Ứng dụng kỹ thuật Flow Cytometry khảo sát tần suất xuất hiện kháng thể đồng loài kháng hồng cầu ở bệnh nhân truyền máu nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013<br /> <br /> ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FLOW CYTOMETRY KHẢO SÁT<br /> TẦN SUẤT XUẤT HIỆN KHÁNG THỂ ĐỒNG LOÀI KHÁNG<br /> HỒNG CẦU Ở BỆNH NHÂN TRUYỀN MÁU NHIỀU LẦN<br /> TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƢƠNG<br /> Lê Xuân Hải* và CS<br /> TÓM TẮT<br /> Lần đầu tiên ở Việt Nam chúng tôi đã ứng dụng thành công kỹ thuật phân tích Flow Cytometry<br /> đơn màu để phát hiện kháng thể bất thường kháng hồng cầu. Khảo sát 261 bệnh nhân (BN) được<br /> truyền máu nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, chúng tôi thấy tỷ lệ bắt gặp<br /> kháng thể đồng loại kháng hồng cầu là 42.15%. 100% BN được truyền máu trên 10 lần có kháng thể<br /> bất thường kháng hồng cầu. Tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loài chống hồng cầu ở BN nữ cao hơn<br /> nhiều so với BN nam và tỷ lệ thuận với tuổi và số lần nhận máu.<br /> * Từ khóa: Kỹ thuật Flow Cytometry; Kháng thể đồng loài; Truyền máu nhiều lần.<br /> <br /> APPLYING FLOW CYTOMETRY TO STUDY FREQUENCY OF<br /> APPEARANCE OF ALLOANTIBODY AGAINST RED BLOOD IN<br /> MULTIPLY TRANSFUSION PATIENTS AT NATIONAL INSTITUTE<br /> OF HEMATOLOGY AND BLOOD TRANSFUSION<br /> Summary<br /> It is the first time in Vietnam, an analysis technique based on flow cytometry has been applied<br /> successfully in dectecting alloantibodies against red blood cell in multiple transfusion patients. Study<br /> on 261 patients with multiple transfusions, we discovered that 42.15% of the objects had developed<br /> alloantibodies. Alloantibodies were detected in 100% of patients who have received transfusion more<br /> than 10 times. The incidence of alloantibodies detected in women patients was higher than that in<br /> men and closely related with age and times of transfusion.<br /> * Key words: Flow Cytometry technique; Alloantibodies; Multiple transfusions.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Máu rất quan trọng và cần thiết cho sự<br /> sống, nhờ có truyền máu nhiều người bệnh<br /> đã được cứu sống, nhưng truyền máu cũng<br /> <br /> có thể gây ra tai biến nghiêm trọng nếu không<br /> tuân thủ nguyên tắc về an toàn truyền<br /> máu. Phát hiện nhóm máu hệ ABO, Rh và<br /> các hệ nhóm máu hồng cầu khác đã giúp<br /> việc truyền máu hiệu quả và an toàn hơn.<br /> <br /> * Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương<br /> Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: TS. Nguyễn Đặng Dũng<br /> TS. Phạm Văn Trân<br /> <br /> 19<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013<br /> Tại các nước tiên tiến, an toàn truyền máu<br /> được thực hiện một cách triệt để hòa hợp<br /> về nhóm máu hệ ABO, Rh và một số nhóm<br /> máu khác phải thực hiện sàng lọc kháng<br /> thể bất thường. Tại Việt Nam, thực hiện an<br /> toàn truyền máu về miễn dịch còn hạn chế.<br /> Chúng ta mới chỉ định nhóm máu hệ ABO,<br /> làm phản ứng chéo ở điều kiện nhiệt độ<br /> phòng thí nghiệm mà chưa có điều kiện<br /> quan tâm nghiên cứu tới các nhóm máu<br /> khác ngoài ABO. Do vậy, ở BN được truyền<br /> máu nhiều lần việc sinh kháng thể bất<br /> thường là khó tránh khỏi. Về bản chất, các<br /> kháng thể gọi là “bất thường” là các kháng<br /> thể miễn dịch đồng loài (chủ yếu là kháng<br /> thể lớp IgG) chống lại các kháng nguyên lạ<br /> có trên bề mặt hồng cầu, bạch cầu (hệ<br /> HLA) hoặc tiểu cầu (hệ HPA) của người<br /> cho. Có rất nhiều cách để phát hiện các<br /> kháng thể này với mức độ chính xác, độ<br /> nhạy khác nhau. Các kỹ thuật này cũng<br /> khác nhau về độ phức tạp. Hiện nay, phát<br /> hiện kháng thể bất thường ở người truyền<br /> máu nhiều lần mới chỉ chủ yếu tập trung<br /> vào kháng thể đồng loài kháng hồng cầu.<br /> Phương pháp truyền thống hay sử dụng là<br /> phương pháp huyết thanh học dựa trên<br /> nguyên tắc phản ứng ngưng kết Coombs<br /> gián tiếp. Phương pháp này tuy độ nhạy<br /> không cao, nhưng có ưu điểm là đơn giản,<br /> giá rẻ nên dễ ứng dụng triển khai trên<br /> diện rộng. Ngày nay, với sự phổ biến của<br /> phương pháp flow cytometry dựa trên<br /> nguyên lý phân tích tự động phản ứng đặc<br /> hiệu kháng nguyên-kháng thể có đánh dấu<br /> huỳnh quang, các nghiên cứu phát hiện<br /> kháng thể bất thường có thể thực hiện với<br /> độ nhạy cao hơn các phương pháp truyền<br /> thống. Flow cytometry được ứng dụng trong<br /> xác định các kháng thể đồng loài kháng<br /> HLA [3], tiểu cầu [4] và hồng cầu [5, 6]. Việc<br /> phát hiện kháng thể bất thường ở BN được<br /> truyền máu nhiều lần rất cần thiết để đảm<br /> bảo an toàn truyền máu về mặt miễn dịch,<br /> <br /> qua đó, có thể chọn đơn vị máu phù hợp,<br /> nhằm nâng cao hiệu quả của những lần<br /> truyền máu. Trong nghiên cứu này, chúng<br /> tôi ứng dụng kỹ thuật Flow Cytometry để:<br /> Phát hiện tỷ lệ mang kháng thể miễn dịch<br /> đồng loài kháng hồng cầu ở BN được<br /> truyền máu nhiều lần (≥ 2 lần).<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> 261 BN được truyền máu nhiều lần tại<br /> Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương,<br /> trong đó, 175 BN được chẩn đoán thalassaemia,<br /> 49 BN suy tủy xương, 37 BN xuất huyết giảm<br /> tiểu cầu. Các BN này thỏa mãn những tiêu<br /> chuẩn sau:<br /> - Được chẩn đoán là thalassaemia, suy<br /> tủy xương hoặc xuất huyết giảm tiểu cầu<br /> theo tiêu chuẩn chẩn đoán của Viện Huyết<br /> học - Truyền máu Trung ương.<br /> - Truyền máu nhiều lần (≥ 2 lần).<br /> - Lấy mẫu máu cho nghiên cứu sau lần<br /> truyền máu cuối cùng tối thiểu 2 tuần.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Thiết kế nghiên cứu: lấy mẫu thuận tiện,<br /> nghiên cứu mô tả cắt ngang.<br /> * Chuẩn bị bệnh phẩm: Lấy 4 ml máu<br /> ngoại vi vào ống không chống đông, ly tâm<br /> tách huyết thanh và lưu trữ ở -600C cho tới<br /> khi làm thí nghiệm sàng lọc kháng thể đồng<br /> loài kháng hồng cầu bằng phương pháp<br /> Flow Cytometry.<br /> * Chuẩn bị hồng cầu nhóm O: lấy ngẫu<br /> nhiên 20 mẫu hồng cầu nhóm O (mỗi mẫu 2<br /> ml) từ người cho máu tính nguyện. Ly tâm<br /> lấy khối hồng cầu, từ mỗi khối hồng cầu O<br /> pha thành huyền dịch hồng cầu 1%, trộn<br /> pool 20 mẫu hồng cầu O thành huyền dịch<br /> “pool 1% O”. Với cách chuẩn bị huyền dịch<br /> hồng cầu như vậy, mỗi mẫu hồng cầu O<br /> ban đầu sẽ đại diện cho 5% trong “pool 1% O”.<br /> <br /> 21<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013<br /> Do vậy, chúng tôi lấy ngưỡng dương tính là<br /> 5% trên Flow Cytometry [6].<br /> * Phân tích phát hiện kháng thể kháng<br /> hồng cầu bằng Flow Cytometry: theo phương<br /> pháp được Won mô tả [6]; ủ 100 ul huyền<br /> dịch hồng cầu “pool 1% O” với 200 ul huyết<br /> thanh BN trong 45 phút ở 370C. Rửa 2 lần<br /> bằng PBS, tái tạo huyền dịch cặn tế bào<br /> trong 100 ul PBS. Tiếp tục ủ với 5 ul antihuman IgG-FITC (Beckman Coulter, Mỹ)<br /> <br /> trong 20 phút, tránh ánh sáng. Thêm 1 ml<br /> PBS, phân tích bằng chương trình “kháng<br /> thể kháng hồng cầu” lập sẵn trong phần<br /> mềm CXP 2.0 ở máy Cytomics FC500. Lấy<br /> ngưỡng âm tính là mẫu huyền dịch hồng<br /> cầu ủ với anti mouse IgG-FITC.<br /> * Xử lý số liệu: bằng phương pháp thống<br /> kê y học sử dụng thuật toán 2 test (Chi<br /> test).<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Chƣơng trình và kết quả phân tích.<br /> Dùng phần mềm CXP cytometer 2.2 có sẵn trên máy Cytomics FC500, lập chương trình<br /> phân tích kháng thể bất thường trên hồng cầu với các bước phân tích sau:<br /> - Thiết lập đồ hình thông số FS line Vs SS line, chọn khoanh vùng đại diện nhất của<br /> hồng cầu là vùng E (hình 1A).<br /> - Thiết lập chế độ phân tích đơn màu cho kháng thể anti-human IgG-FITC theo kênh<br /> huỳnh quang -FL1 log và xác lập điện thế để chỉnh ngưỡng cut off về mức 100 (hình 1B).<br /> Với mức POS ≥ 5% được coi là mẫu dương tính [6].<br /> <br /> Hình 1: Minh họa một trường hợp dương tính với kháng thể miễn dịch đồng loài kháng<br /> hồng cầu ở BN truyền máu > 10 lần.<br /> (A) Khoanh vùng phân tích ở vùng quần thể hồng cầu đại diện (vùng E). (B) Phân tích<br /> trên vùng E thấy 77,4% quần thể có biểu hiện dương tính với anti-human IgG-FITC,<br /> chứng tỏ có tồn tại kháng thể miễn dịch đồng lớp IgG bám trên bề mặt hồng cầu, nói cách<br /> khác mẫu huyết thanh của BN có kháng thể “bất thường” kháng hồng cầu thử.<br /> <br /> 22<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013<br /> Chúng tôi đã thiết lập được chương trình<br /> phân tích và sử dụng chương trình này<br /> phân tích các mẫu huyết thanh BN đã được<br /> lưu trữ. Trong 261 mẫu phân tích, mẫu phát<br /> hiện dương tính thấp nhất thu được là 5,2%<br /> và mẫu phát hiện dương tính cao nhất thu<br /> được là 97,8%.<br /> 2. Đặc điểm kháng thể đồng loài lớp<br /> IgG kháng hồng cầu ở BN truyền máu<br /> nhiều lần.<br /> * Tỷ lệ kháng thể đồng loài kháng hồng<br /> cầu (%) ở BN truyền máu nhiều lần:<br /> Số mẫu nghiên cứu: 261; số mẫu dương<br /> tính: 110. Kết quả nghiên cứu của chúng<br /> tôi (42,15%) cao hơn nhiều so với của<br /> Nguyễn Thị Thanh Mai (2005: 27,4%) [2] và<br /> Bùi Mai An (2006: 9,8%) [1]. Điều này là<br /> do chúng tôi sử dụng phương pháp Flow<br /> Cytometry để phát hiện kháng thể đồng loài<br /> có mặt, trong khi các tác giả khác dùng<br /> phương pháp ngưng kết thông qua phản<br /> ứng Coomb gián tiếp. Flow Cytometry là<br /> phương pháp phân tích lượng lớn cho kết<br /> quả chính xác, có độ nhạy cao hơn rất<br /> nhiều so với phản ứng Coomb gián tiếp,<br /> chính vì vậy Fow Cytometry có thể phát<br /> hiện được kháng thể ở cả những trường<br /> hợp không phát hiện được bằng phương<br /> pháp huyết thanh học thông thường [3, 4].<br /> 3. Tỷ lệ kháng thể đồng loài liên quan<br /> đến tuổi, giới, chẩn đoán lâm sàng và số<br /> lần truyền máu.<br /> Bảng 1: Tỷ lệ gặp kháng thể đồng loài<br /> kháng hồng cầu (%) ở BN truyền máu nhiều<br /> lần theo chẩn đoán lâm sàng.<br /> ĐỐI TƯỢNG<br /> <br /> SỐ MẪU CÓ<br /> SỐ MẪU<br /> TỶ LỆ<br /> KHÁNG THỂ<br /> NGHIÊN<br /> (%)<br /> ĐỒNG LOẠI<br /> CỨU<br /> KHÁNG HỒNG CẦU<br /> <br /> (1)<br /> <br /> (2)<br /> <br /> (3)<br /> <br /> (4)<br /> <br /> Xuất huyết<br /> giảm tiểu cầu<br /> <br /> 37<br /> <br /> 15<br /> <br /> 40,54<br /> <br /> Cộng chung<br /> <br /> 261<br /> <br /> 110<br /> <br /> 42,15<br /> <br /> Chi test: p 0,454<br /> <br /> Nhóm bệnh thalassemia có tỷ lệ bắt gặp<br /> cao nhất (44,57%), sau đó là nhóm xuất<br /> huyết giảm tiểu cầu (40,54%). Nhóm suy<br /> tủy xương có tỷ lệ bắt gặp thấp nhất<br /> (34,69%). Sở dĩ tỷ lệ này thấp do trong suy<br /> tủy xương, các tế bào dòng lympho cũng<br /> giảm nên khả năng đáp ứng miễn dịch tiết<br /> kháng thể cũng giảm.<br /> Bảng 2: Một số yếu tố liên quan đến tỷ lệ<br /> xuất hiện kháng thể đồng loại kháng hồng<br /> cầu ở BN thalassaemia.<br /> GIỚI<br /> <br /> SỐ MẪU<br /> NGHIÊN<br /> CỨU<br /> <br /> SỐ MẪU CÓ KHÁNG<br /> THỂ ĐỒNG LOẠI<br /> KHÁNG HỒNG CẦU<br /> <br /> TỶ LỆ<br /> (%)<br /> <br /> Nam<br /> <br /> 135<br /> <br /> 49<br /> <br /> 36,30<br /> <br /> Nữ<br /> <br /> 126<br /> <br /> 61<br /> <br /> 48,41<br /> <br /> Cộng chung<br /> <br /> 261<br /> <br /> 110<br /> <br /> 42,15<br /> <br /> Chi test: p = 0,047<br /> <br /> Tỷ lệ gặp kháng thể đồng loài kháng<br /> hồng cầu lớp IgG ở nữ cao hơn ở nam có ý<br /> nghĩa thống kê (p < 0,05) khi so sánh bằng<br /> thuật toán 2, phù hợp với nhận xét của<br /> Bùi Mai An [1], Nguyễn Thị Thanh Mai [2]<br /> khi nghiên cứu về kháng thể bất thường<br /> kháng hồng cầu ở BN truyền máu nhiều<br /> lần. Sở dĩ có sự chênh lệch như vậy là do ở<br /> nữ, ngoài yếu tố truyền máu, kháng thể<br /> <br /> Thalassaemia<br /> <br /> 175<br /> <br /> 78<br /> <br /> 44,57<br /> <br /> kháng đồng loài kháng hồng cầu lớp IgG<br /> <br /> Suy tủy xương<br /> <br /> 49<br /> <br /> 17<br /> <br /> 34,69<br /> <br /> xuất hiện do quá trình chửa đẻ.<br /> <br /> 23<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2013<br /> Bảng 3: Tỷ lệ xuất hiện kháng thể đồng<br /> loại kháng hồng cầu liên quan đến tuổi.<br /> NHÓM TUỔI<br /> <br /> SỐ MẪU<br /> NGHIÊN<br /> CỨU<br /> <br /> SỐ MẪU CÓ KHÁNG<br /> THỂ ĐỒNG LOẠI<br /> KHÁNG HỒNG CẦU<br /> <br /> TỶ LỆ<br /> (%)<br /> <br /> 10 - 20<br /> <br /> 29<br /> <br /> 9<br /> <br /> 31,03<br /> <br /> 21 - 40<br /> <br /> 98<br /> <br /> 30<br /> <br /> 34,69<br /> <br /> 41 - 60<br /> <br /> 73<br /> <br /> 34<br /> <br /> 41,10<br /> <br /> > 60<br /> <br /> 61<br /> <br /> 367<br /> <br /> 60,66<br /> <br /> Tổng<br /> <br /> 261<br /> <br /> 110<br /> <br /> 42,15<br /> <br /> thường ở những BN truyền máu từ 5 - 10<br /> lần là 70%, trong khi đó ở các BN mới được<br /> truyền máu 2 lần là 11,34%. Tỷ lệ bắt gặp<br /> kháng thể bất thường tăng lên theo số lần<br /> truyền máu, khác biệt có ý nghĩa thống kê<br /> (p < 0,001) bằng Chi test.<br /> KẾT LUẬN<br /> Với phần mềm CXP Cytometer 2.2, chúng<br /> tôi đã thiết lập được chương trình phân tích<br /> <br /> Chi test: p = 0,006<br /> <br /> trên máy Flow Cytometry Cytomics FC500<br /> để phát hiện kháng thể đồng loại lớp IgG<br /> <br /> Nhóm BN > 60 tuổi, tỷ lệ kháng thể đồng<br /> loài kháng hồng cầu cao nhất (66,66%),<br /> sau đó đến nhóm 41 - 60 tuổi (41,10%).<br /> Ở nhóm tuổi 10 - 20 và 21 - 41, tỷ lệ bắt<br /> gặp kháng thể bất thường tương ứng là<br /> 31,03% và 34,69%. Nhận xét này phù hợp<br /> với kết quả của Bùi Thị Mai An [1]. Sự khác<br /> biệt về tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loại<br /> kháng hồng cầu giữa các nhóm tuổi là rõ<br /> rệt, có ý nghĩa thống kê, với p < 0,05 khi so<br /> sánh bằng thuật toán Chi test.<br /> <br /> kháng hồng cầu trong huyết thanh BN được<br /> <br /> Bảng 4: Tỷ lệ xuất hiện kháng thể đồng<br /> loại kháng hồng cầu liên quan đến số lần<br /> truyền máu.<br /> <br /> 42,15%.<br /> <br /> truyền máu nhiều lần.<br /> Qua sàng lọc kháng thể kháng hồng cầu<br /> trong huyết thanh của 261 BN truyền máu<br /> nhiều lần tại Viện Huyết học - Truyền máu<br /> Trung ương chúng tôi thấy:<br /> - Tỷ lệ phát hiện kháng thể đồng loài lớp<br /> IgG kháng hồng cầu bằng kỹ thuật Flow<br /> Cytometry ở BN truyền máu nhiều lần là<br /> - Tỷ lệ bắt gặp kháng thể rất cao ở nhóm<br /> được truyền máu > 5 lần (70% ở nhóm<br /> truyền máu 5 - 10 lần), 100% ở nhóm được<br /> <br /> SỐ LẦN<br /> NHẬN MÁU<br /> <br /> SỐ MẪU<br /> NGHIÊN<br /> CỨU<br /> <br /> SỐ MẪU CÓ KHÁNG<br /> THỂ ĐỒNG LOẠI<br /> KHÁNG HỒNG CẦU<br /> <br /> TỶ LỆ<br /> (%)<br /> <br /> 2 lần<br /> <br /> 95<br /> <br /> 17<br /> <br /> 11,34<br /> <br /> - Tỷ lệ bắt gặp kháng thể đồng loại<br /> <br /> 3 - 5 lần<br /> <br /> 107<br /> <br /> 46<br /> <br /> 42,99<br /> <br /> chống hồng cầu ở BN truyền máu nhiều lần<br /> <br /> 5 - 10 lần<br /> <br /> 40<br /> <br /> 28<br /> <br /> 70,00<br /> <br /> ở nữ cao hơn ở nam và tỷ lệ thuận với tuổi<br /> <br /> > 10 lần<br /> <br /> 19<br /> <br /> 19<br /> <br /> 100,00<br /> <br /> Céng chung<br /> <br /> 261<br /> <br /> 110<br /> <br /> 42,15<br /> <br /> Chi test: p = (2,479)-13<br /> <br /> truyền máu > 10 lần.<br /> <br /> và số lần nhận máu.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Bùi Thị Mai An, Bạch Quốc Khánh, Hoàng<br /> <br /> 100% BN truyền máu > 10 lần có kháng<br /> <br /> Thị Thanh Nga, Hoàng Nhật Lệ và CS. Nghiên<br /> <br /> thể bất thường. Tỷ lệ bắt gặp kháng thể bất<br /> <br /> cứu sàng lọc kháng thể bất thường hệ hồng cầu<br /> <br /> 24<br /> <br />