Ứng dụng kỹ thuật ARMS-PCR để xác định một số đột biến gen BRCA1 ở bệnh nhân ung thư vú

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

4
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

BRCA1 là các gen ức chế khối u nằm trên các nhiễm sắc thể 17q21 có chức năng điều hòa quá trình tăng trưởng và và kiểm soát quá trình phân chia của tế bào. Bài viết trình bày xác định tỷ lệ đột biến gen BRCA1 4153delA, 185delAG, Cys61Gly (300T>G) và 5382insC trên bệnh nhân ung thư vú tại bệnh viện Đại học Y Hà Nội bằng kỹ thuật ARMS-PCR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng kỹ thuật ARMS-PCR để xác định một số đột biến gen BRCA1 ở bệnh nhân ung thư vú

vietnam medical journal n02 - MAY - 2019 Cina A. và cộng sự (2010), nhận thấy động mạch của loại mạch này trên lâm sàng. làm mờ và tĩnh mạch không được làm mờ chạy gần nhau, và đường kính của chúng nhỏ nên TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chevray P.M., (2003), "Breast reconstruction không thể phân biệt qua CLVT 64 dãy có thể bởi with superficial inferior epigastric artery flaps: A vì thể tích từng phần; chính vì vậy chụp CLVT 64 prospective comprarison with TRAM and DIEP dãy khi đo đường kính mạch có thể tính gộp cả flaps.", Plastic and Reconstructive Surgergy, 114 động mạch, tĩnh mạch [2]. (5), p. 1077-1083. 2. Cina A., Salgarello M., Barone-Adesi L., et al. Theo Chevray P. M. (2003) [1], Tachi M. [7], (2010), "Planning breast reconstruction with deep nhược điểm của vạt ĐMTVN là giải phẫu không inferior epigastric artery perforating vessels: hằng định của cuống mạch máu và mạch máu multidetector CT Angiographu versus color Doppler cũng ngắn hơn và nhỏ hơn về đường kính. US.", Radiology, 225(3), p. 979-987. Taylor và Daniel đã báo cáo rằng vạt ĐMTVN 3. Fathi M., Hatamipour E., Fathi H.R., et al. (2006), "Anatomy of the superficial inferior không có trong 35% xác, nhưng tác giả đã tìm epigastric artery flap.", MJIRI, 20(3), p. 101-106. thấy thiếu vắng động mạch trong 51% ca lâm 4. Fukaya E., Kuwatsuru R., Iimura H., et al. sàng và khách quan không phù hợp, chủ yếu bởi (2011), "Imaging of the superficial inferior epigastric vì đường kính nhỏ [8]. Arnez và cộng sự báo vascular anatomy and preoperative planning for the SIEA flap using MDCTA.", Journal of Plastic, cáo rằng vạt ĐMTVN không có trong 40% các ca Reconstructive & Aesthetic Surgery, 64, p. 63-68. và quá nhỏ trong thêm 30% các ca còn lại [1]. 5. Pellegrin A., Stocca T., Bertolotto., et al. Theo Fukaya E. (2011), vạt ĐMTVN thường (2010), "Prevalence and anatomy of the unconstant không phải là lựa chọn của phẫu thuật viên bởi superficial inferior epigastric artery (SIEA) in abdominal wall CT angiography for autologous breast vì tính không ổn định; hình thái giải phẫu khác reconstruction: single center experience in 37 cases.", nhau giữa các cá thể hoặc đôi khi đường kính European Society of Radioloogy, p. 1-28. ĐM quá nhỏ cho vi phẫu nối, tác giả thấy rằng 6. Rozen W.M., Chubb D., Grinsell D., et al. 35% trường hợp không tìm thấy ĐMTVN [3]. (2010), "The variability of the superficial inferior epigastric Artery (SIEA) and its angiosome: a clinical IV. KẾT LUẬN anatomical study.", Microsurgery, p. 386-391. 7. Tachi M., Yamada A., (2005), "Choice of flaps Tỉ lệ hiện diện ĐMTVN trên thi thể khá cao for breast reconstruction.", The Japan Society of 85% và trên cùng 1 cá thể sự hiện diện của ĐM Clinical Oncology, 10, p. 280-297. này có thể không cùng lúc ở cả 2 bên. Trên hình 8. Thoma A., Jansen L., Sprague S., (2008), "A ảnh chụp mạch máu cản quang 64 dãy thì tỉ lệ comparison of the superficial inferior epigastric artery flap and deep inferior epigastric perforator flap in xác định sự hiện diện của ĐMTVN thấp khoảng postmastectomy reconstruction: A cost-effectiveness 10%. Cần cân nhắc việc sử dụng phương pháp analysis.", Can J Plast Surg, 16(2), p. 77-84. chụp CLVT64 trong việc xác định sự hiện diện ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ARMS-PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN BRCA1 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ Lê Thị Minh Phương*, Nguyễn Thị Trang* TÓM TẮT13 thư vú và ung thư buồng trứng. Các đột biến có liên quan mật thiết với ung thư vú bao gồm 4153delA, BRCA1 là các gen ức chế khối u nằm trên các 185delAG, Cys61Gly (300T>G) và 5382insC. Mục nhiễm sắc thể 17q21 có chức năng điều hòa quá trình tiêu: Xác định tỷ lệ đột biến gen BRCA1 4153delA, tăng trưởng và và kiểm soát quá trình phân chia của 185delAG, Cys61Gly (300T>G) và 5382insC trên bệnh tế bào. Sản phẩm protein của BRCA1 tham gia vào cơ nhân ung thư vú tại bệnh viện Đại học Y Hà Nội bằng chế sửa chữa đứt gãy DNA sợi kép (DSBs) thông qua kỹ thuật ARMS-PCR. Đối tượng và phương pháp cơ chế tái tổ hợp tương đồng HR, qua đó giúp ổn định nghiên cứu: 50 bệnh nhân được chẩn đoán ung thư cấu trúc và chức năng của tế bào. Mất chức năng của vú và 50 người nữ bình thường. Sử dụng kỹ thuật các gen này khiến bệnh nhân có nguy cơ cao mắc ung SHORT-ARMS- PCR để xác định một số đột biến gen BRCA1 từ ADN tách trong máu ngoại vi. Kết quả: *Trường Đại học Y Hà Nội Tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân nghiên cứu là Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Trang 44,25± 6,58, 13 trường hợp phát hiện ung thư vú Email: trangnguyen@hmu.edu.vn trước 40 tuổi. Không phát hiện bất kì trường hợp nào Ngày nhận bài: 7.3.2019 mang đột biến gen trong đoạn khảo sát trong số 50 Ngày phản biện khoa học: 22.4.2019 bệnh nhân nhóm chứng. Trong số 50 bệnh nhân Ngày duyệt bài: 26.4.2019 nhóm bệnh, số trường hợp phát hiện đột biến 48
TẠP CHÍ Y häc viÖt nam tẬP 478 - th¸ng 5 - sè 2 - 2019 4153delA gen BRCA1 là 23 (trong đó 20 DHT chiếm thêm khoảng 14.000 phụ nữ bị mắc mới ở độ 40%, 3 ĐHT chiếm 6%); có 12 trường hợp (tương tuổi 40-60, tuy nhiên, những năm gần đây bệnh ứng 24%) có đột biến 185delAG loại DHT, không có xuất hiện cả ở phụ nữ còn trẻ trong độ tuổi 20- bệnh nhân nào có đột biến loại ĐHT; phát hiện 30 trường hợp mang đột biến gen BRCA1 Cys61Gly 30 với tần số tăng dần. (300T>G), trong đó 25 trường hợp mang kiểu gen Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra mối DHT (40%), 5 trường hợp mang kiểu gen ĐHT (chiếm liên quan giữa các đột biến gen BRCA1 với ung 6%); có 24 trường hợp có đột biến 5382insC, gồm 23 thư vú và ung thư buồng trứng. Nó tham gia vào bệnh nhân mang kiểu gen DHT (46%) và 1 bệnh nhân quá trình sửa chữa DNA, qua đó ổn định cấu trúc mang kiểu gen ĐHT (2%). Kết luận: Xác định được một số đột biến gen BRCA1 thường gặp ở bệnh nhân và điều hòa hoạt động của tế bào. Do đó, tầm nữ ung thư vú nguy cơ cao tại Việt Nam. soát và điều trị ung thư cần phải kết hợp chẩn Từ khóa: Ung thư vú, SHORT-ARMS-PCR, BRCA1, đoán dựa trên lâm sàng và đột biến gen. BRCA1 4153delA, BRCA1 185delAG, BRCA1 Cys61Gly Protein do các gen BRCA sản xuất là thành (300T>G), BRCA1 5382insC phân cơ bản của cơ chế sửa chữa DNA chuỗi kép SUMMARY (DSBs) của tế bào theo con đường HR. Khác với con đường NHEJ, con đường HR có ưu thế hơn DETERMINATION OF SOME BRCA1 GENE hẳn về tính ổn định và chính xác khi sử dụng MUTATIONS IN PATIENTS WITH BREAST chuỗi chromatid chị em làm khuôn mẫu để sửa CANCER USING ARMS-PCR TECHNOLOGY chữa. BRCA có vai trò rộng và xuất hiện trong Background: BRCA1 are tumor suppressor genes located on chromosomes 17q21 that regulate growth những giai đoạn sớm của con đường HR. Chúng and control cell division. The BRCA1 protein product tập trung những protein RAD51 đến những vị trí participates in the double strand DNA repair DNA bị tổn thương. Ở những mô bị đột biến mechanism (DSBs) through HR homologous BRCA không có khả năng này, do đó tế bào phải recombination mechanism, thereby stabilizing the huy động con đường khác kém chính xác và hiệu structure and function of the cell. The loss of function quả hơn để sửa chữa DNA bị tổn thương, từ đó of these genes puts patients at high risk of breast and ovarian cancer. Mutations that are closely related to có thể phát sinh ung thư. Mục đích nghiên cứu: breast cancer include 4153delA, 185delAG, Cys61Gly Xác định tỷ lệ đột biến gen BRCA1 4153delA, (300T>G) and 5382insC. Material and method: 50 185delAG, Cys61Gly (300T>G) và 5382insC trên patients were diagnosed with breast cancer. Using bệnh nhân ung thư vú tại bệnh viện Đại học Y SHORT-ARMS-PCR technique to identify BRCA1 Hà Nội bằng kỹ thuật ARMS-PCR. genotype from isolated DNA in peripheral blood. Results: The average age of the study group was II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44,25 ± 6,58, 13 cases of breast cancer were found before 40 years of age. Not detected any cases of 2.1. Đối tượng nghiên cứu mutations in the survey period in the control group. Of Nhóm bệnh: 50 bệnh nhân được chẩn đoán the 50 patients who participated in the study, the ung thư vú đang điều trị tại bệnh viện Đại học Y number of cases of detection of mutation 4153delA Hà Nộiđồng ý tham gia nghiên cứu,có một hoặc BRCA1 gene was 23 (of which 20 heterozygous nhiều yếu tố nguy cơ sau: mutation accounted for 40%, 3 homozygous mutation - Được chẩn đoán ung thư vú trước 50 tuổi accounted for 6%); There are 12 cases (corresponding to 24%) with the mutation 185delAG - Tiền sử gia đình có: người bị ung thư vú hai type of heterozygous, none of the patients had a bên; cả ung thư vú và ung thư buồng trứng ở một mutation of type of homozygous mutation; 30 cases of hay nhiều người trong gia đình; nhiều bệnh ung BRCA1 Cys61Gly (300T>G) gene mutation were thư vú trong gia đình; ung thư vú ở nam giới. detected, of which 25 cases had heterozygous Nhóm chứng: 50 phụ nữ bình thường không mutation genotype (40%), 5 cases of homozygous mắc bất kì bệnh ung thư nào. mutation genotype (6%); There were 24 cases with mutations 5382insC, including 23 patients with Các bệnh nhân này được xét nghiệm xác định genotypic heterozygous mutation (46%) and 1 patient đột biến gen BRCA1 tại Trung tâm Tư vấn Di with the genotype of homozygous mutation (2%). truyền - Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Keywords: Breast cancer, SHORT-ARMS-PCR, Thời gian: Từ tháng 2 - 2018 đến tháng 2 - 2019. BRCA1, BRCA1 4153delA, BRCA1 185delAG, BRCA1 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm tư vấn di Cys61Gly (300T>G), BRCA1 5382insC truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cỡ mẫu nghiên cứu: Công thức tính cỡ mẫu Ung thư vú là loại ung thư thường gặp nhất cho một nghiên cứu mô tả tính theo công thức và là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở phụ nữ bị của S.K.Luanga và Lemeshow: ung thư. Ở Việt Nam, tần suất ung thư vú là 12,2/100.000 người tại thành phố Hồ Chí Minh và 26,7/100.000 người tại Hà Nội. Mỗi năm có 49
vietnam medical journal n02 - MAY - 2019 Trong đó: 1- α/2 = 0,95; ε = 0,10; p = 95% 2.2.1. Tách chiết AND: ADN được tách chiết (độ chính xác của quy trình tham chiếu). n = số từ máu ngoại vi bằng kit tách ADN Express của lần thực nghiệm cần thực hiện, tính được bằng hãng Lytech (Nga). Khuyếch đại đoạn gen cần 21, chúng tôi lấy cỡ mẫu là 50 cho nhóm bệnh nghiên cứu bằng kỹ thuật SHORT- ARMS - PCR để và 50 cho nhóm chứng. xác định các đột biến gen 4153delA, 185delAG, 2.2. Phương pháp nghiên cứu Cys61Gly (300T>G) và 5382insC gen BRCA1. Phương pháp mô tả cắt ngang có đối chứng Trình tự mồi của phản ứng được như sau: Bảng 2.1: Trình tự mồi Mồi Trình tự mồi BRCA1 4153delA: Mồi xuôi chung 5′-GACTGCAAATACAAACACCCA-3 Mồi allen thường 5′-AGCCCGTTCCTCTTTCTTC-3′ Mồi allen đột biến 5′-AGCCCGTTCCTCTTTCTCA-3′ BRCA1 185delAG: Mồi xuôi chung 5′-CAGTTAAGGAAATCAGCAATTACAATAGC-3′ Mồi allen thường 5′-GCTATGCAGAAAATCTTAGAGTGTCC-3′ Mồi allen đột biến 5′-ATGCTATGCAGAAAATCTTAGTGTCC-3′ BRCA1 Cys61Gly (300T>G): Mồi xuôi chung 5′-ATTATCTTTTCATGGCTATTTG-3′ Mồi allen thường 5′-TATATCATTCTTACATAAAGGAA-3′ Mồi allen đột biến 5′-TATATCATTCTTACATAAAGGAC-3′ BRCA1 5382insC: Mồi xuôi chung 5′-AGAACCTGTGTGAAAGTATCTAGCACTG-3′ Mồi allen thường 5′-AAGCGAGCAAGAGAATTCCAG-3′ Mồi allen đột biến 5′-AGCGAGCAAGAGAATTCCCA-3′ Xác định trình tự đoạn gen bằng kỹ thuật Cao nhất 502 1,94 điện di trên gel 1,5%có nhuộm ethidium bromide Trung bình 320,29±128,03 1,87±0,04 và quan sát dưới màn soi gel. Kết quả được xác Nhận xét: Lượng ADN thu được từ các mẫu định như sau: tương đối cao và ổn định với nồng độ cao nhất đạt 502 ng/µl, thấp nhất đạt 131ng/µl; độ tinh sạch cao nhất là 1,94 thấp nhất là 1,81. Tách chiết ADN là bước đầu tiên quan trọng nhất trong hầu hết các phản ứng sinh học phân tử. Quá trình tách ADN phải đạt được nồng độ và độ tinh sạch đạt tiêu chuẩn mới đảm bảo các phản ứng tiếp theo xảy ra thuận lợi và đảm bảo chính xác. Trong nghiên cứu này sử dụng bộ kit ADN-express của hãng Lytech (Nga), tất cả các Chú thích: ĐHT ĐB: đồng hợp tử đột biến; mẫu đều đạt được độ tinh sạch và nồng độ trong DHT: dị hợp tử; ĐHT BT: đồng hợp tử bình thường giới hạn cho phép (1,8 - 2,0). Một ưu điểm nữa 2.3. Đạo đức nghiên cứu: Bệnh nhân được của kit tách ADN- express là đơn giản, dễ thực giải thích về quyền lợi khi tham gia nghiên cứu hiện, cho sản phẩm nhanh chóng. Do đó có thể và xác nhận đồng ý tham gia nghiên cứu. Thông ứng dụng trong một số phản ứng nhất định. tin của bệnh nhân được bảo mật tuyệt đối và chỉ 3.2. Đặc điểm tuổi của nhóm bệnh nhân phục vụ công tác nghiên cứu, không vì bất kì nghiên cứu: Tuổi trung bình của nhóm bệnh mục đích nào khác. nhân nghiên cứu là 44,25± 6,58, bệnh nhân ít tuổi III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN nhất là 32 tuổi, nhiều tuổi nhất là 56 tuổi. Trong 50 3.1. Kết quả tách chiết AND: 100 mẫu bệnh nhân nghiên cứu, có 13 trường hợp phát hiện nghiên cứu được tách ADN bằng phương pháp ung thư vú trước 40 tuổi (chiếm 26%). ADN-express (Lytech, Nga). Sử dụng hệ thống Độ tuổi phổ biến phát hiện ung thư vú ở Việt Nanodrops của hãng Thermo Scientific (Mỹ) xác Nam từ 45 – 55 tuổi [1]. Trong nghiên cứu này, định độ tinh sạch của mẫu thu được kết quả sau tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân là thấp hơn Bảng 3.1. Độ tinh sạch ADN khi sử dụng (44,25 tuổi), và có 13 trường hợp (26%) phát bộ kitADN-express hiện ung thư vú ở độ tuổi trước 40 cho thấy có Nồng độ Nồng độ ADN Độ tinh sự khác biệt đáng kể về tuổi giữa hai nhóm có ADN Ng/µl sạch và không có tiền sử gia đình, cụ thể nhóm ung Thấp nhất 131 1,81 thư vú có tính chất gia đình phát hiện bệnh ở 50
TẠP CHÍ Y häc viÖt nam tẬP 478 - th¸ng 5 - sè 2 - 2019 tuổi sớm hơn hẳn nhóm bệnh nhân không có soát và điều trị sớm cho những nhóm bệnh nhân tiền sử gia đình. Điều này là tương tự với nghiên có yếu tố nguy cơ cao. cứu của Marwa H Saied và cộng sự (2017) [2]. 3.3. Tỷ lệ đột biến gen BRCA1 Do đó cần có chiến lược truyền thông để tầm ➢ Đột biến BRCA1 4153delA Bảng 3.2: Tần số đột biến gen BRCA1 4153delA và phân phối các alen ở nhóm bệnh và nhóm chứng Kiểu gen Nhóm chứng n = 50 Nhóm bệnh n = 50 OR 95% Cl p WW 50 (100) 27 (54) 0,01 0,00 - 0,20
vietnam medical journal n02 - MAY - 2019 (p