intTypePromotion=1

Ứng dụng kỹ thuật Flow Cytometry khảo sát tần suất xuất hiện kháng thể đồng loài kháng hồng cầu ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

0
24
lượt xem
2
download

Ứng dụng kỹ thuật Flow Cytometry khảo sát tần suất xuất hiện kháng thể đồng loài kháng hồng cầu ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ứng dụng kỹ thuật flow cytometry khảo sát tần suất xuất hiện kháng thể đồng loài kháng hồng cầu ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng kỹ thuật Flow Cytometry khảo sát tần suất xuất hiện kháng thể đồng loài kháng hồng cầu ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013<br /> <br /> ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FLOW CYTOMETRY KHẢO SÁT<br /> TẦN SUẤT XUẤT HIỆN KHÁNG THỂ ĐỒNG LOÀI KHÁNG<br /> HỒNG CẦU Ở BỆNH NHÂN TRUYỀN MÁU NHIỀU LẦN<br /> TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƢƠNG<br /> Lê Xuân Hải* và CS<br /> TÓM TẮT<br /> Lần đầu tiên ở Việt Nam chúng tôi đã ứng dụng thành công kỹ thuật phân tích Flow Cytometry<br /> đơn màu để phát hiện kháng thể bất thường kháng hồng cầu. Khảo sát 261 bệnh nhân (BN) được<br /> truyền máu nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, chúng tôi thấy tỷ lệ bắt gặp<br /> kháng thể đồng loại kháng hồng cầu là 42.15%. 100% BN được truyền máu trên 10 lần có kháng thể<br /> bất thường kháng hồng cầu. Tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loài chống hồng cầu ở BN nữ cao hơn<br /> nhiều so với BN nam và tỷ lệ thuận với tuổi và số lần nhận máu.<br /> * Từ khóa: Kỹ thuật Flow Cytometry; Kháng thể đồng loài; Truyền máu nhiều lần.<br /> <br /> APPLYING FLOW CYTOMETRY TO STUDY FREQUENCY OF<br /> APPEARANCE OF ALLOANTIBODY AGAINST RED BLOOD IN<br /> MULTIPLY TRANSFUSION PATIENTS AT NATIONAL INSTITUTE<br /> OF HEMATOLOGY AND BLOOD TRANSFUSION<br /> Summary<br /> It is the first time in Vietnam, an analysis technique based on flow cytometry has been applied<br /> successfully in dectecting alloantibodies against red blood cell in multiple transfusion patients. Study<br /> on 261 patients with multiple transfusions, we discovered that 42.15% of the objects had developed<br /> alloantibodies. Alloantibodies were detected in 100% of patients who have received transfusion more<br /> than 10 times. The incidence of alloantibodies detected in women patients was higher than that in<br /> men and closely related with age and times of transfusion.<br /> * Key words: Flow Cytometry technique; Alloantibodies; Multiple transfusions.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Máu rất quan trọng và cần thiết cho sự<br /> sống, nhờ có truyền máu nhiều người bệnh<br /> đã được cứu sống, nhưng truyền máu cũng<br /> <br /> có thể gây ra tai biến nghiêm trọng nếu không<br /> tuân thủ nguyên tắc về an toàn truyền<br /> máu. Phát hiện nhóm máu hệ ABO, Rh và<br /> các hệ nhóm máu hồng cầu khác đã giúp<br /> việc truyền máu hiệu quả và an toàn hơn.<br /> <br /> * Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương<br /> Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: TS. Nguyễn Đặng Dũng<br /> TS. Phạm Văn Trân<br /> <br /> 19<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013<br /> Tại các nước tiên tiến, an toàn truyền máu<br /> được thực hiện một cách triệt để hòa hợp<br /> về nhóm máu hệ ABO, Rh và một số nhóm<br /> máu khác phải thực hiện sàng lọc kháng<br /> thể bất thường. Tại Việt Nam, thực hiện an<br /> toàn truyền máu về miễn dịch còn hạn chế.<br /> Chúng ta mới chỉ định nhóm máu hệ ABO,<br /> làm phản ứng chéo ở điều kiện nhiệt độ<br /> phòng thí nghiệm mà chưa có điều kiện<br /> quan tâm nghiên cứu tới các nhóm máu<br /> khác ngoài ABO. Do vậy, ở BN được truyền<br /> máu nhiều lần việc sinh kháng thể bất<br /> thường là khó tránh khỏi. Về bản chất, các<br /> kháng thể gọi là “bất thường” là các kháng<br /> thể miễn dịch đồng loài (chủ yếu là kháng<br /> thể lớp IgG) chống lại các kháng nguyên lạ<br /> có trên bề mặt hồng cầu, bạch cầu (hệ<br /> HLA) hoặc tiểu cầu (hệ HPA) của người<br /> cho. Có rất nhiều cách để phát hiện các<br /> kháng thể này với mức độ chính xác, độ<br /> nhạy khác nhau. Các kỹ thuật này cũng<br /> khác nhau về độ phức tạp. Hiện nay, phát<br /> hiện kháng thể bất thường ở người truyền<br /> máu nhiều lần mới chỉ chủ yếu tập trung<br /> vào kháng thể đồng loài kháng hồng cầu.<br /> Phương pháp truyền thống hay sử dụng là<br /> phương pháp huyết thanh học dựa trên<br /> nguyên tắc phản ứng ngưng kết Coombs<br /> gián tiếp. Phương pháp này tuy độ nhạy<br /> không cao, nhưng có ưu điểm là đơn giản,<br /> giá rẻ nên dễ ứng dụng triển khai trên<br /> diện rộng. Ngày nay, với sự phổ biến của<br /> phương pháp flow cytometry dựa trên<br /> nguyên lý phân tích tự động phản ứng đặc<br /> hiệu kháng nguyên-kháng thể có đánh dấu<br /> huỳnh quang, các nghiên cứu phát hiện<br /> kháng thể bất thường có thể thực hiện với<br /> độ nhạy cao hơn các phương pháp truyền<br /> thống. Flow cytometry được ứng dụng trong<br /> xác định các kháng thể đồng loài kháng<br /> HLA [3], tiểu cầu [4] và hồng cầu [5, 6]. Việc<br /> phát hiện kháng thể bất thường ở BN được<br /> truyền máu nhiều lần rất cần thiết để đảm<br /> bảo an toàn truyền máu về mặt miễn dịch,<br /> <br /> qua đó, có thể chọn đơn vị máu phù hợp,<br /> nhằm nâng cao hiệu quả của những lần<br /> truyền máu. Trong nghiên cứu này, chúng<br /> tôi ứng dụng kỹ thuật Flow Cytometry để:<br /> Phát hiện tỷ lệ mang kháng thể miễn dịch<br /> đồng loài kháng hồng cầu ở BN được<br /> truyền máu nhiều lần (≥ 2 lần).<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 261 BN được truyền máu nhiều lần tại<br /> Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương,<br /> trong đó, 175 BN được chẩn đoán thalassaemia,<br /> 49 BN suy tủy xương, 37 BN xuất huyết giảm<br /> tiểu cầu. Các BN này thỏa mãn những tiêu<br /> chuẩn sau:<br /> - Được chẩn đoán là thalassaemia, suy<br /> tủy xương hoặc xuất huyết giảm tiểu cầu<br /> theo tiêu chuẩn chẩn đoán của Viện Huyết<br /> học - Truyền máu Trung ương.<br /> - Truyền máu nhiều lần (≥ 2 lần).<br /> - Lấy mẫu máu cho nghiên cứu sau lần<br /> truyền máu cuối cùng tối thiểu 2 tuần.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Thiết kế nghiên cứu: lấy mẫu thuận tiện,<br /> nghiên cứu mô tả cắt ngang.<br /> * Chuẩn bị bệnh phẩm: Lấy 4 ml máu<br /> ngoại vi vào ống không chống đông, ly tâm<br /> tách huyết thanh và lưu trữ ở -600C cho tới<br /> khi làm thí nghiệm sàng lọc kháng thể đồng<br /> loài kháng hồng cầu bằng phương pháp<br /> Flow Cytometry.<br /> * Chuẩn bị hồng cầu nhóm O: lấy ngẫu<br /> nhiên 20 mẫu hồng cầu nhóm O (mỗi mẫu 2<br /> ml) từ người cho máu tính nguyện. Ly tâm<br /> lấy khối hồng cầu, từ mỗi khối hồng cầu O<br /> pha thành huyền dịch hồng cầu 1%, trộn<br /> pool 20 mẫu hồng cầu O thành huyền dịch<br /> “pool 1% O”. Với cách chuẩn bị huyền dịch<br /> hồng cầu như vậy, mỗi mẫu hồng cầu O<br /> ban đầu sẽ đại diện cho 5% trong “pool 1% O”.<br /> <br /> 21<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013<br /> Do vậy, chúng tôi lấy ngưỡng dương tính là<br /> 5% trên Flow Cytometry [6].<br /> * Phân tích phát hiện kháng thể kháng<br /> hồng cầu bằng Flow Cytometry: theo phương<br /> pháp được Won mô tả [6]; ủ 100 ul huyền<br /> dịch hồng cầu “pool 1% O” với 200 ul huyết<br /> thanh BN trong 45 phút ở 370C. Rửa 2 lần<br /> bằng PBS, tái tạo huyền dịch cặn tế bào<br /> trong 100 ul PBS. Tiếp tục ủ với 5 ul antihuman IgG-FITC (Beckman Coulter, Mỹ)<br /> <br /> trong 20 phút, tránh ánh sáng. Thêm 1 ml<br /> PBS, phân tích bằng chương trình “kháng<br /> thể kháng hồng cầu” lập sẵn trong phần<br /> mềm CXP 2.0 ở máy Cytomics FC500. Lấy<br /> ngưỡng âm tính là mẫu huyền dịch hồng<br /> cầu ủ với anti mouse IgG-FITC.<br /> * Xử lý số liệu: bằng phương pháp thống<br /> kê y học sử dụng thuật toán 2 test (Chi<br /> test).<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Chƣơng trình và kết quả phân tích.<br /> Dùng phần mềm CXP cytometer 2.2 có sẵn trên máy Cytomics FC500, lập chương trình<br /> phân tích kháng thể bất thường trên hồng cầu với các bước phân tích sau:<br /> - Thiết lập đồ hình thông số FS line Vs SS line, chọn khoanh vùng đại diện nhất của<br /> hồng cầu là vùng E (hình 1A).<br /> - Thiết lập chế độ phân tích đơn màu cho kháng thể anti-human IgG-FITC theo kênh<br /> huỳnh quang -FL1 log và xác lập điện thế để chỉnh ngưỡng cut off về mức 100 (hình 1B).<br /> Với mức POS ≥ 5% được coi là mẫu dương tính [6].<br /> <br /> Hình 1: Minh họa một trường hợp dương tính với kháng thể miễn dịch đồng loài kháng<br /> hồng cầu ở BN truyền máu > 10 lần.<br /> (A) Khoanh vùng phân tích ở vùng quần thể hồng cầu đại diện (vùng E). (B) Phân tích<br /> trên vùng E thấy 77,4% quần thể có biểu hiện dương tính với anti-human IgG-FITC,<br /> chứng tỏ có tồn tại kháng thể miễn dịch đồng lớp IgG bám trên bề mặt hồng cầu, nói cách<br /> khác mẫu huyết thanh của BN có kháng thể “bất thường” kháng hồng cầu thử.<br /> <br /> 22<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013<br /> Chúng tôi đã thiết lập được chương trình<br /> phân tích và sử dụng chương trình này<br /> phân tích các mẫu huyết thanh BN đã được<br /> lưu trữ. Trong 261 mẫu phân tích, mẫu phát<br /> hiện dương tính thấp nhất thu được là 5,2%<br /> và mẫu phát hiện dương tính cao nhất thu<br /> được là 97,8%.<br /> 2. Đặc điểm kháng thể đồng loài lớp<br /> IgG kháng hồng cầu ở BN truyền máu<br /> nhiều lần.<br /> * Tỷ lệ kháng thể đồng loài kháng hồng<br /> cầu (%) ở BN truyền máu nhiều lần:<br /> Số mẫu nghiên cứu: 261; số mẫu dương<br /> tính: 110. Kết quả nghiên cứu của chúng<br /> tôi (42,15%) cao hơn nhiều so với của<br /> Nguyễn Thị Thanh Mai (2005: 27,4%) [2] và<br /> Bùi Mai An (2006: 9,8%) [1]. Điều này là<br /> do chúng tôi sử dụng phương pháp Flow<br /> Cytometry để phát hiện kháng thể đồng loài<br /> có mặt, trong khi các tác giả khác dùng<br /> phương pháp ngưng kết thông qua phản<br /> ứng Coomb gián tiếp. Flow Cytometry là<br /> phương pháp phân tích lượng lớn cho kết<br /> quả chính xác, có độ nhạy cao hơn rất<br /> nhiều so với phản ứng Coomb gián tiếp,<br /> chính vì vậy Fow Cytometry có thể phát<br /> hiện được kháng thể ở cả những trường<br /> hợp không phát hiện được bằng phương<br /> pháp huyết thanh học thông thường [3, 4].<br /> 3. Tỷ lệ kháng thể đồng loài liên quan<br /> đến tuổi, giới, chẩn đoán lâm sàng và số<br /> lần truyền máu.<br /> Bảng 1: Tỷ lệ gặp kháng thể đồng loài<br /> kháng hồng cầu (%) ở BN truyền máu nhiều<br /> lần theo chẩn đoán lâm sàng.<br /> ĐỐI TƯỢNG<br /> <br /> SỐ MẪU CÓ<br /> SỐ MẪU<br /> TỶ LỆ<br /> KHÁNG THỂ<br /> NGHIÊN<br /> (%)<br /> ĐỒNG LOẠI<br /> CỨU<br /> KHÁNG HỒNG CẦU<br /> <br /> (1)<br /> <br /> (2)<br /> <br /> (3)<br /> <br /> (4)<br /> <br /> Xuất huyết<br /> giảm tiểu cầu<br /> <br /> 37<br /> <br /> 15<br /> <br /> 40,54<br /> <br /> Cộng chung<br /> <br /> 261<br /> <br /> 110<br /> <br /> 42,15<br /> <br /> Chi test: p 0,454<br /> <br /> Nhóm bệnh thalassemia có tỷ lệ bắt gặp<br /> cao nhất (44,57%), sau đó là nhóm xuất<br /> huyết giảm tiểu cầu (40,54%). Nhóm suy<br /> tủy xương có tỷ lệ bắt gặp thấp nhất<br /> (34,69%). Sở dĩ tỷ lệ này thấp do trong suy<br /> tủy xương, các tế bào dòng lympho cũng<br /> giảm nên khả năng đáp ứng miễn dịch tiết<br /> kháng thể cũng giảm.<br /> Bảng 2: Một số yếu tố liên quan đến tỷ lệ<br /> xuất hiện kháng thể đồng loại kháng hồng<br /> cầu ở BN thalassaemia.<br /> GIỚI<br /> <br /> SỐ MẪU<br /> NGHIÊN<br /> CỨU<br /> <br /> SỐ MẪU CÓ KHÁNG<br /> THỂ ĐỒNG LOẠI<br /> KHÁNG HỒNG CẦU<br /> <br /> TỶ LỆ<br /> (%)<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 135<br /> <br /> 49<br /> <br /> 36,30<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 126<br /> <br /> 61<br /> <br /> 48,41<br /> <br /> Cộng chung<br /> <br /> 261<br /> <br /> 110<br /> <br /> 42,15<br /> <br /> Chi test: p = 0,047<br /> <br /> Tỷ lệ gặp kháng thể đồng loài kháng<br /> hồng cầu lớp IgG ở nữ cao hơn ở nam có ý<br /> nghĩa thống kê (p < 0,05) khi so sánh bằng<br /> thuật toán 2, phù hợp với nhận xét của<br /> Bùi Mai An [1], Nguyễn Thị Thanh Mai [2]<br /> khi nghiên cứu về kháng thể bất thường<br /> kháng hồng cầu ở BN truyền máu nhiều<br /> lần. Sở dĩ có sự chênh lệch như vậy là do ở<br /> nữ, ngoài yếu tố truyền máu, kháng thể<br /> <br /> Thalassaemia<br /> <br /> 175<br /> <br /> 78<br /> <br /> 44,57<br /> <br /> kháng đồng loài kháng hồng cầu lớp IgG<br /> <br /> Suy tủy xương<br /> <br /> 49<br /> <br /> 17<br /> <br /> 34,69<br /> <br /> xuất hiện do quá trình chửa đẻ.<br /> <br /> 23<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013<br /> Bảng 3: Tỷ lệ xuất hiện kháng thể đồng<br /> loại kháng hồng cầu liên quan đến tuổi.<br /> NHÓM TUỔI<br /> <br /> SỐ MẪU<br /> NGHIÊN<br /> CỨU<br /> <br /> SỐ MẪU CÓ KHÁNG<br /> THỂ ĐỒNG LOẠI<br /> KHÁNG HỒNG CẦU<br /> <br /> TỶ LỆ<br /> (%)<br /> <br /> 10 - 20<br /> <br /> 29<br /> <br /> 9<br /> <br /> 31,03<br /> <br /> 21 - 40<br /> <br /> 98<br /> <br /> 30<br /> <br /> 34,69<br /> <br /> 41 - 60<br /> <br /> 73<br /> <br /> 34<br /> <br /> 41,10<br /> <br /> > 60<br /> <br /> 61<br /> <br /> 367<br /> <br /> 60,66<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 261<br /> <br /> 110<br /> <br /> 42,15<br /> <br /> thường ở những BN truyền máu từ 5 - 10<br /> lần là 70%, trong khi đó ở các BN mới được<br /> truyền máu 2 lần là 11,34%. Tỷ lệ bắt gặp<br /> kháng thể bất thường tăng lên theo số lần<br /> truyền máu, khác biệt có ý nghĩa thống kê<br /> (p < 0,001) bằng Chi test.<br /> KẾT LUẬN<br /> Với phần mềm CXP Cytometer 2.2, chúng<br /> tôi đã thiết lập được chương trình phân tích<br /> <br /> Chi test: p = 0,006<br /> <br /> trên máy Flow Cytometry Cytomics FC500<br /> để phát hiện kháng thể đồng loại lớp IgG<br /> <br /> Nhóm BN > 60 tuổi, tỷ lệ kháng thể đồng<br /> loài kháng hồng cầu cao nhất (66,66%),<br /> sau đó đến nhóm 41 - 60 tuổi (41,10%).<br /> Ở nhóm tuổi 10 - 20 và 21 - 41, tỷ lệ bắt<br /> gặp kháng thể bất thường tương ứng là<br /> 31,03% và 34,69%. Nhận xét này phù hợp<br /> với kết quả của Bùi Thị Mai An [1]. Sự khác<br /> biệt về tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loại<br /> kháng hồng cầu giữa các nhóm tuổi là rõ<br /> rệt, có ý nghĩa thống kê, với p < 0,05 khi so<br /> sánh bằng thuật toán Chi test.<br /> <br /> kháng hồng cầu trong huyết thanh BN được<br /> <br /> Bảng 4: Tỷ lệ xuất hiện kháng thể đồng<br /> loại kháng hồng cầu liên quan đến số lần<br /> truyền máu.<br /> <br /> 42,15%.<br /> <br /> truyền máu nhiều lần.<br /> Qua sàng lọc kháng thể kháng hồng cầu<br /> trong huyết thanh của 261 BN truyền máu<br /> nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu<br /> Trung ương chúng tôi thấy:<br /> - Tỷ lệ phát hiện kháng thể đồng loài lớp<br /> IgG kháng hồng cầu bằng kỹ thuật Flow<br /> Cytometry ở BN truyền máu nhiều lần là<br /> - Tỷ lệ bắt gặp kháng thể rất cao ở nhóm<br /> được truyền máu > 5 lần (70% ở nhóm<br /> truyền máu 5 - 10 lần), 100% ở nhóm được<br /> <br /> SỐ LẦN<br /> NHẬN MÁU<br /> <br /> SỐ MẪU<br /> NGHIÊN<br /> CỨU<br /> <br /> SỐ MẪU CÓ KHÁNG<br /> THỂ ĐỒNG LOẠI<br /> KHÁNG HỒNG CẦU<br /> <br /> TỶ LỆ<br /> (%)<br /> <br /> 2 lần<br /> <br /> 95<br /> <br /> 17<br /> <br /> 11,34<br /> <br /> - Tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loại<br /> <br /> 3 - 5 lần<br /> <br /> 107<br /> <br /> 46<br /> <br /> 42,99<br /> <br /> chống hồng cầu ở BN truyền máu nhiều lần<br /> <br /> 5 - 10 lần<br /> <br /> 40<br /> <br /> 28<br /> <br /> 70,00<br /> <br /> ở nữ cao hơn ở nam và tỷ lệ thuận với tuổi<br /> <br /> > 10 lần<br /> <br /> 19<br /> <br /> 19<br /> <br /> 100,00<br /> <br /> Céng chung<br /> <br /> 261<br /> <br /> 110<br /> <br /> 42,15<br /> <br /> Chi test: p = (2,479)-13<br /> <br /> truyền máu > 10 lần.<br /> <br /> và số lần nhận máu.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Bùi Thị Mai An, Bạch Quốc Khánh, Hoàng<br /> <br /> 100% BN truyền máu > 10 lần có kháng<br /> <br /> Thị Thanh Nga, Hoàng Nhật Lệ và CS. Nghiên<br /> <br /> thể bất thường. Tỷ lệ bắt gặp kháng thể bất<br /> <br /> cứu sàng lọc kháng thể bất thường hệ hồng cầu<br /> <br /> 24<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản