intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Tuyển chọn, xác định điều kiện phù hợp và tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme laccase của chủng BVP 10.2

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

Thêm vào BST
Báo xấu
49
lượt xem 2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày enzyme laccase có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa các hợp chất phenol thành các gốc quinin vào sau đó oxy hóa chúng thành quinon, phản ứng oxy hóa gắn liền với sự khử phân tử oxy tạo thành nước. Chủng nấm mốc BVP 10.2 được phân lập, tuyển chọn từ các mẫu bùn thải tại một số cơ sở dệt nhuộm có sự tham gia xúc tác của các cơ chất đặc hiệu là Syringaldazine và ABTS với hoạt độ enzyme laccase cao nhất sau 5 ngày nuôi cấy đạt 85,5 U/ml.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tuyển chọn, xác định điều kiện phù hợp và tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme laccase của chủng BVP 10.2

  1. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TUYỂN CHỌN, XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN PHÙ HỢP VÀ TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENZYME LACCASE CỦA CHỦNG BVP 10.2 Nguyễn Thị Phương Mai1*, Nguyễn Tuấn Anh1, Bùi Nguyễn Minh Thu2 TÓM TẮT Enzyme laccase có khả năng xúc tác phản ứng chuyển hóa các hợp chất phenol thành các gốc quinin vào sau đó oxy hóa chúng thành quinon, phản ứng oxy hóa gắn liền với sự khử phân tử oxy tạo thành nước. Chủng nấm mốc BVP 10.2 được phân lập, tuyển chọn từ các mẫu bùn thải tại một số cơ sở dệt nhuộm có sự tham gia xúc tác của các cơ chất đặc hiệu là Syringaldazine và ABTS với hoạt độ enzyme laccase cao nhất sau 5 ngày nuôi cấy đạt 85,5 U/ml. Enzyme laccase được tổng hợp cao nhất đạt 190 U/ml trong điều kiện môi trường với 2% tỷ lệ cấp giống ban đầu; 10 g/l glucose; 1,5 g pepton + 1,5 g (NH4)2SO4; 0,3 mM Veratryl alcohol, nồng độ CuSO4 là 250 µm, pH 6, trên máy lắc ở 350C với tốc độ lắc 200 vòng/phút. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme laccase của nấm mốc BVP 10.2 ở nồng độ glucose 1,4%: Veratryl alcohol 0,04%, pH 6 laccase được tích lũy trong môi trường đạt 296 U/ml trong 7 ngày nuôi cấy. Từ khóa: Enzyme laccase, phân lập, tuyển chọn, điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp laccase, tối ưu hóa. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ1 có vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn của cacbon, cũng như oxy hóa các chất màu, thuốc Laccase (EC 1.10.3.2, benzenediol: oxygen nhuộm, các chất thơm,…[6]. oxidoreductase) là một polyphenol oxidase có chứa nhiều nguyên tử đồng trong trung tâm hoạt động, Enzyme laccase được phân bố rộng rãi trong tự tham gia vào liên kết chéo của các monomer, phân nhiên trong các loại thực vật, nấm mốc và vi khuẩn. hủy các polymer và phân cắt vòng của các hợp chất Laccase từ thực vật được nghiên cứu đầu tiên từ Rhus thơm. Enzyme laccase có thể tham gia vào quá trình vernicifera (ở cây sơn mài Nhật Bản) vào năm 1883 oxy hóa các cơ chất chỉ kèm theo sự khử oxy thành [11]. Sau đó, được nghiên cứu ở rất nhiều các loại nước [5]. Tuy nhiên thế oxy hóa khử của enzyme thực vật khác như ở Ficus racemosa L (cây sung), laccase nhỏ hơn so với các hợp chất không chứa Weeping willow (cây thùy dương), Nicotiana phenol, do đó enzyme laccase chỉ có khả năng oxy tabacum (cây thuốc lá) và Prunus persica (cây đào). hóa các cấu trúc không chứa nhóm phenol. Nhờ Ngoài các nguồn enzyme laccase từ thực vật, enzyme những đặc tính nổi bật trên của enzyme laccase mà laccase trong nấm là các enzyme ngoại bào có chứa có thể ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực đời sống, nhiều nguyên tử đồng xúc tác các phản ứng oxy hoá, kinh tế - xã hội như trong công nghiệp thực phẩm, tham gia chủ yếu vào quá trình phân giải lignin. Đây công nghiệp giấy, công nghiệp nhuộm, dệt may, xử là đặc điểm nổi bật của laccase trong nấm đảm thuộc lý môi trường,…[5]. Gần đây, enzyme laccase cũng họ Basidiomycetes. Một số loại nấm đảm đã được được sử dụng trong thiết kế cảm biến sinh học, nghiên cứu kỹ về đặc tính cũng như khả năng sinh nhiên liệu sinh học như một công cụ trong chẩn tổng hợp laccase trong tự nhiên như Pleurotus đoán y tế và làm tác nhân xử lý sinh học để làm sạch ostreatus, Phlebia radiate, Coriolus (Trametes, thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu và một số các chất hóa Polyporus) versicolor. Bên cạnh đó, laccase cũng học độc hại có trong đất. Trong môi trường, enzyme được thu nhận từ các nấm thuộc họ Ascomycetes, laccase có vai trò trong việc phân hủy lignin, axit Deuteromycetes cũng như trong nấm men [4], [6]. humic và tổng hợp các hợp chất humic mới, do đó nó Các laccase trong nấm mốc cũng đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh lý bao gồm quá trình khử độc cho tế bào, quá trình nhiễm nấm mốc của 1 Khoa Môi trường, Trường Đại học Tài nguyên và Môi thực vật. trường Hà Nội * Email: ntpmai@hunre.edu.vn Với mục đích phân lập và tuyển chọn và xác định 2 Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội điều kiện nuôi cấy tối ưu vi sinh vật có khả năng sinh 74 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020
  2. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ enzyme laccase từ bùn thải dệt nhuộm, bài báo trình CuSO4.5H2O: 0,4 mg/l, KH2PO4: 0,5 g/l, bày kết quả tuyển chọn, xác định điều kiện phù hợp NaMoO4.2H2O: 0,02 mg/l, ZnCl2: 2,5 mg/l, và tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme laccase MnCl2.H2O: 0,09 mg/l, H3BO3: 0,07 mg/l, FeCl3:1 của chủng vi sinh vật tuyển chọn. mg/l, thiamine:0,1 mg/l, chloramphenicol: 100 mg/l, 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU tween 80: 0,05%, vetraryl alchohol: 0,2 mM) ở nhiệt độ 37º0C, trên máy lắc 200 vòng/phút trong 4 - 10 2.1. Vật liệu nghiên cứu ngày. Định kỳ lấy mẫu xác định hoạt tính enzyme. Các mẫu dùng cho phân lập, tuyển chọn nấm 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme mốc là mẫu bùn thải dệt nhuộm tại các cơ sở dệt laccase [7] nhuộm thuộc làng Vạn Phúc - Hà Đông, Chúc Sơn - Chương Mỹ, Thanh Trì - Hà Nội. Mẫu sau thu thập Dung dịch phản ứng enzyme gồm: 2,2 ml đệm được bảo quản ở 40C. phosphat 0,1M pH 6,5; 0,3 ml dung dịch syringaldazine 0,216 mM trong methanol, 0,5 ml Chủng Trametes multicolour được làm chủng dung dịch enzym. Trộn đều hỗn hợp phản ứng và đo chuẩn sinh enzyme laccase để kiểm chứng hoạt tính độ tăng của độ hấp thụ tại 530 nm của hỗn hợp phản enzyme laccase từ chủng tuyển chọn. ứng so sánh với mẫu kiểm chứng sau mỗi phút phản 2.2. Phương pháp nghiên cứu ứng. Phản ứng kiểm chứng sử dụng nước khử ion 2.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc sinh tổng thay cho enzyme. hợp enzyme laccase từ mẫu bùn thải dệt nhuộm Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme Các chủng nấm mốc sau khi được phân lập trên trong một phút tại pH 6,5, 300C chuyển hóa được 1 môi trường MEA (dịch chiết malt 20 g/l, µmol syringaldazine (ε=65 mM−1 cm−1). chloramphenicol 100 mg/l, agar 20 g/l) (MT1), được 2.2.4. Nghiên cứu các yếu tố môi trường ảnh cấy chuyển trên các môi trường chứa chất chỉ thị: hưởng đến sinh tổng hợp enzyme laccase môi trường MEA có bổ sung 0,5% axit tanic (MT2) Nấm mốc BVP 10.2 được nuôi trong bình tam [5], môi trường khoáng rắn (Glucose 10 g, giác trên môi trường MT6 ở các điều kiện khác nhau Asparagine 3 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, CaCl2 0,1 g, về nồng độ glucose từ 5 - 10 g; pepton 1 - 3 g; K2 HPO4 0,6 g, KH2PO4 0,5 g, NaMoO4 .2H2O 0,02 (NH4)2SO4 1 - 2 g; Veratryl alcohol từ 0,1 - 0,4 mM; mg, ZnCl2 2,5 mg, CuSO4 .5H2O 0,4 mg, MnCl2.H2O CuSO4 150 - 300 µm; pH thay đổi từ 5 - 7 và nhiệt độ 0,09 mg, H3BO3 0,07 mg, FeCl3 1mg, thiamine 0,1 trong khoảng 30 - 400C. Lấy mẫu trong 5 ngày để xác mg, chloramphenicol 100 mg, tween 80 0,05%, định khả năng tổng hợp của enzyme laccase từ nấm Vetraryl alchohol 0,2 mM) bổ sung 0,04% RBBR mốc. (MT3) nuôi ở 30°C trong 5 - 10 ngày [6], nuôi trên môi trường khoáng rắn và nhỏ lên khuẩn lạc 0,01% 2.2.5. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp Syringaldazine (MT4), 0,216 mM ABTS (MT5) [8]. enzyme laccase bằng quy hoạch thực nghiệm [1] Những chủng cho khuẩn lạc có các vòng oxy hóa: * Thiết lập mô hình toán học màu nâu đậm xung quanh trên MT2 hoặc nhạt/mất Mô hình toán học biểu diễn mối quan hệ giữa màu môi trường trên MT3 được tuyển chọn tiếp theo hàm mục tiêu và các yếu tố ảnh hưởng: trên MT4, MT5. Những chủng xuất hiện màu hồng với syringaldazine trên MT4 và màu xanh với ABTS Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3 trên MT5 sẽ được nuôi lỏng để xác định hoạt độ Trong đó: Y là hàm mục tiêu; Xi là các biến mã enzyme laccase. số (Chỉ nhận các giá trị -1,0,+1); bi là các hệ số diễn tả 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy để thu nhận mức độ ảnh hưởng của các biến Xi đến hàm mục tiêu. enzyme laccase Lập ma trận thực nghiệm yếu tố đầy đủ: Các chủng nấm mốc được nuôi kiểm tra khả Số thí nghiệm N=2n (n: số yếu tố ảnh hưởng, 2 năng tổng hợp enzyme laccase trên môi trường MT6 số mức thí nghiệm +, -) [8] (glucose: 10/l, malt extrac: 0,5 g/l, cao nấm men: 1 g/l, (NH4)2SO4: 5,5 g/l, pepton: 5 g/l, Với n = 2, và với 3 thông số ảnh hưởng chính, ta Mg.SO4.7H2O: 0,6 g/l, asparagine: 3 g/l, lập được bảng ma trận thực nghiệm. N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 75
  3. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Bảng 1. Ma trận thực nghiệm Mã Thực YTB TN Y1 Y2 Sj2 X1 X2 X3 X1 X2 X3 1 + + + 2 + + - Là các giá 3 - + + trị cụ thể 1 4 - + - xác định S 2j   (Yi  YTB ) 2 k 1 5 + - + được khi Ytb=(Y1 +Y2)/2 Với k số lần lặp lại thí 6 + - - tiến hành nghiệm. 7 - - + thực 8 - - - nghiệm Tổng Kiểm tra độ đồng nhất của ma trận: Mục đích S  S 2 b b của quá trình này để xem các số liệu trong ma trận có được đo với cùng độ chính xác như nhau hay không. 2 Gtt= Max ( Sj ) j: 1-N Giá trị bảng tiêu chuẩn Student đối với mức ý  S 2j nghĩa p = 0,05; bậc tự do là f1 = N(K-1). Từ đó tra Kiểm tra sự có nghĩa theo tiêu chuẩn Cochran bảng để xác định tb. tính Gb(f1, f2) với f1=k-1=2-1=1 Tính: f2 = N = 8, với p = 0,05 Nếu bi> tb.Sb thì tất cả các hệ số đều có nghĩa. Nếu G tt
  4. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ - Chọn khoảng biến đổi cơ sở là khoảng biến đổi Thanh Trì - Hà Nội, sau đó được tiến hành phân lập ứng với biến cơ sở Xcs. trên môi trường MEA thu được 116 chủng có hình - Tính các bước nhảy cho các biến còn lại thái giống nấm mốc. Trong đó có 55 chủng từ mẫu bùn thải dệt nhuộm tại làng Vạn Phúc; 38 chủng thu bi   i X i   X cs được từ mẫu dệt nhuộm của huyện Thanh Trì và 23 b cs   cs chủng từ mẫu bùn thải dệt nhuộm của thị trấn Chúc - Lập ma trận giả định để thực hiện tối ưu hóa. Sơn - Chương Mỹ. Các chủng sau khi phân lập tiến hành sàng lọc tuyển chọn trên môi trường MT2, Bảng 2. Ma trận giả định thực hiện tối ưu MT3 để nhận biết chủng dương tính. TN X1 X2 X3 Y 0 0 0 Từ 116 chủng nấm mốc ban đầu, qua bước sàng 1 X1 - ∆X1 X2 - ∆X2 X3 - ∆X3 0 0 lọc lần 1 trên môi trường có chứa axít tanic thu được 2 X1 X2 X30 53 chủng có hoạt tính enzyme laccase, tiếp tục sàng 3 X10+ ∆X1 X20 + ∆X2 X30+ ∆X3 lọc trên môi trường có chứa chất thử đặc hiệu RBBR 4 X10+ 2.∆X1 X20+ 2.∆X2 X30+ 2.∆X3 thu được 34 chủng. 5 X10+ 3.∆X1 X20+ 3.∆X2 X30+3. ∆X3 Sàng lọc tiếp lần 2 trên môi trường khoáng rắn 2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu có sử dụng cơ chất đặc hiệu là Syringaldazine 0,1% và Số liệu được xử lý số liệu thống kê thông qua ABTS 0,216 mM, thu được 18 chủng dương tính cho phần mềm Excel Microsoft. kết quả màu thể hiện rõ rệt. Tiến hành xác định hoạt tính laccase của 18 chủng nấm mốc trên môi trường 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU lỏng (MT6) với tốc độ lắc 200 vòng/phút; nhiệt độ 3.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt nuôi 30°C, định kỳ sau 24 giờ lấy mẫu xác định hoạt tính enzyme laccase độ enzyme. Kết quả hoạt độ enzyme laccase cao nhất Từ các mẫu bùn thải dệt nhuộm thu thập được của từng chủng thể hiện ở bảng 3. tại Vạn Phúc - Hà Đông, Chúc Sơn - Chương Mỹ và Bảng 3. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase ngoại bào của các chủng nấm mốc Hoạt độ cao nhất Hoạt độ cao nhất Chủng Ngày Chủng Ngày (U/ml) (U/ml) BVP 1.4 82,5 5 BTT 9.2 69,7 6 BVP 5.2 65,2 7 BCS 1.2 80,4 10 BVP 5.5 42,6 7 BCS 2.3 99,1 10 BVP 8.3 80,9 8 BCS 3.4 47,3 8 BVP 10.2 85,5 5 BCS 5.2 78,2 5 BVP 10.4 86,6 6 BCS 7.2 79,7 7 BTT 2.2 75,8 5 BCS 3.3 102,6 8 BTT 4.3 86,6 8 BCS 8.6 95,3 10 BTT 8.1 76,9 5 Trametes BTT 8.6 85,8 6 100,4 10 multicolor Các chủng nấm mốc tuyển chọn được đều cho 66,74 U/ml [2]. Vì vậy chủng BVP 10.2 được lựa hoạt tính enzyme laccase từ 52,6 U/ml đến 102,6 chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. U/ml, đạt từ 50% - 102% so với chủng chuẩn Trametes 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố multicolor trong đó, chủng BVP 10.2 là có hoạt tính đến tổng hợp enzyme laccase từ nấm mốc laccase cũng khá cao và thời gian sinh tổng hợp 3.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng tương đối ngắn (85,5 U/ml, 5 ngày). Điều này cũng tổng hợp enzyme laccase được chứng minh trong nghiên cứu của Afreen, S và cs về tuyển chọn vi khuẩn lam Spirulna platensis sinh Chủng BVP 10.2 được hoạt hóa trên MT6 trong tổng hợp enzyme laccase đạt cao nhất ở ngày thứ 4 là 24 giờ ở 30º0C, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Tỷ lệ cấp N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 77
  5. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ giống được thay đổi từ 0,5% đến 5%. Định kỳ 24 giờ thể hiện ở bảng 4. lấy mẫu xác định hoạt độ enzyme laccase. Kết quả Bảng 4. Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả năng tổng hợp enzyme laccase từ chủng BVP 10.2 Thời gian Hoạt độ laccase (U/ml) (ngày) Tỷ lệ 1 2 3 4 5 6 7 cấp giống (%) 0,5 12,5±0,5 49±0,5 58±0,45 62,5±0,06 68,4±0,17 74±0,25 67,9±0,25 1 13,4±0,45 50,1±0,06 70±0,05 71±0,5 76,8±0,25 60±0,25 52,3±0,15 1,5 14,3±0,25 60±0,5 74±0,5 77±0,5 79±0,5 61±0,45 53,9±0,45 2 31,3±0,17 62±0,17 87,8±0,17 98,6±0,45 85±0,25 76,8±0,5 61,5±0,06 2,5 37,5±0,06 61±0,45 87±0,5 98,3±0,17 86±0,17 72,5±0,17 60,6±0,25 3 38,3±0,35 63,7±0,25 95,8±0,25 88,3±0,06 83±0,06 70,2±0,06 60,3±0,5 3,5 40±0,5 64,2±0,5 93,3±0,5 88,3±0,06 80±0,06 64,2±0,45 58±0,5 4 42,4±0,05 65±0,25 88,8±0,06 83,4±0,45 78±0,25 62,4±0,5 57±0,5 5 42,5±0,15 65,4±0,05 89±0,5 87,9±0,5 77±0,25 62±0,5 56,6±0,45 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống sinh ra các chất độc ảnh hưởng đến quá trình tổng đến khả năng tổng hợp enzyme laccase tổng hợp hợp enzyme laccase trong môi trường [10]. Như vậy, trong bảng 4 cho thấy với tỷ lệ cấp giống từ 0,5% - để hạn chế vấn đề trên tỷ lệ cấp giống 2% được lựa 1,5% hoạt độ enzyme laccase đạt 77,17 U/ml, khi chọn để nghiên cứu. tăng tỷ lệ cấp giống lên 2% - 3,5% đạt 93,29 - 98,59 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon và U/ml) và đạt hiệu quả cao nhất ở ngày thứ 4 nuôi cấy nồng độ cacbon đến khả năng tổng hợp enzyme với tỷ lệ cấp giống 2% là 98,59 U/ml. Khi tỷ lệ cấp laccase giống càng cao, tốc độ tăng trưởng của nấm càng Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon mạnh, quá trình tổng hợp enzyme laccase cũng từ đó đến khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase được được tổng hợp nhanh hơn. Tuy nhiên, tốc độ tăng trình bày trong hình 1. trưởng của nấm mà quá nhanh, làm cho các chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt nhanh, sản B Hình 1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon (A) và nồng độ cacbon (B) đến khả năng tổng hợp enzyme laccase từ nấm mốc BVP 10.2 Kết quả cho thấy enzyme laccase được tổng hợp U/ml; galactose đạt 87 U/ml; lactose đạt 67 U/ml; rỉ cao nhất sau 4 ngày nuôi cấy từ glucose đạt 110 đường đạt 66 U/ml. Glucose được xem là một loại U/ml; malt extract đạt 98 U/ml; saccarose đạt 90 đường đơn có khả năng dễ hấp thu nhất cho tất cả 78 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020
  6. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ các loại vi sinh vật, điều này cũng được chứng minh thể sinh ra các sản phẩm không mong muốn phân trong nghiên cứu của Afreen, S và cs trong sử dụng hủy enzyme laccase. Mặt khác sinh khối lớn dẫn tới nguồn glucose, enzyme laccase từ vi khuẩn lam được hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường giảm đi làm tổng hợp cao nhất là 59,928 U/ml [2]. Nấm mốc BVP cho khả năng tổng hợp enzyme laccase giảm [9]. 10.2 được nuôi trong môi trường có bổ sung glucose Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng của nồng độ sau 4 ngày nuôi cấy hoạt độ enzyme laccase đạt cao glucose tới tổng hợp enzyme laccase ở hai khía cạnh. nhất ở nồng độ 5 g/l là 44 U/ml; 8 g/l đạt 85 U/ml; Nồng độ glucose thấp (5 g/l) không giúp enzyme 10 g/l đạt 115 U/ml; 12 g/l đạt 85 U/ml; 15 g/l đạt laccase tổng hợp cao có thể do không đủ cacbon cho 78 U/ml (hình 1b). Như vậy, glucose 10 g/l hoạt độ sinh trưởng, nhưng glucose cao (15 g/l) giúp sinh enzyme laccase tăng gấp 2 lần so với nồng độ khối phát triển mạnh và có thể làm hạn chế tổng hợp glucose 5 g/l và tăng gấp 1,3 lần so với 15 g/l. Sinh enzyme laccase do hàm lượng oxy trong môi trường khối tăng trưởng nhanh thì giúp cho việc tổng hợp bị hạn chế. Như vậy, nồng độ glucose 10 g/l cho các enzyme laccase cũng sớm hơn, nhưng khi sinh khối nghiên cứu tiếp theo. tăng quá nhanh thì một số thành phần dinh dưỡng 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ và trong môi trường cạn kiệt nhanh do đó sẽ không duy nồng độ nitơ đến khả năng tổng hợp enzyme laccase trì sự tăng trưởng dài cho nấm mốc BVP 10.2 và có Bảng 5. Ảnh hưởng nguồn nitơ đến tổng hợp enzyme laccase từ nấm mốc BVP 10.2 Thời gian (ngày) Hoạt độ enzyme laccase (U/ml) Nguồn nitơ (g/l) 3 4 5 3 g L-asparagine 78,5±0,5 100±0,45 82,6±0,5 3 g pepton 86,8±0,45 101±0,06 89,3±0,5 3 g cao nấm men 83,5±0,5 89,6±0,17 81,7±0,45 3 g (NH4)2SO4 86,5±0,5 87,6±0,35 77,6±0,17 3 g NH4NO3 42,9±0,35 78,7±0,25 63,48±0,25 1,5 g pepton + 1,5 g (NH4 )2SO4 95,0±0,17 120,5±0,5 91,2±0,25 1,5 g pepton + 1,5 g NH4NO3 45,5±0,17 82,2±0,45 69,1±0,25 Kết quả nghiên cứu tổng hợp trong bảng 5 xác trường nên giúp cho quá trình tổng hợp enzyme định nguồn nitơ được sử dụng là 3 g pepton và 1,5 g laccase được cao hơn [2]. Dựa trên cơ sở này, lựa pepton kết hợp với 1,5 g (NH4)2SO4 cho hoạt độ chọn phương án kết hợp nguồn nitơ là pepton và enzyme cao đạt từ 101 U/ml – 120,5 U/ml. Tuy (NH4)2SO4 đánh giá ảnh hưởng của nồng độ nitơ đến nhiên, khi có sự kết hợp giữa nguồn nitơ hữu cơ và tổng hợp enzyme laccase trong dịch nuôi cấy, kết nguồn nitơ vô cơ có thể làm thay đổi pH của môi quả thể hiện trong bảng 6. Bảng 6. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ đến sinh tổng hợp enzyme laccase từ nấm mốc Bố trí thí Thời gian (ngày) Hoạt độ laccase (U/ml) nghiệm Nồng độ nitơ (g/l) 3 4 5 1 3 g pepton 97,8±0,25 105±0,5 82,8±0,35 2 1,5 g pepton + 1,5 g (NH4)2 SO4 65,0±0,06 135±0,5 63,0±0,35 3 2 g pepton + 1 g (NH4)2SO4 96,3±0,5 109,4±0,35 82,7±0,06 4 1 g pepton + 2 g (NH4)2SO4 78,4±0,5 95,6±0,25 64,7±0,25 Kết quả sau 5 ngày nuôi cấy cho thấy phương án tổng hợp mạnh nhất sau 4 ngày nuôi cấy và đạt cực kết hợp giữa 2 nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ có ảnh đại 135 U/ml, phương án kết hợp 2 g pepton + 1 g hưởng đến sinh tổng hợp enzyme laccase của nấm (NH4)2SO4 enzyme laccase tổng hợp cao nhất sau 4 mốc BVP 10.2. Ở phương án kết hợp 1 g pepton + 2 g ngày nuôi cấy cũng chỉ đạt 109,4 U/ml. Việc bổ sung (NH4)2SO4 quá trình tổng hợp enzyme laccase tăng nguồn nitơ vô cơ trong môi trường nuôi cấy cũng có mạnh từ ngày thứ 3 và đạt cao nhất sau 4 ngày nuôi tác động đến môi trường nuôi cấy, vì có thể làm điều cấy là 95,6 U/ml. Tuy nhiên, ở phương án kết hợp 1,5 chỉnh pH của môi trường nuôi cấy làm thuận lợi cho g pepton + 1,5 g (NH4)2SO4 enzyme laccase được quá trình tổng hợp enzyme laccase. Do đó, phương N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 79
  7. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ án kết hợp 1,5 g pepton + 1,5 g (NH4)2SO4 được lựa sinh vật, Cu2+ có thể là một tác nhân hoạt hóa quá chọn trong các nghiên cứu tiếp theo. trình tổng hợp của enzyme [8]. Kết quả nghiên cứu 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của chất cảm ứng và ảnh hưởng của nồng độ các chất cảm ứng Veratryl CuSO4 đến khả năng tổng hợp enzyme laccase alcohol (VA) và nồng độ CuSO4 được thể hiện trong hình 2. Veratryl alcohol được sử dụng như cơ chất cảm ứng đặc hiệu cho sinh tổng hợp enzyme laccase từ vi A B Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ Veratryl alcohol (A) và nồng độ CuSO4 (B) đến khả năng tổng hợp enzyme laccase từ nấm mốc BVP 10.2 Nồng độ Veratryl alcohol có ảnh hưởng rõ rệt CuSO4 200 µm ở cùng một thời điểm nuôi cấy. Trong đến quá trình tổng hợp enzyme laccase trong môi khi đó nồng độ CuSO4 150 µm chỉ đạt cao nhất sau 4 trường nuôi cấy. Khi nồng độ chất cảm ứng thấp 0,1 - ngày nuôi cấy là 78 U/ml và nồng độ CuSO4 300 µm 0,2 mM enzyme laccase chỉ được tổng hợp ra môi là 80 U/ml (quá trình tổng hợp CuSO4 đạt khoảng trường khoảng 80 - 110 U/ml, điều này có thể được lý 51% đến 54% so với nồng độ CuSO4 250 µm). Điều giải là do nồng độ chất cảm ứng thấp chưa đủ để này có thể lý giải là do trung tâm cấu tạo của 2+ enzyme hoạt hóa. Ở nồng độ cao 0,4 mM cũng có thể enzyme laccase chứa các ion Cu nên CuSO4 là ion làm ức chế sự sinh tổng hợp enzyme laccase của chính ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme laccase. chủng nấm mốc BVP 10.2. Ở nồng độ 0,3 mM Nếu nồng độ CuSO4 thấp có thể chưa đủ cho quá enzyme laccase được tổng hợp cao nhất sau 4 ngày trình hoạt động của enzyme laccase, ở nồng độ cao nuôi cấy là 155 U/ml (cao gấp 1,3 - 1,9 lần) so với các lại có thể gây độc cho tế bào dẫn đến ảnh hưởng đến nồng độ khác. khả năng tổng hợp enzyme laccase. Do đó, CuSO4 250 µm được lựa chọn trong các nghiên cứu tiếp Chất cảm ứng ở nồng độ 0,3 mM được lựa chọn theo. để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 đến quá trình tổng hợp enzyme laccase cho thấy: CuSO4 250 3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ µm tổng hợp enzyme laccase cao nhất 175 U/ml sau đến khả năng tổng hợp enzyme laccase 4 ngày nuôi cấy, cao gấp 1,4 lần so với nồng độ A Hình 3. Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt độ (B) đến khả năng tổng hợp enzyme từ nấm mốc 80 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020
  8. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Chủng nấm mốc BVP 10.2 được nuôi cấy trên enzyme laccase cũng tăng theo và đạt 190 U/ml sau các môi trường có giá trị pH khác nhau từ 5 - 7, nhiệt 4 ngày nuôi cấy ở 350C (tăng gấp 1,3 lần so với 300C). độ nuôi cấy thay đổi từ 300C, 350C, 400C, tốc độ lắc Còn ở 400C tốc độ phát triển của nấm mốc chậm, 200 vòng/phút, lượng giống cấp ban đầu 2%. Định kỳ tổng hợp enzyme laccase cũng bị ảnh hưởng (chỉ đạt lấy mẫu xác định hoạt độ enzyme laccase. Kết quả 62%). đánh giá ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp Điều này cho thấy có khả năng enzyme laccase enzyme laccase của chủng BVP 10.2 được thể hiện bị tác động bởi sự phân hủy của các sản phẩm khác trong hình 3. trong quá trình trao đổi chất khi môi trường đã cạn Thông thường enzyme laccase hoạt động tốt kiệt nguồn dinh dưỡng và tế bào tự phân ngày càng trong môi trường axít, trong đó pH 6 cho hoạt độ tăng, việc duy trì quá trình tăng trưởng trong suốt enzyme laccase cao nhất đạt 180 U/ml sau 4 ngày quá trình nuôi cấy sẽ giúp cho sinh tổng hợp enzyme nuôi cấy. Ở pH 6 enzyme laccase được tổng hợp laccase đạt hiệu suất cao [8]. nhanh sau 2 ngày nuôi cấy liên tiếp là 62 U/ml, sau 3.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme đó giảm dần ở các ngày nuôi cấy thứ 5. Ở pH 5 quá laccase của nấm mốc BVP 10.2 trình tổng hợp enzyme laccase sau 4 ngày nuôi cấy 3.3.1. Xây dựng mô hình toán với 3 thông số đạt thấp 105 - 125 U/ml (tương ứng khoảng 42 - 58% Qua nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hưởng so với pH 6). Trong canh trường pH 7 quá trình tổng đến sinh tổng hợp enzyme laccase, ba thông số có hợp enzyme laccase giảm chỉ còn khoảng 46% (hoạt ảnh hưởng lớn nhất đến khả năng sinh tổng hợp độ enzyme đạt 95 U/ml). Ảnh hưởng của nhiệt độ enzyme laccase được lựa chọn: nồng độ glucose (X1, nuôi cấy cũng tác động rõ rệt đến khả năng tổng hợp %); nồng độ Veratryl alcohol (X2; %) và pH môi trường enzyme laccase. Sau 2 ngày nuôi cấy ở khoảng nhiệt (X3). Thiết lập ma trận thực nghiệm từ 3 thông số và độ 300C - 350C là khá tương đồng nhau (60 - 75 cho kết quả theo bảng 7. U/ml). Tuy nhiên, ở các ngày nuôi cấy kế tiếp tốc độ tăng trưởng nhanh thúc đẩy quá trình tổng hợp Bảng 7. Ma trận thực nghiệm và kết quả TN Mã Thực Y1 Y2 YTB Sj2 X1 X2 X3 X1 X2 X3 1 + + + 1,4 0,04 5,5 164 162,5 163 1,25 2 + + - 1,4 0,04 6,5 170 172 171 2 3 - + + 0,6 0,04 5,5 138 136,4 137 1,36 4 - + - 0,6 0,04 6,5 157 163 160 18 5 + - + 1,4 0,02 5,5 131,5 136 134 10,25 6 + - - 1,4 0,02 6,5 142 145,5 144 6,25 7 - - + 0,6 0,02 5,5 112,5 109,5 111 4,5 8 - - - 0,6 0,02 6,5 123,4 121 122 2,96 Tổng 1140 46,57 Kiểm tra độ đồng nhất của ma trận: Tính các hệ số của phương trình: 2 Gtt= Max ( Sj )  18 Y=b0+b1X1 +b2X2+b3X3 2  0 , 39  S j 46 , 57 Kiểm tra sự có nghĩa theo tiêu chuẩn Cochran tính Gb(f1, f2) với f1=k-1=2-1=1 f2=N=8, với p=0,05 Gb=0,6789 Ta có Gtt
  9. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 1 S tu2    (YTN  YTT ) 2  19,33 N B Vậy: Y  142,5  10,25X 1  15 X 2  6,5 X 3 Max ( S y 2 , S tu2 ) 19 ,33 Ftt    6,64 Min ( S y , S tu2 ) 2,91 Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số: Theo tiêu chuẩn Student, các hệ số có nghĩa Kiểm tra sự tương thích của phương trình theo nếu: tiêu chuẩn Fisher. bi  t  S b So sánh giá trị Ftt với Fb, trong đó p: mức ý nghĩa; f1: bậc tự do của phương sai dư f1 = N-B = 4; f2: bậc tự Sb là căn bậc hai của phương sai mà các hệ số do của phương tái hiện f2 = N(K-1) = 8. gánh chịu Tra bảng ta có Fb=7,01, suy ra Ftt< Fb. Vậy mô T: chuẩn số Student hình đã lập hoàn toàn thích ứng. N 2 3.3.2. Tối ưu hóa theo mô hình Box- Wilson S j 46 , 57 Ta có: S y2  j 1   5 ,82 Tối ưu hóa hàm mục tiêu bằng phương pháp leo N 8 dốc, bi là hệ số hồi qui của các yếu tố tương quan, i Phương sai trung bình: là khoảng biến thiên của từng yếu tố, theo công thức S y2 5 ,82 bi.i 2 S    2 ,91 y K 2 b1.1 = 10,25 x 0,4 = 4,1. Phương sai mà các hệ số xác định b2.2 = 12 x 0,01 = 0,12. 2 S2 ,91 y b3.3 = -6,5 x 0,5 = 3,25. S b2    0 ,73 B 4 Vậy chọn X1 làm biến cơ sở, Xcs=0,4; X2= 0,01; B là số hệ số X3= 0,5 S b  0,73  0,85 Bảng 9. Ma trận điều kiện tối ưu TN X1 X2 X3 HĐ (U/ml) Giá trị bảng tiêu chuẩn Student đối với mức ý 1 0,6 0,02 5,0 129,8 nghĩa p = 0,05; bậc tự do là f1=N.(K-1)=8; N=8. Tra 2 1,0 0,03 5,5 162,2 bảng ta có: tb= 1,86 3 1,4 0,04 6,0 249,3 Vậy: t b  S b  1,86  0,85  1,58 4 1,8 0,05 6,5 135,6 5 2,2 0,06 7,0 118,9 bi  1,58(i  1,3) Kết quả nghiên cứu xác định môi trường nuôi Vậy tất cả các hệ số đều có nghĩa. cấy với nồng độ glucose 1,4%; Veratryl alcohol 0,04%; Kiểm tra sự tương ứng của mô hình theo tiêu pH đầu 6,0 là môi trường tối ưu để chủng nấm mốc chuẩn Fisher BVP 10.2 sinh tổng hợp enzyme cao nhất đạt 249,3 Bảng 8. Kiểm tra sự tương ứng của mô hình theo tiêu U/ml. chuẩn Fisher Để kiểm tra thực nghiệm các điều kiện đã được (YTT - tối ưu, chủng nấm mốc BVP 10.2 được nuôi trong TT Mô hình YTT YTN YTN)2 môi trường MT6 với glucose 1,4%, Veratryl alcohol 1 142,5 + 10,25 + 15 - 6,5 161,3 163 2,89 0,04%, pH 6, ở 350C, trên máy lắc 200 vòng/phút. Thu 2 142,5 + 10,25 + 15 + 6,5 174,3 171 10,89 100 ml canh trường sau 24 giờ để xác định sinh khối, 3 142,5 - 10,25 + 15 - 6,5 140,8 137 14,44 pH và hoạt tính enzyme laccase. Kết quả chỉ ra trong 4 142,5 - 10,25 + 15 + 6,5 153,8 160 38,44 5 142,5 + 10,25 - 15 - 6,5 131,3 134 7,29 hình 4. 6 142,5 + 10,25 - 15 + 6,5 144,3 144 0,09 Kết quả thực nghiệm các điều kiện đã được tối 7 142,5 - 10,25 - 15 - 6,5 110,8 111 0,04 ưu cho thấy nấm mốc sinh trưởng mạnh từ ngày thứ 8 142,5 - 10,25 - 15 + 6,5 123,8 122 3,24 2 - 4, với hàm lượng sinh khối đạt từ 8,75 g/l đến 14,8 Tổng 77,32 g/l, sau đó chuyển sang pha cân bằng từ ngày thứ 5. 82 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020
  10. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Bắt đầu từ ngày thứ 8 là pha suy vong. Sau 7 ngày 4. KẾT LUẬN nuôi cấy nấm phát triển với tốc độ cấp số nhân, đồng Từ 18 chủng vi sinh vật có phản ứng dương tính thời làm suy giảm dinh dưỡng trong môi trường nuôi với Syringaldazine và ABTS đã xác định được chủng cấy. Khi tốc độ phát triển càng mạnh đồng thời kèm nấm mốc ký hiệu BVP 10.2 có khả năng sinh tổng theo đó là các sản phẩm của quá trình trao đổi chất hợp enzyme laccase đạt hoạt độ enzyme cao nhất cũng được sản sinh ra làm ảnh hưởng đến sinh 85,5 U/ml trong 5 ngày nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu trưởng của nấm mốc [9]. xác định laccase từ chủng BVP 10.2 được tổng hợp cao nhất đạt 190 U/ml sau 4 ngày nuôi cấy với 2% tỷ lệ cấp giống ban đầu; 10 g/l glucose; 1,5 g pepton + 1,5 g (NH4)2SO4; 0,3 mM Veratryl alcohol, nồng độ CuSO4 là 250 µm, pH ban đầu là 6, ở 350C, trên máy lắc với 200 vòng/phút. Trong điều kiện môi trường tối ưu (môi trường MT6 với glucose 1,4%; Veratryl alcohol 0,04%, pH 6), enzyme được tích lũy trong canh trường đạt 296 U/ml, tốc độ sinh trưởng đạt 17,5 g/l ở ngày thứ 7 nuôi cấy và pH duy trì ổn định ở mức 6 – 6,1. TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình 4. Động thái sinh tổng hợp enzyme laccase từ 1. Hoàng Đình Hòa (1999). Tối ưu hóa trong nấm mốc BVP 10.2 công nghiệp thực phẩm. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hoạt độ enzyme laccase cũng tăng mạnh theo Hà Nội. mức độ sinh trưởng của nấm mốc. Tại ngày thứ 3, 2. Afreen, S; Bano, F; Ahmad, N; Fatma, T khi sinh khối tăng theo cấp số nhân thì hoạt độ (2017). Screening and optimization of laccase from enzyme laccase cũng tăng đạt 137 U/ml. Tuy nhiên ở cyanobacteria with its potential in decolorization of các ngày kế tiếp khi tốc độ sinh trưởng của nấm mốc anthraquinonic dye Remazol Brilliant Blue R. duy trì ở pha cân bằng thì tốc độ tổng hợp enzyme Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 10, pp. laccase tăng dần lên và đạt cực đại 296 U/ml ở ngày 403 - 410. thứ 7, sau đó giảm dần ở ngày thứ 8 cho đến ngày 3. Arora, D. S. & Gill, P. K. (2000). Laccase thứ 10 (205 U/ml xuống 125 U/ml). Theo nghiên production by some white rot fungi under different cứu của Afreen, S cho thấy sinh trưởng đạt cực đại nutritional conditions. Bioresource Technol, 73: 283 - thì tổng hợp laccase mạnh nhất đạt 59,928 U/ml 285. trong 10 ngày nuôi cấy [2]. 4. Camarero, S., O. García, T. Vidal, J. Colom, J. pH môi trường trong quá trình sinh trưởng và C. d. Río, A. Gutiérrez, J. M. Gras, R. Monje, M. J. phát triển của nấm mốc giảm dần so với ban đầu (pH Martínez and Á. T. Martíınez (2004). Efficient khoảng 5,8 – 5,9), sau đó ổn định ở pH 6 và tăng dần bleaching of non-wood high - quality paper pulp ở ngày nuôi cấy thứ 6 từ 6,06 – 6,2. Ở ngày thứ 7 nuôi using laccase - mediator system. Enzyme and cấy khi pH môi trường duy trì ở mức 6 – 6,1 sinh Microbial Technology. 35, pp. 113 - 120. trưởng của nấm mốc đạt 17,5 g/l và tổng hợp enzyme laccase đạt 296 U/ml. Thực nghiệm cho thấy, tối ưu 5. Claus, H. (2003). Laccases: structure, các điều kiện quá trình sinh tổng hợp laccase đạt cao reactions, distribution. 13th International Conference hơn so với khi điều kiện canh trường chưa tối ưu, on Invertebrate Dioxygen Binding Proteins. Mainz, phù hợp với mô hình lý thuyết. Germany Pergamon - Elsevier Science Ltd. Pp. Theo nghiên cứu của Arora và Gill (2000) [3] 6. Gorman, M. J., N. T. Dittmer, J. L. Marshall cho thấy một gợi ý về khả năng tổng hợp laccase cao and M. R. Kanost (2008). Characterization of the của chủng BVP 10.2 trên các môi trường khác với ba multicopper oxidase gene family in Anopheles yếu tố glucose, Veratryl alcohol, pH đã được tối ưu ở gambiae". Insect Biochemistry and Molecular trên cho các nghiên cứu tiếp theo. Biology. 38, pp. 817 - 824. N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020 83
  11. KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 7. Janusz, G., J. Rogalski, M. Barwińska and J. 9. Mcneil, B. and L. M. Harvey (2008). Practical Szczodrak (2006). Effects of culture conditions on Fermentation Technology, Strathclyde Fermentation production of extracellular laccase by Rhizoctonia Centre, Strathclyde University, UK. praticola. Pol J Microbiol. 55 (4), pp. 309 - 319. 10. Shleev, S. V., O. Morozova, O. Nikitina, E. S. 8. Jung, H. C., F. Xu and K. C. Li (2002). Gorshina, T. Rusinova, V. A. Serezhenkov, D. S. Purification and characterization of laccase from Burbaev, I. G. Gazaryan and A. I. Yaropolov (2004). wood-degrading fungus Trichophyton rubrum LKY- Comparison of physico-chemical characteristics of 7. Enzyme and Microbial Technology. 30, pp. 161- four laccases from different basidiomycetes. 168. Biochimie. 86, pp. 693-703. 11. Yoshida, H. (1883). Chemistry of lacquer (urushi). Journal Chemical Soccien. 43, pp. 472 -486. ISOLATION, EFFECTS OF CULTURE CONDITION AND OPTIMIZATION OF LACCASE FROM FUNGUS BVP 10.2 Nguyen Thi Phuong Mai, Nguyen Tuan Anh, Bui Nguyen Minh Thu Summary Enzyme laccase has the ability to catalyze the conversion of phenol compounds and oxidize them to quinones, the oxidation reaction associated with the reduction of oxygen molecules to form water. Syringaldazine and ABTS were use as substrates for screeing the highest laccase enzyme activity of 85.5 U/ml after 5 days of culture. The highest enzyme laccase reached 190 U/ml in the culture conditions with 2% of the initial seeding rate; 10 g/l glucose; 1.5 g pepton + 1.5 g (NH4)2SO4; 0.3 mM Veratryl alcohol, 250 µm CuSO4, pH 6 on shaker at 350C with shaking speed 200 rpm. The optimization studies revealed that the laccase yield was highes 296 U/mL when operated at the following conditions: after 7 days of incubation at 200 rpm, pH 6.0, 1.4% glucose, 0.04% Veratryl alcohol in the production medium. Keywords: Enzyme laccase, Isolation, Selection, Culture conditions for laccase, Optimization. Người phản biện: GS.TS. Phạm Văn Toản Ngày nhận bài: 28/8/2020 Ngày thông qua phản biện: 30/9/2020 Ngày duyệt đăng: 7/10/2020 84 N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n - KỲ 2 - TH¸NG 10/2020
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2