Ứng dụng kỹ thuật GeneXpert trong đo tải lượng hepatitis C virus RNA từ giọt máu khô (DBS)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

8
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Viêm gan virus C là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến nhưng thường khó chẩn đoán sớm do bệnh không có triệu chứng đáng kể cho tới khi những tổn thương gan nặng xuất hiện. Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá tính ứng dụng của kỹ thuật GeneXpert trong việc đo tải lượng RNA của virus viêm gan C (HCV) từ giọt máu khô (DBS).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng kỹ thuật GeneXpert trong đo tải lượng hepatitis C virus RNA từ giọt máu khô (DBS)

CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC – TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG NĂM 2023 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GENEXPERT TRONG ĐO TẢI LƯỢNG HEPATITIS C VIRUS RNA TỪ GIỌT MÁU KHÔ (DBS) Nguyễn Văn Thảnh1, Đặng Thị Hương1, Phạm Minh Khuê1, Bạch Thị Như Quỳnh1 TÓM TẮT 43 HCV-RNA từ DBS có độ nhạy, độ đặc hiệu và Viêm gan virus C là một trong những bệnh độ tin cậy cao trong chẩn đoán viêm gan C và có truyền nhiễm phổ biến nhưng thường khó chẩn thể trở thành một phương pháp thay thế cho đoán sớm do bệnh không có triệu chứng đáng kể phương pháp xét nghiệm truyền thống. cho tới khi những tổn thương gan nặng xuất hiện. Từ khóa: Viêm gan C, Virus viêm gan C, Một trong những lý do chính khiến việc sàng lọc HCV-RNA, DBS, GeneXpert. và chẩn đoán sớm viêm gan C gặp nhiều khó khăn là do phương pháp lấy máu và bảo quản SUMMARY mẫu phức tạp. Chính vì vậy, chúng tôi đề xuất ý APPLICATION OF GENEXPERT tưởng sử dụng giọt máu khô (DBS) như một biện TECHNOLOGY IN MEASUREMENT pháp thay thế để lấy mẫu máu cho xét nghiệm HEPATITIS C VIRUS RNA LOAD sàng lọc viêm gan C. Nghiên cứu này nhằm mục FROM DRIED BLOOD SPOT D (DBS) đích đánh giá tính ứng dụng của kỹ thuật HCV infected patients usually unaware of GeneXpert trong việc đo tải lượng RNA của their HCV status as the infection are mostly virus viêm gan C (HCV) từ giọt máu khô (DBS). asymtomatic until serious liver damage stage Nghiên cứu được tiến hành trên 250 mẫu máu symptoms started to presence. The key barriers thu thập từ các bệnh nhân đồng nhiễm HIV và to HCV testing are the complicated sample HCV sống tại Hải Phòng, sau đó tiến hành đo tải collecting procedure and arduous storage and lượng HCV-RNA từ mẫu huyết tương và mẫu transportation, as the test required blood. Given DBS tương ứng bằng kỹ thuật GeneXpert rồi so this background, we came up with the idea of sánh. Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp using dried blood spot (DBS) as an alternative đo tải lượng HCV-RNA từ DBS có độ nhạy là way to collect blood for the test. This study 88.27% và độ đặc hiệu là 100%. Có 17 mẫu DBS aimed to investigate the performance of DBS in âm tính giả nhưng đều có tải lượng virus < HCV-RNA quantification against the standard 600IU/ml. Độ tin cậy được đánh giá bằng ROC plasma viral load assay using the GeneXpert (AUC = 0.94) và biểu đồ Bland – Altman. technique. 250 samples were collected from Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy đo tải lượng HIV/HCV co – infected patients living in Hai Phong. HCV-RNA quantification was performed on serum and DBS samples using the GeneXpert 1 Trường Đại học Y Dược Hải Phòng technique. The sensitivity of HCV-RNA Chịu trách nhiệm chính: Bạch Thị Như Quỳnh quantification from DBS samples was 88.27% Email: btnquynh@hpmu.edu.vn and the specificity of the test was 100%. Ngày nhận bài: 5.7.2023 Statistical analysis included ROC (AUC = 0.94) Ngày phản biện khoa học: 18.7.2023 and Bland – Altman plot. Our study has shown Ngày duyệt bài: 28.7.2023 314
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 529 - th¸ng 8 - sè CHUYÊN ĐỀ - 2023 that DBS have high sensitivity and specificity for trên giấy thấm và để khô để phân tích. HCV-RNA quantification. Although some Phương pháp thu mẫu này có nhiều ưu điểm limitations might cause false – negative results so với phương pháp thu mẫu truyền thống for the test, this technique has the potential to như: ít xâm lấn, yêu cầu lượng máu ít hơn, become a reliable alternative way for HCV có thể sử dụng máu mao mạch và dễ dàng screening by simplifying sample collection, vận chuyển và bảo quản4-5. storage, and laboratory experiments. Xuất phát từ thực trạng nêu trên, nhóm Keywords: Hepatitis C virus; Dried blood nghiên cứu xây dựng ý tưởng sử dụng giọt spot (DBS), HCV-RNA, GeneXpert. máu khô (DBS) như một cách thay thế để thu thập mẫu máu phục vu cho việc đo tải lượng I. ĐẶT VẤN ĐỀ HCV-RNA. Nghiên cứu được tiến hành với Viêm gan virus C (viêm gan C) là một mục tiêu đo tải lượng HCV-RNA từ mẫu vấn đề sức khỏe cộng động không những ở DBS sử dụng kỹ thuật GeneXpert và so sánh Việt Nam mà còn trên toàn thế giới. Theo tổ kết quả với phương pháp đo tải lượng HCV- chức y tế thế giới WHO, trên toàn cầu ước RNA từ huyết thanh. tính có khoảng 58 triệu người bị nhiễm virus viêm gan C mãn tính, với khoảng 1,5 triệu ca II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU nhiễm mới mỗi năm1. Người nhiễm virus 2.1. Đối tượng nghiên cứu viêm gan C thường không ý thức được tình 250 mẫu máu lấy từ người đồng nhiễm trạng nhiễm virus của mình do bệnh có diễn HIV và HCV lớn hơn 18 tuổi, tình nguyện biến âm thầm và gần như không có triệu tham gia trong dự án DRIVE – C từ tháng 10 chứng cho đến khi các tổn thương nặng ở năm 2020 đến tháng 3 năm 2021 trên địa bàn gan xuất hiện như xơ gan, ung thư gan2. thành phố Hải Phòng, được tách chiết và đo Người nhiễm virus viêm gan C thường tải lượng HCV-RNA tại Labo Trung tâm được chẩn đoán qua 2 giai đoạn: xét nghiệm Trường Đại học Y Dược Hải Phòng. kháng thể anti – HCV và đo tải lượng HCV- 2.2. Phương pháp nghiên cứu RNA để chẩn đoán xác định3. Phương pháp - Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực xét nghiệm truyền thống yêu cầu huyết thanh nghiệm tiến cứu. được tách chiết từ máu tĩnh mạch hoặc động - Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu mạch với các yêu cầu về trang thiết bị, máy thuận tiện. móc, với quá trình lấy mẫu được thực hiện - Phương pháp tiến hành: bởi nhân viên y tế. Do đó, một trong những + Chuẩn bị mẫu DBS (trong nghiên cứu nguyên nhân khiến việc sàng lọc và chẩn này, chúng tôi sử dụng máu tĩnh mạch để đoán viêm gan C ở cộng đồng đặc biệt là các chuẩn bị mẫu DBS tương ứng với mẫu huyết vùng xa xôi, hẻo lánh với điều kiện y tế kém thanh): Nhỏ 50µl máu chống đông bằng phát triển trở nên khó khăn là sự phức tạp EDTA vào các ô tương ứng trên thẻ DBS. trong khâu lấy mẫu và bảo quản mẫu. Để khô ở nhiệt độ phòng trong tủ an toàn Phương pháp thu mẫu sử dụng giọt máu sinh học, sau đó cho vào túi zip cùng với 1-2 khô (DBS) là một phương pháp thu mẫu tiên gói chống ẩm rồi bảo quản ở -20oC hoặc thấp tiến được tiến sĩ Robert Guthrie đưa ra năm hơn. 1963, trong đó các mẫu máu nhỏ được thấm + Rửa giải DBS: 315
CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC – TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG NĂM 2023 • Lấy mẫu DBS ra khỏi tủ đông, để ở Dược Hải Phòng thông qua. Mọi thông tin nhiệt độ phòng cho tan đá. của cá nhân được mã hóa và giữ bảo mật an • Đục 1 lỗ 6mm từ 1 mảnh DBS, cho vào toàn. Thu thập số liệu được tiến hành một ống eppendorf 1.5ml sạch. cách trung thực, chỉ phục vụ cho mục đích • Hút 1000µl đệm rửa giải nghiên cứu. (PBS/TWEEN/BSA) vào ống eppendorf. • Ủ ở 4oC trong 1 giờ. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Dung dịch DBS đã rửa giải có thể đem 3.1. Kết quả thu thập mẫu DBS phân tích sử dụng Cepheid GeneXpert Viral 250 mẫu máu thu được từ các bệnh nhân Load. đồng nhiễm HIV và HCV tại Hải Phòng từ 2.3. Xử lý số liệu tháng 10 năm 2020 đến tháng 3 năm 2021 Số liệu được thu thập và xử lý bằng phần được sử dụng để tạo ra 250 thẻ DBS tương mềm MS Excel 2013. ứng, với mỗi ô tròn được nhỏ 50µl máu toàn 2.4. Đạo đức trong nghiên cứu phần. Lượng máu còn lại được ly tâm, thu Nghiên cứu được sự đồng thuận của chủ huyết tương làm mẫu đối chứng cho xét nhiệm dự án DRIVE – C, Hội đồng Khoa nghiệm. học và Hội đồng Đạo đức Trường Đại học Y Hình 1. Thẻ DBS sau khi được hoàn thành Mỗi thẻ DBS có 5 ô, tuy nhiên, trong có thể tích mẫu máu tương đương nhau. Do nghiên cứu này chúng tôi chỉ sử dụng 1 ô (1 đó việc sử dụng các ô tròn trong cùng 1 mẫu hình tròn), phần còn lại được sử dụng trong DBS cho kết quả tương đương. các dự án khác của DRIVE – C. 3.2. Kết quả đo tải lượng HCV-RNA Nhận xét: Các thẻ mẫu DBS có mã mẫu, sử dụng mẫu DBS bằng kỹ thuật ngày thu mẫu được ghi rõ nét, các ô tròn có GeneXpert độ đậm đồng đều chứng tỏ chứng tỏ chúng 316
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 529 - th¸ng 8 - sè CHUYÊN ĐỀ - 2023 Bảng 1: Kết quả đo tải lượng HCV-RNA sử dụng mẫu DBS bằng kỹ thuật GeneXpert Kết quả Số lượng Không có kết quả 7 Âm tính 115 Dương tính 128 Tổng 250 Nhận xét: Trong tổng số 250 mẫu DBS 243 mẫu có kết quả đo tải lượng HCV- được sử dụng để đo tải lượng HCV-RNA có RNA bằng mẫu DBS được tiến hành đo tải 7 mẫu không cho ra kết quả, 115 mẫu âm lượng sử dụng mẫu huyết thanh, kết quả tính và 128 mẫu dương tính. được thể hiện ở Bảng 3.2. 3.3. Kết quả đo tải lượng HCV-RNA sử dụng mẫu huyết tương bằng kỹ thuật GeneXpert Bảng 2: Kết quả đo tải lượng HCV-RNA sử dụng mẫu huyết tương bằng kỹ thuật GeneXpert Kết quả Số lượng Âm tính 98 Dương tính 145 Tổng 243 Nhận xét: Trong tổng số 243 mẫu huyết 3.3. So sánh kết quả đo tải lượng tương được tiến hành đo tải lượng HCV- HCV-RNA bằng kỹ thuật GeneXpert trên RNA có 98 mẫu âm tính và 145 mẫu dương mẫu DBS và huyết thanh tính. 3.3.1. Kết quả độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm đo tải lượng HCV-RNA bằng kỹ thuật GeneXpert trên mẫu DBS Hình 2. Kết quả độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm đo tải lượng HCV-RNA bằng kỹ thuật GeneXpert trên mẫu DBS Nhận xét: Độ nhạy của xét nghiệm đo tải lượng virus viêm gan C bằng mẫu DBS là 88.27% với độ đặc hiệu là 100% 317
CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC – TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG NĂM 2023 3.3.2. Kết quả đánh giá độ tin cậy của của xét nghiệm đo tải lượng HCV-RNA bằng kỹ thuật GeneXpert trên mẫu DBS Hình 3. Đường cong ROC của giá trị tải lượng HCV-RNA trên mẫu DBS Nhận xét: Đường cong ROC (Receiver Operating Characteristic) được sử dụng để phân tích sự liên quan giữa mẫu DBS và mẫu huyết thanh đối chứng có ngưỡng phát hiện ≥ 4.5 IU/ml với AUC = 0.94, p < 0.05 Hình 4. Biểu đồ Bland – Altman trên mẫu DBS và huyết thanh Nhận xét: Biểu đồ Bland – Altman giữa tải lượng virus mẫu DBS và mẫu huyết thanh IV. BÀN LUẬN chứng có giá trị trung bình của sự khác biệt Sự gia tăng tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C là 1.2 IU/ml, với ngưỡng giá trị chấp thuận là gây ra gánh nặng sức khỏe toàn cầu do đó -1.2 – 3.6 IU/ml. 95% các kết quả nằm trong nhu cầu cần có một phương pháp xét nghiệm khoảng chấp thuận. giúp sàng lọc và chẩn đoán nhanh chóng, dễ áp dụng và chi phí thấp tăng cao. Những quy 318
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 529 - th¸ng 8 - sè CHUYÊN ĐỀ - 2023 trình xét nghiệm virus viêm gan C hiện nay giấy DBS mới, tuy nhiên do giới hạn của được thực hiện bởi nhân viên y tế được đào nghiên cứu về chi phí, nguồn mẫu còn được tạo về chuyên môn do quá trình lấy mẫu dành cho các nghiên cứu tiếp theo trong dự phức tạp, yêu cầu về máy móc xét nghiệm án Drive-C, do đó những mẫu bị lỗi này hiện đại, vì vậy khó tiếp cận với cộng đồng không được thực hiện lại. Với 243 mẫu có đặc biệt là khu vực xa xôi, hẻo lánh, ở các kết quả đo tải lượng HCV-RNA sử dụng nước đang và kém phát triển. mẫu DBS được tiến hành đo tải lượng bằng Ý tưởng sử dụng giọt máu khô để chẩn mẫu huyết tương, kết quả cho thấy có 145 đoán HCV được đưa ra như một giải pháp mẫu dương tính và 98 mẫu âm tính với thay thế vì chúng dễ dàng thu thập bởi tất cả HCV-RNA. mọi người, rẻ hơn, nhanh hơn và thuận lợi Đánh giá độ nhạy của xét nghiệm phát cho quá trình bảo quản cũng như vận chuyển hiện HCV-RNA trên mẫu DBS là 88.27% và mẫu bệnh phẩm. Nhiều nghiên cứu trước đây độ đặc hiệu là 100%. Kết quả này là tương đã chỉ ra rằng phương pháp thu mẫu sử dụng đồng với nghiên cứu của tác giả Andrea giọt máu khô (DBS) là đáng tin cậy trong Bregenzer và cộng sự8 công bố năm 2021 việc phát hiện và đo tải lượng HCV-RNA với độ nhạy là 90% và độ đặc hiệu là 100%. với độ nhạy và độ đặc hiệu cao6-7. Việc ứng Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy DBS dụng DBS trong chẩn đoán nhiễm virus viêm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc gan C giúp gia tăng số lượng người sàng lọc phát hiện HCV-RNA6-9. và xét nghiệm sớm ở các nhóm có nguy cơ Khi so sánh với mẫu huyết thanh đối cao từ đó giảm thiểu tác hại của virus tới sức chứng, nhóm nghiên cứu nhận thấy 17 mẫu khỏe của người bệnh cũng như tiến tới loại âm tính giả trong nghiên cứu này đều được bỏ hoàn toàn virus ra khỏi cộng đồng. lấy từ những bệnh nhân có tải lượng virus Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thử thấp (
CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC – TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC HẢI PHÒNG NĂM 2023 gặp ở những bệnh nhân chưa được điều trị. dụng mẫu máu DBS bằng kỹ thuật Thật vậy, theo một nghiên cứu được công bố Geneexpert có độ nhạy, độ đặc hiêu và độ tin bởi tổ chức y tế thế giới - WHO, hơn 95% cậy cao, có thể hữu dụng trong việc phát hiện các bệnh nhân nhiễm HCV mạn tính có tải và đo tải lượng HCV-RNA, đặc biệt là trong lượng virus lớn hơn 4.0 log10 IU/ml (lớn hơn sàng lọc cộng đồng dân cư ở các vùng xa 10000 IU/ml)10. xôi, hẻo lánh với điều kiện y tế kém phát Theo nghiên cứu được tác giả Jenna triển và theo dõi những bệnh nhân chưa hoặc Weber và cộng sự công bố năm 2019 cho đang điều trị. thấy có 402/422 (95.3%) các mẫu máu từ bệnh nhân nhiễm HCV mạn tính chưa qua V. KẾT LUẬN điều trị có tải lượng virus lớn hơn hoặc bằng Mặc dù vẫn còn một số hạn chế dẫn tới 4.0 log10 IU/ml (≥10,000 IU/ml). Thêm vào các kết quả âm tính giả, kỹ thuật sử dụng đó, 412/422 (97.6%) mẫu bệnh phẩm có tải DBS để phát hiện và đo tải lượng HCV-RNA lượng virus lớn hơn hoặc bằng 3.0 log10 bằng GeneXpert đã chứng minh là có độ IU/ml (≥1,000 IU/ml). Tải lượng virus trong nhạy, độ đặc hiệu và giá trị tin cậy cao. các mẫu từ bệnh nhân sau điều trị là lớn hơn Phương pháp này có tiềm năng để trở thành hoặc bằng 3.0 log10 IU/ml (≥1,000 IU/ml). một giải pháp thay thế cho phương pháp xét Kết quả của nghiên cứu này cũng cho thấy nghiệm và sàng lọc HCV trong tương lai DBS có thể phù hợp trong chẩn đoán các bằng việc dễ thu thập, đơn giản hóa quy trình bệnh nhân chưa được điều trị hoặc sàng lọc lấy mẫu, bảo quản và không yêu cầu các cộng đồng11. thiết bị dụng cụ thí nghiệm phức tạp. Phân tích đường cong ROC cho thấy, diện tích dưới đường cong AUC = 0.94. Giá VI. KIẾN NGHỊ Trong nghiên cứu này, vẫn còn một số trị này tương đương với nghiên cứu của tác hạn chế nhất định dẫn đến các kết quả âm giả Parker S.P và Khan H.I. với AUC là tính giả. Nhóm nghiên cứu hi vọng trong 0.9212. Từ đó, có thể thấy xét nghiệm phát tương lai có thêm những nghiên cứu mới hiện HCV-RNA trên mẫu DBS là có giá trị được tiến hành trên cỡ mẫu lớn hơn và tối ưu và đáng tin cậy. hóa quy trình xét nghiệm của kỹ thuật đo tải Nghiên cứu này cũng chỉ ra mối liên lượng HCV-RNA trên mẫu DBS. quan tốt giữa giá trị đo tải lượng HCV-RNA trên mẫu DBS và mẫu huyết thanh, tương tự VII. LỜI CẢM ƠN với một vài nghiên cứu trước đó8-13. 95% số Chúng tôi chân thành cảm ơn dự án mẫu nghiên cứu nằm trong khoảng chấp DRIVE – C đã tài trợ kinh phí cũng như thuận của biểu đồ Bland – Altman. chấp thuận để chúng tôi sử dụng các mẫu Từ các kết quả trên, nhóm nghiên cứu nghiên cứu của dự án để tiến hành nghiên nhận thấy kỹ thuật định lượng HCV-RNA sử cứu này. 320
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 529 - th¸ng 8 - sè CHUYÊN ĐỀ - 2023 TÀI LIỆU THAM KHẢO with the Xpert® HCV Viral Load test for 1. Hepatitis C. . monitoring treatment and detecting 2. Hepatitis C Questions and Answers for reinfection. Swiss Medical Weekly, Vol. 151 Health Professionals (2022) | CDC. No. 5152 (2021). 3. Ghany M.G., Strader D.B., Thomas D.L., 9. Tuaillon E., Mondain A.-M., Meroueh F., et al. (2009). Diagnosis, management, and et al. (2010). Dried blood spot for hepatitis C treatment of hepatitis C: an update. Hepatol virus serology and molecular testing. Hepatol Baltim Md, 49(4), 1335–1374. Baltim Md, 51(3), 752–758. 4. Li: Dried blood spots: applications and 10. World Health Organization: WHO techniques - Google Scholar. guidelines on hepatitis... - Google Scholar. 5. Grüner N., Stambouli O., and Ross R.S. 11. Weber J., Sahoo M.K., Taylor N., et al. (2015). Dried Blood Spots - Preparing and (2019). Evaluation of the Aptima HCV Processing for Use in Immunoassays and in Quant Dx Assay Using Serum and Dried Molecular Techniques. J Vis Exp JoVE, Blood Spots. J Clin Microbiol, 57(4), (97), 52619. e00030-19. 6. Parker S.P., Khan H.I., and Cubitt W.D. 12. Parker S.P., Khan H.I., and Cubitt W.D. (1999). Detection of antibodies to hepatitis C (1999). Detection of antibodies to hepatitis C virus in dried blood spot samples from virus in dried blood spot samples from mothers and their offspring in Lahore, mothers and their offspring in Lahore, Pakistan. J Clin Microbiol, 37(6), 2061– Pakistan. J Clin Microbiol, 37(6), 2061– 2063. 2063. 7. Abe K. and Konomi N. (1998). Hepatitis C 13. Nguyen T.T., Lemee V., Bollore K., et al. Virus RNA in Dried Serum Spotted onto (2018). Confirmation of HCV viremia using Filter Paper Is Stable at Room Temperature. HCV-RNA and core antigen testing on dried J Clin Microbiol, 36(10), 3070–3072. blood spot in HIV infected peoples who 8. Andrea B, Cornelia O, Cornelia K, Karin inject drugs in Vietnam. BMC Infect Dis, 18, S, Christoph A. (2021). HCV RNA 622. quantification in capillary dried blood spots 321