Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn tạo giống lạc kháng bệnh đốm lá muộn

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LẠC KHÁNG BỆNH ĐỐM LÁ MUỘN Đồng Thị Kim Cúc, Lưu Minh Cúc, Lê Thanh Nhuận, Hà Minh Thanh, Phan Thanh Phương và cs Viện Di truyền Nông nghiệp. TÓM TẮT Kỹ thuật sinh học phân tử có khả năng rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả chuyển các gen kháng bệnh từ loài hoang dại vào giống lạc trồng có năng suất cao, quy tụ những đặc tính quý vào một cá thể. Trong 64 dòng giống lạc có 1 giống có khả năng cho gen (A. hypoyca - TN6) và 2 giống có khả năng nhận gen (TB25 và CNC3). Tìm được 60 chỉ thị đa hình dùng để lập bản đồ trên quần thể BC2F1 (TB25xTN6). Bản đồ di truyền liên kết của cây lạc trên quần thể BC2F1 với tổng chiều dài của bản đồ liên kết là 531,8 cM; gồm 16 nhóm liên kết chứa 58 chỉ thị, mỗi nhóm từ 2 tới 7 chỉ thị, khoảng cách trung bình giữa 2 chỉ thị SSR bằng 9,17 cM và 5 QTL là IP1, IP2, LN1, LN2, DS quy định lần lượt 25,26%; 12,26%; 19,6%; 12,43% và 8,65% sự biến động kiểu hình tính kháng bệnh đốm lá muộn. Các chỉ thị liên kết với các QTL có thể dùng cho chọn giống là PM179; GM633; GM2301 IPAHM103; Lec1; seq7G02; TC9F10 và GM1760. Hai QTL LN1 và IP2 cùng nằm trên nhóm liên kết 6, có vị trí rất gần nhau và có chỉ thị PM179 liên quan tới cả hai QTL này. Đã đưa vào hệ thống khảo nghiệm Quốc gia và khảo nghiệm sản xuất 04 giống lạc triển vọng, kháng bệnh đốm lá muộn điểm 13: ĐM1, ĐM2, ĐM3, ĐM4 vượt so với giồng đối chứng L14 từ 16,5% đến 23,0%. Từ khóa: Lạc đốm lá muộn, Chỉ thị phân tử, Bản đồ chỉ thị phân tử liên kết. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh đốm lá muộn là một trong những bệnh lá gây hại nghiêm trọng đối với cây lạc trên toàn thế giới. Bệnh nặng có thể gây tổn thất 50 – 70% sản lượng trong một vụ Tác nhân gây bệnh đốm lá muộn là nấm Phaeoisariopsis personata (Berk. & M.A. Curtis van Arx). Nguồn gen kháng bệnh đốm lá muộn có ở một số ít giống lạc trồng, trong khi một số loài lạc hoang dại Arachis có khả năng kháng cao với bệnh đốm lá muộn (Tiwari và Cs 1984). Nhưng có hạn chế lớn trong việc chuyển gen từ loài lạc hoang dại Arachis vào lạc trồng bởi vì khả năng kết hợp. Kỹ thuật sinh học phân tử có khả năng khắc phục các mặt hạn chế đó, rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả chuyển các gen kháng bệnh tử loài hoang dại vào giống lạc trồng có năng suất cao. Công nghệ chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (MAS) giúp các nhà chọn giống loại trừ được các tính trạng không mong muốn liên kết trong các phép lai và chọn lọc. Do đó, việc nghiên cứu xác định các chỉ thị phân tử có liên quan đến tính kháng bệnh đốm lá muộn góp phần thiết thực trong việc chọn tạo giống kháng bệnh. Việc nghiên cứu di truyền tính trạng năng suất giúp các nhà chọn giống có thể quy tụ những đặc tính năng suất vào một cá thể. 916 II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - Tập đoàn giống: gồm 64 dòng/giống lạc, trong đó 21 dòng/giống được nhập nội và 43 dòng giống trong nước. - Thiết bị và hóa chất: Các thiết bị máy móc, vật liệu hóa chất chuyên dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử & các hóa chất thông dụng khác. Tổng số 425 chỉ thị vệ tinh SSR ở lạc. - Vật liệu dùng cho lấy mẫu, phân lập và lây nhiễm bệnh nhân tạo: Các chủng nấm đốm lá muộn lạc thu thập từ các vùng có dịch bệnh để đánh giá bệnh nhân tạo. 2.2. Phương pháp - Phương pháp CTAB cải tiến để tách chiết ADN. - Phương pháp PCR và điện di trên gel polyacrylamide để phân tích các chỉ thị SSR. - Phương pháp MAP MAKER QTL để lập bản đồ di truyền liên kết. - Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng: Theo quy trình kỹ thuật sản xuất lạc của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ban hành, được thiết kế theo khối ngẫu nhiên RCBD với 3 lần nhắc lại. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai - Phương pháp đánh giá, điều tra, lây bệnh bệnh đốm lá muộn: theo phương pháp của Viện Bảo vệ Thực vật và Viện Nghiên cứu Quốc tế Cây trồng cạn (ICRISAT). 3.1. Thu thập, đánh giá, xây dựng nguồn vật liệu tập đoàn 64 giống lạc thu thập được cho thấy có 2 giống: số 9 (CNC3) và giống số 16( TB25) năng suất cao nhưng bị nhiễm nặng với bệnh đốm lá muộn, tỷ lệ bệnh từ 11,22 13,74%; chỉ số bệnh từ 1,55 - 1,77%. Giống A. hypoyca *A. cardenasii (TN6) kháng cao với bệnh đốm lá muộn (điểm 1), tỷ lệ bệnh 1,62%; chỉ số bệnh 0,15 %. 3.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm hạt của các mẫu giống 3.2. Lập bản đồ QTLs liên kết tính trạng kháng bệnh đốm lá muộn Đã thu thập được một tập đoàn lạc gồm 64 mẫu giống từ nguồn trong nước và nhập nội. Trong tập đoàn 67,2% là giống lạc địa phương, 32,8% là các giống lạc nhập nội. 3.2.1. Sàng lọc chỉ thị đa hình giữa hai giống bố mẹ của quần thể lập bản đồ TB25/TN6 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh đốm muộn của tập đoàn giống Đã sử dụng 425 chỉ thị trong sàng lọc, đánh giá đa hình giữa các giống bố mẹ của quần thể lập bản đồ để tìm các chỉ thị phân tử đa hình phục vụ cho mục đích lập bản đồ. Đánh giá tính kháng bệnh đốm muộn của 19 20    21    22    23     24    25     26      27      28      29     30      1 2   3  4  5  6 7  8  9  10 11 12 13  14 15  16  17 18  31  32  33  34  35 36  37  38  39   40   41  42  43  44  45  46  47  48   49  50  51  52  53  54  5556 57 58 59  60  61  62 63 64 65 66 67 68  69 70 71 72 73 74 75 76   77    Hình 1. Kết quả đánh giá đa hình hai giống lạc TB25 và TN6 để sàng lọc chỉ thị đa hình dùng cho lập bản đồ. Hình 1 cho thấy, hai giống TB25 và TN6 sàng lọc với 54 chỉ thị cho kết quả 13 chỉ thị cho đa hình, đó là các chỉ thị số13, 14, 15, 24, 26, 31, 32, 39, 41, 44, 47, 48, 52. Tiếp tục sàng lọc các chỉ thị khác, kết quả là, trong tổng số 425 chỉ thị sử dụng, chỉ có 60 chỉ thị đa hình được dùng để lập bản đồ trên quần thể BC2F1. Danh sách các chỉ thị cho đa hình được tổng hợp trong bảng 1. Bảng 1. Chỉ thị đa hình giữa hai giống bố mẹ của quần thể lập bản đồ TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tên chỉ thị Seq13A7 Seq 1B09 Seq13E06 Seq14C11 Seq7G02 Seq17C09 Seq19A5 Seq3F05 Seq3A08 Seq2A05 Seq3E10 Seq8D09 TT 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Tên chỉ thị Seq10B01 Seq14B04 GM1501 GM633 GM660 GM1760 GM1979 GM2009 GM2301 GM1883 GM2407 GNB560 TT 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Tên chỉ thị GNB686 GNB1062 GNB38 TC5A06 TC1A08 TC4F12 TC9F04 TC9F10 TC5A06 TC1A02 TC4D09 TC4G02 TT 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Tên chỉ thị TC3B04 TC3E05 TC7H11 TC9B07 TC1D12 PM73 PM3 PM179 PM188 Seq2H8 IPAHM395 IPAHM606 TT 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Tên chỉ thị IPAHM524 IPAHM103 IPAHM272 IPAHM531 IPAHM176 IPAHM282 IPAHM352 IPAHM356 GM1878 S09 Lec1 GM2689 917 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 3.2.2. Phân tích di truyền tính kháng bệnh đốm lá muộn Sự di truyền tính kháng bệnh đốm lá muộn thể hiện qua các chỉ tiêu được theo dõi (IP, LN, DS) trên quần thể BC1F2. Số liệu phân tích các chỉ tiêu liên quan đến tính kháng bệnh đốm muộn trên quần thể được đưa vào phân tích thống kê. Bảng 2. Phân tích thống kê các chỉ tiêu nghiên cứu trên quần thể BC2F1 Chỉ số Giá trị TB Độ lệch Độ xiên (Sk) (X) chuẩn (s) Độ nhọn (Kur) IP 28,67 3,05 0,935 - LN 19,2 11,56 0,129 1,355 DS 5,4 0,9 -0,681 -1,786 Giá trị χ2 TN Giá trị χ2 LT (p=0.01) Đồ thị biểu diễn các tính trạng liên quan đến bệnh đốm lá muộn (IP, LN, DS) được thể hiện ở các hình sau:       7 ngày     14 ngày        21 ngày     A ‐ Triệu chứng bệnh  1‐10  11‐20  21‐40  41‐50  trên 50 B - Vết bệnh/lá 1          3          5            7            9  C‐ Cấp bệnh  Hình 2. Đồ thị sự phân bố các giá trị của chỉ số IP(A); LN (B); DS (C) trên quần thể nghiên cứu BC2F1. Ba chỉ số IP, LN và DS sẽ được sử dụng để nghiên cứu tiếp nhằm xác định các locut tính trạng số lượng quy định tính kháng bệnh đốm lá muộn ở lạc. 3.2.3. Lập bản đồ, phân tích và xác định các chỉ thị phân tử liên kết với QTL/gen kháng đốm muộn. Sử dụng 60 chỉ thị SSR cho đa hình giữa hai giống bố mẹ TB25 và TN6. Ghi nhận các alen của từng locut SSR đối với các cây bố mẹ và mỗi cá thể BC1F2. Hình 3. Sử dụng chỉ thị Seq13A7, chỉ thị Seq7G02 & chỉ thị Seq3A08 phân tích các cá thể của quần thể BC2F1 trên gel polyacrylamide 6% (A.TB25, B.TN6, H. Cá thể dị hợp tử) Hình 4. Sử dụng chỉ thị Seq3A10 , chỉ thị GM1501 & chỉ thị GM660 phân tích các cá thể của quần thể BC2F2 trên gel polyacrylamide 6% (A.TB25, B.TN6, H. Cá thể dị hợp tử) 918 Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ hai Hình 5. Sử dụng chỉ thị TC4F12, chỉ thị GNB38 & chỉ thị TC1D12 phân tích các cá thể của quần thể BC2F1 trên gel polyacrylamide 6% (A.TB25, B.TN6, H. Cá thể dị hợp tử) Số liệu được ghi nhận lại và fomat dưới dạng phù hợp để phân tích trên chương trình MapMaker 3.0 của Lander. Hình 6. Bản đồ nhóm liên kết LG1-LG16 đối với 58 cặp mồi sử dụng phân tích trên phần mềm Map Maker. LOD = 3. b. Xác định các chỉ thị phân tử liên kết với QTL/gen kháng đốm muộn Các số liệu quan sát của 3 chỉ số IP, LN và DS quần thể BC2F1 được nhập vào bản đồ nhóm liên kết để xử lý trong chương trình MAPMAKER/QTL 1.1 và QTL Cartoghrapher 1.17. Kết quả cho thấy trên bản đồ liên kết có 5 QTL chi phối các locut IP (gồm 2 QTL IP1, IP2), LN (gồm 2 QTL LN1, LN2) và DS (gồm 1 QTL). Hình 7. Bản đồ nhóm liên kết với các QTL quy định tính kháng bệnh đốm lá muộn đối với các locut IP, LN và DS trên cây lạc 3.3. Nghiên cứu chọn tạo giống lạc kháng bệnh đốm muộn bằng chỉ thị phân tử 3.3.2. Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết QTL kháng bệnh đốm muộn trong chọn giống 3.3.1. Phát triển và đánh giá chọn lọc các cá thể quần thể lập bản đồ phục vụ cho công tác chọn giống Sử dụng giống nhận gen kháng CNC3 có các đặc tính tương tự như giống TB25 và vẫn giống kháng bệnh là TN6 làm giống cho gen. Tiến hành lai tạo để tạo ra các thế hệ con lai F1, BC1F1, BC2 F1,… Kết quả đã lai tạo được 18 cá thể F1(CNC3/TN6). Các cá thể ở thế hệ F1 được đưa vào đánh giá kiểm tra xác định đúng con lai để tiếp tục phát triển các thế hệ tiếp theo. Tổng số 18 con lai F1(CNC3/TN6) của các tổ hợp lai Từ kết quả sàng lọc 96 cá thể BC2F1, kết quả chọn được 60 cá thể mang gen kháng bệnh đốm lá muộn. Phát triển 60 cá thể ở thế hệ BC2F1 thành 60 dòng BC2F2 ở thế hệ tiếp theo, đã chọn được 17 dòng BC2F2 có tiềm năng năng suất >20g/cây, dạng hình đẹp, triển vọng. 919 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM đã thu được 48 cá thể BC2F1. Các cá thể này sẽ được kiểm tra để xác định gen đốm lá muộn bằng các chỉ thị liên kết: Hình 8: Sử dụng chỉ thị TC9F10, chỉ thị GM1760 & chỉ thị IPAHM356 để chọn cá thể mang gen kháng thế hệ BC2F1, CNC3; B. TN6; H. con lai được chọn Với chỉ thị TCF10 ; IPAHM356 ; GM1760 đã chọn được 4 cá thể; 3 cá thể và 5 cá thể mang gen kháng bệnh đốm lá muộn. Các cá thể này sẽ được chọn để phát triển các thế hệ tiếp theo. Hình 9: Sử dụng chỉ thị IPAHM103 & chỉ thị IPAHM356 để chọn cá thể mang gen kháng thế hệ BC2F1 với A.CNC3; B. TN6; H.con lai được chọn. Với chỉ thị IPAHM103 đã chọn được 6 cá thể, chỉ thị IPAHM356 đã chọn được 7 cá thể mang gen kháng bệnh đốm lá muộn. Các cá thể này sẽ được chọn để phát triển các thế hệ tiếp theo. Hình 10 : Sử dụng chỉ thị G2301 & chỉ thị seq7G02 để chọn cá thể mang gen kháng thế hệ BC2F1 với A.CNC3; B. TN6; H. con lai được chọn. Với chỉ thị seq7G02 đã chọn được 1 cá thể mang gen kháng bệnh đốm lá muộn. Các cá thể này sẽ được chọn để phát triển các thế hệ tiếp theo. Như vậy, bằng sử phương pháp dụng chỉ thị phân tử liên kết QTL/gen kháng bệnh đốm lá muộn chúng tôi đã xác định được 29 cá thể ở thế hệ BC2F1 mang QTL liên kết gene kháng. Các cá thể này được giữ lại để tiếp tục chọn lọc trong thế hế tiếp theo. Với 29 cá thể ở thế hệ BC2F1, chúng tôi đã phát triển được 24 dòng ở thế hệ BC2F2 (từ CL1 đến CL24). Các dòng này sẽ được sàng lọc bằng các chỉ thị phân tử liên kết chặt với QTL kháng bệnh đốm lá muộn. Hình 11: Sử dụng chỉ thị PM179 để chọn cá thể mang gen kháng dòng CL1& CL4 Kết quả: dòng CL1 chọn được 9 cá thể, dòng CL4 chọn được 5 cá thể , dòng CL5 chọn được 10 cá thể mang gen kháng bệnh đốm lá muộn. 920