứng heo sau khi chín (40-42 giờ nuôi) sẽ được loại bỏ lớp tế bào hạt (cumulus cell layers) bằng enzyme hyaluronidase, sau khi lớp tế bào hạt được loại bỏ hoàn toàn bằng mouthpepete trong môi trường Hepes, trứng sẽ được ủ ngược trở lại trong môi trường nuôi đến khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo (Dang, Duy et al. 2018). 2. THIẾT LẬP QUY TRÌNH KÍCH HOẠT NHÂN TẠO TRỨNG HEO IN VITRO (KWON ET AL. 2014) Thiết lập quy trình kích hoạt nhân tạo thành công đối với trứng chuyển nhân có ý nghĩa đặc biệt quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả phát triển phôi giai đoạn tiền làm tổ. Hiện nay có 2 phương pháp chính kích hoạt trứng nhân tạo là sử dụng hóa chất hoặc dòng điện với cường độ thích hợp. Mục tiêu của quy trình kích hoạt nhân tạo là giúp các sự kiện diễn ra bên trong tế bào trứng giống như cách mà tinh trùng đã thực hiện trong quá trình thụ tinh. Đối với trứng heo, quy trình phổ biến đang được áp dụng hiện nay là sử dụng dòng điện qua một chương trình đã được thiết lập phù hợp với từng loại máy. Trong quy trình này, chúng tôi đang sử dụng hệ máy Electro Cell fusion generator - LF201. Chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình kích hoạt trứng heo nhân tạo trong môi trường Mannitol (0.3M), bổ sung, 0.1 mM MgSO4, 0.05 mM CaCl2. 346
2.1 Quy trình kích hoạt trứng heo (Electrical porcine oocyte activation) - Trứng được rửa trong Mannitol 1 phút trước kích hoạt - Chuyển trứng vào đĩa kích hoạt và tiến hành kích hoạt theo chương trình đã thiết lập sẵn trên máy kích hoạt - Sau khi kích hoạt, chuyển toàn bộ trứng vào Mannitol 3 phút - Rửa trứng trong Hepes - Chuyển trứng vào môi trường nuôi phôi có bổ sung CB (5µg/ml) trong 6 giờ Chú ý: Mỗi lần kích hoạt trứng thường chỉ khoảng 15-20 trứng/ đĩa kích hoạt (chamber) Cần đảm bảo thời gian rửa trứng trong Mannitol trước và sau khi kích hoạt đúng thời gian Kiểm tra kỹ các thông số kỹ thuật của máy trước và sau khi kích hoạt Có thể quan sát dưới kính hiển vi thời điểm kích hoạt, nếu thấy trứng bị rung và bám vào thành của hai điện cực của chamber thì có nghĩa trứng đã được kích hoạt. Hình 4. Quy trình kích hoạt nhân tạo trứng heo 2.2. Kiểm tra kết quả kích hoạt nhân tạo trứng heo Việc kiểm tra kết quả kích hoạt nhân tạo trứng heo có ý nghĩa quan trọng quyết định đến sự thành công của toàn bộ quy trình kích hoạt trứng. Quy trình kiểm tra bằng kích hoạt trứng trinh sản (Parthenogenesis) là phù hợp nhất. Trứng sau kích hoạt được chuyển vào môi trường IVD + CB (5µg/ml) sau 6 giờ, Trứng được cố định và nhuộn trong Orcine, nếu thấy xuất hiện hai nhân cái (pronuclear) có kích thước như nhau thì chứng tỏ trứng đã được kích hoạt thành công (hình 5). Hình 5. Trứng heo sau khi kích hoạt 6 giờ, thấy sự xuất hiện của 2 nhân cái (Female pronuclear) có kích thước như nhau (mũi tên) 347
3. THIẾT LẬP QUY TRÌNH LẤY NHÂN VÀ CHUYỂN NHÂN TẠO PHÔI HEO NHÂN BẢN VÔ TÍNH 3.1 Chuẩn bị tế bào cho nhân (Jiao et al., 2021) Tế bào sinh dưỡng đã được nuôi và cấy chuyển xử lý trong môi trường nghèo dinh dưỡng ít nhất 5 ngày (starvation) nhằm đồng bộ hóa chu kỳ tế bào ở giai đoạn G0 hoặc G1 sẽ thuận lợi cho sự tương hợp bộ gene tế bào cho nhân và bào tương của trứng chuyển nhân. Tế bào đang nuôi cấy được xử lý trong Trypsine 0,25% trong 5 phút nhằm giúp các tế bào tách rời nhau. Thu quần thể tế bào bằng pipete và rửa trong Hepes ly tâm chậm (spindown) nhẹ nhằm tránh tổn thương tế bào. Sau khi rửa 3 lần, Tế bào được chuyển vào vi giọt PVP 8% đã chuẩn bị sẵn cho vi thao tác. Hình 6. Tế bào cho nhân trong PVP 8% 3.2 Chuẩn bị vi kim cho quá trình lấy/ chuyển nhân (Vajta et al., 2007) Việc chuẩn bị một bộ kim tốt đóng vai trò quan trọng cho tỉ lệ thành công trong quá trình chuyển nhân. Một bộ kim cho quá trình chuyển nhân bao gồm: một kim giữ trứng (holding pipette) giúp cố định trứng cho quá trình lấy nhân và chuyển nhân, một kim lấy nhân (enucleation pipette) và kim chuyển nhân (injection pipette). Mỗi loại kim có kích thước và hình dạng khác nhau cho các mục đích khác nhau. Kéo kim vi kim (Micropipette pulling) Kim được sử dụng là kim mao dẫn Borosilicate: Đường kính ngoài 1.0 mm, đường kính trong 0.75 mm. Sử dụng chương trình như sau cho máy kéo kim: Heat = 570 Pull = 10 Vel = 90 Time = 150 Pressure = 25. E Hình 7. Các thiết bị, vật liệu sử dụng trong quá trình chuyển nhân trứng heo. (A) Máy kéo kim (Micropipette puller), (B) Máy cắt kim (Microforge), (C) Hệ thống vi kim, (D) Đĩa trữ kim vi tiêm. (E) Bộ điều kiển chuyển kênh piezo A/B. Tạo hình kim lấy nhân và chuyển nhân (enucleation and injection) 1. Kim sau khi được kéo bằng máy kéo vi kim sẽ được lắp vào máy cắt kim (microforge). 2. Đầu kim sẽ được để ngang tiệm cận với đầu thủy tinh (được nối với dây chịu nhiệt platinum) (Hình 7A). 348
Chú ý: Vị trí kim có đường kính trong vào khoảng 12-15 μm (cho kim lấy nhân) hoặc 8- 10 μm (cho kim chích/ chuyển nhân). 3. Dây dẫn nhiệt được đốt nóng để làm nóng chảy đầu kim. Đầu kim sẽ tự vỡ, với đường cắt thẳng, sau khi ngưng dẫn nhiệt (Hình 7 B). Chú ý: đầu kim nên kết thúc bằng đường cắt thẳng, không bị răng cưa. Đầu kim bị răng cưa sẽ dễ làm chết trứng. 4. Kim sẽ được bẻ với góc khoảng 19-20 độ (Hình 7 C). 5. Thủy ngân sẽ được bơm vào thân kim lấy nhân/kim chuyển nhân và bảo quản trong đĩa petri 90 mm ở nhiệt độ khoảng 25oC (Hình 7 D). Chú ý: Thủy ngân dùng để hỗ trợ cho hệ thống piezo và là một chất độc hại. Nên đeo bao tay và sử dụng trong buồng hút hóa chất (fume hood). Hình 7. Các bước chuẩn bị kim trong quá trình chuyển nhân trứng heo Tạo hình kim giữ trứng (Holding pipette) 1. Như đã đề cập ở trên, kim mao dẫn sau khi được kéo sẽ được đặt ngang tiệm cận với đầu thủy tinh và cắt ở vị trí có đường kính trong khoảng 60-90 μm (Hình 7D-E). 2. Đầu kim sau khi cắt sẽ được xoay 1 góc 90 độ (vuông góc với sợi nung nhiệt) (Hình 7F). 3. Tăng nhiệt độ đến gần cực đại cho đến khi đầu kim thu nhỏ lại với đường kính khoảng 10 μm (Hình 7G). 4. Kim sẽ được bẻ với góc khoảng 19-20 độ (Hình 7H-I). Chuẩn bị đĩa làm vi kim và đĩa nuôi cấy Đĩa chuẩn bị cho quá trình chuyển nhân được sử dụng bằng nắp của đĩa petri nhựa 90mm (Biologix) vì nắp đĩa có phần viền khung thấp nên sẽ thuận tiện cho việc bố trí kim giữ trứng (holding) và kim lấy nhân/ chuyển nhân (enucleation/ injection). Sơ đồ đĩa chuyển nhân được hướng dẫn ở Hình 8: (1) Những giọt Polyvinyl-pyrrolidone (PVP) sẽ được bố trí ở phần nửa trên của đĩa petri và xếp thành 3 hàng; (2) Môi trường HEPES-CB được sắp xếp ở vị trí bên phải ở dưới; (3) những giọt HEPES 199 cho quá trình chích nhân sẽ được đặt ở vị trí bên trái ở dưới của đĩa petri. 1. Kim holding được bổ trí ở phần dưới và chính giữa đĩa petri (Hình 8). Khi lắp kim holding cần chắc chắn rằng kim đã được lắp thẳng, phần góc kim phải song song với mặt phẳng và toàn bộ vị trí của kim phải nằm ở chính giữa giọt HEPES 199. 349
2. Kim lấy nhân và chuyển nhân (enucleation & injection) được lắp ở giọt PVP đầu hàng đầu tiên (Hình 8). Đây là vị trí rửa kim, nơi mà thủy ngân được đẩy ra từ kim nhằm mục đích đẩy những vật thể dính vào lòng kim và thành kim trong quá trình lấy nhân và chuyển nhân. Giống như kim holding, kim lấy nhân và chuyển nhân cũng phải được lắp thẳng, góc kim song song với mặt phẳng. Hình 8. Sơ đồ đĩa và lắp đặt đĩa SCNT trên kính hiển vi vi thao tác (A. Sơ đồ đĩa vi thao tác; B. Vị trí lắp đạt đĩa vi thao tác trên kính hiển vi Vi thao tác) 3.3 Quá trình lấy nhân trứng (enucleation) (Atabay et al. 2001) 1. Một nhóm 10 trứng được chuyển vào khu vực lấy nhân chứa CB khoảng 10 phút và bắt đầu lấy nhân (Hình 9). 2. Trứng được đặt ở phần nửa trên của giọt môi trường. Mỗi khi hoàn thành quá trình lấy nhân, từng trứng một sẽ được đẩy xuống vị trị nửa dưới của giọt môi trường nhằm phân biệt giữa trứng đã lấy nhân và chưa lấy nhân. 3. Ở heo, mặt phẳng phân bào (metaphase plate) có nhiễm sắc thể liên kết với thể cực đầu (1st polar body) bởi thoi vô sắc (micro-spindle). Do đó, khi lấy nhân, mặt phẳng trứng có thể cực đầu sẽ được cố định ở vị trí 3 giờ (Hình 9 A). 4. Sử dụng sóng piezo kênh A để làm thủng màng zona (zona pellucida) và đưa kim lấy nhân vào (Hình 9B-C). 5. Nhẹ nhàng hút thể cực đầu và tế bào chất xung quanh, nơi được cho là có sự hiện diện của nhân trứng (Hình 9 D). 6. Trứng sau khi được lấy nhân thành công sẽ được đẩy về phía dưới và đợi 20 phút trước khi chuyển vào môi trường ủ. 7. Các mẻ 10 trứng tiếp theo sẽ được thực hiện liên tục như trên Hình 9. Các thao tác trong quá trình lấy nhân trứng heo 350
Chú ý: Việc nhuộm huỳnh quang thường chỉ được áp dụng đối với khối nhân đã được lấy ra để xác định sự thành công của quá trình lấy nhân, trong thực tế sẽ không áp dụng đối với trứng đã lấy nhân vì sẽ tổn hại cho trứng. 3.3 Quá trình chuyển nhân tế bào vào trứng đã lấy nhân (donor nuclei injection) (Lee et al., 2003; Koo et al., 2000) Tế bào sinh dưỡng sau khi dùng Trypsin để tách khỏi đĩa nuôi cấy sẽ được rửa với DMEM và giữ trong 200 μL HEPES 199 ở 37oC đến khi sử dụng. 1- Tế bào được chuyển vào hàng thứ 3 của khu vực PVP (Hình 8). 2- Trứng đã lấy nhân chuyển vào khu vực injection (Hình 8). 3- Dùng kim injection hút từ 5-7 tế bào vào trong lòng kim. Loại bỏ thành tế bào bằng cách hút và nhả tế bào ra vào kim. Chú ý: không nên hút quá 10 tế bào vì sẽ rất dễ gây kẹt/ dính tế bào mỗi khi sóng Piezo được sử dụng. Tránh lấy những tế bào có kích thước lớn vì có thể những tế bào đó đang ở pha phân chia của vòng tế bào. 4- Làm thủng màng zona bằng sóng piezo kênh A và đưa kim chuyển nhân vào gần bên đối diện Trứng sau khi chuyển nhân tế bào (Hình 10A, B) sẽ được đẩy về phía dưới (Hình 10 C) và đợi 20 phút trước khi chuyển vào môi trường ủ và sẵn sàng cho quá trình kích hoạt trứng nhân tạo ở bước tiếp theo. Chú ý: Quá trình chuyển nhân phải được thực hiện ở nhiệt độ phòng (25oC). Không sử dụng bàn giữ nhiệt (thermoplate) trong suốt quá trình lấy nhân cũng như chuyển nhân. Hình 10. Quá trình chuyển nhân tế bào sinh dưỡng vào trứng đã lấy nhân (Mũi tên chỉ nhân tế bào sinh dưỡng trong quá trình chuyển nhân) 3.5 Đánh giá quá trình phát triển phôi heo nhân bản vô tính (Zhou, Huang et al. 2013) Hình 11. Các giai đoạn phát triển của phôi nhân bản vô tính heo (A. 2 TN; B. 4 TB; C. 8 TB; D. phôi dâu; E. Phôi nang (bắt đầu thoát màng); F. Phôi nang thoát màng) 351
4. KẾT LUẬN Việc thiết lập quy trình tạo phôi heo nhân bản vô tính bao gồm một tổ hợp các kỹ thuật hiện đại, chuyên sâu. Nghiên cứu quá trình tạo phôi heo nhân bản vô tính có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật y sinh, hỗ trợ sinh sản, và nghiên cứu về tái biệt hóa tế bào. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Atabay, E. C., et al. (2001). "Factors affecting enucleation rates of bovine and porcine oocytes after removal of cumulus cells by vortexing." Journal of Reproduction and Development 47(6): 365-371. 2. Dang-Nguyen, T. Q., et al. (2020). "Combined refinements to somatic cell nuclear transfer methods improve porcine embryo development." Journal of Reproduction and Development 66(3): 281-286. 3. Dang, H., et al. (2018). A Comparative Study on Meiotic Competence of Pig Oocyte by Two Methods for Collection: Aspiration and Dissection. 6th International Conference on the Development of Biomedical Engineering in Vietnam (BME6) 6, Springer. 4. Hirao, Y., et al. (1994). "In vitro growth and maturation of pig oocytes." Reproduction 100(2): 333-339. 5. Hyun, H., et al. (2016). "Cell synchronization by rapamycin improves the developmental competence of porcine SCNT embryos." Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells") 18(3): 195-205. 6. Jiao, D., et al. (2021). "Improving porcine SCNT efficiency by selecting donor cells size." Cell Cycle 20(21): 2264-2277. 7. Kikuchi, K., et al. (2000). "Maturation/M-phase promoting factor: a regulator of aging in porcine oocytes." Biology of reproduction 63(3): 715-722. 8. Koo, D.-B., et al. (2000). "In vitro development of reconstructed porcine oocytes after somatic cell nuclear transfer." Biology of reproduction 63(4): 986-992. 9. Kwon, D., et al. (2014). "Optimizing Electrical Activation of Porcine Oocytes by Adjusting Pre‐and Post‐Activation Mannitol Exposure Times." Reproduction in domestic animals 49(6): 995-999. 10. Lee, G.-s., et al. (2003). "Improvement of a porcine somatic cell nuclear transfer technique by optimizing donor cell and recipient oocyte preparations." Theriogenology 59(9): 1949-1957. 11. Linh, N. V. and N. T. Hiep (2020). "Effects of in vitro maturation media on in vitro fertility of porcine oocytes and early development of embryos." Vietnam Journal of Biotechnology 18(2): 249-255. 12. Macháty, Z. and R. S. Prather (1998). "Strategies for activating nuclear transfer oocytes." Reproduction, Fertility and Development 10(8): 599-614. 13. Prather, R. S., et al. (1989). "Nuclear transplantation in early pig embryos." Biology of reproduction 41(3): 414-418. 14. Silvestri, G., et al. (2021). "Identification of optimal assisted aspiration conditions of oocytes for use in porcine in vitro maturation: A re‐evaluation of the relationship between the cumulus oocyte complex and oocyte quality." Veterinary Medicine and Science 7(2): 465-473. 15. Vajta, G., et al. (2007). "Somatic cell nuclear transfer in pigs: recent achievements and future possibilities." Reproduction, Fertility and Development 19(2): 403-423. 16. Van Thuan, N., et al. (2002). "Characteristics of preimplantational development of porcine parthenogenetic diploids relative to the existence of amino acids in vitro." Biology of reproduction 67(6): 1688-1698. 17. Zhao, H., et al. (2022). "Supplementation of SDF1 during pig oocyte in vitro maturation improves subsequent embryo development." Molecules 27(20): 6830. 18. Zhou, Y., et al. (2013). "Scriptaid affects histone acetylation and the expression of development- related genes at different stages of porcine somatic cell nuclear transfer embryo during early development." Chinese Science Bulletin 58: 2044-2052. 352