Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HỒ MẠNH TƢỜNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT METAGENOMICS TRONG NGHIÊN CỨU HỆ VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÂY DÓ BẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH CỦA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

HÀ NỘI, 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HỒ MẠNH TƢỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

Mã số: 60 42 01 14

Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. LÊ VĂN SƠN

Đơn vị: Viện Công nghệ sinh học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

2

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Hà Nội, 2015

MỞ ĐẦU

Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới, độc đáo và có thể áp dụng

rộng rãi trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học. Công nghệ metagenomics

kết hợp với kỹ thuật gen, kỹ thuật protein sẽ cung cấp các hiểu biết sâu sắc về các

vấn đề trong tiến hóa gen hoặc thông tin về các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí

ẩn vì chúng khó có thể đƣợc nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm.

Môi trƣờng đất rất phức tạp khi nghiên cứu số lƣơng và sự đa dạng các

loài trong hệ vi sinh vật. Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác

nhau, số lƣợng các sinh vật nhân sơ đƣợc xác định từ khoảng 2000 đến 18000

bộ gen trên một gram đất. Số lƣợng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài

hiếm và chƣa đƣợc biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích. Do đó, số

lƣợng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất

nhiều. Trong khi đó, phƣơng pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để

khám phá và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất. Nuôi cấy và

phân lập DNA của vi sinh vật là phƣơng pháp phổ biến nhƣng chỉ đƣợc từ 0,1

đến 1% vi sinh vật là có thể đƣợc nuôi cấy sử dụng các phƣơng pháp tiêu chuẩn,

vì vậy sự đa dạng của hệ vi sinh vật vẫn chƣa đƣợc khám phá hết.

Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm họ Trầm, bộ Bông là lớp Cây

gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan. Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau phân bố chủ

yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

3

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh,

rừng ẩm nguyên sinh. Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chữa một số bệnh hiểm

nghèo, có tác dụng kháng khuẩn, có tính kháng sinh. Giá trị quan trọng nhất của

cây dó bầu là nguồn vật liệu sinh trầm hƣơng. Trầm hƣơng đƣợc coi là một loại

lâm sản ngoài gỗ có giá trị thƣơng mại quốc tế nhất. Trên thế giới, Trầm hƣơng

đƣợc sử dụng để chƣng cất tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành công

nghiệp mỹ phẩm cao cấp. Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, đƣợc dùng trong

công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nƣớc hoa cao cấp, giá trị.

Hệ vi sinh vật vùng rễ đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trƣởng và

phát triển của cây dó bầu. Tuy nhiên, vai trò của chúng chƣa đƣợc nghiên cứu

kỹ cũng nhƣ chƣa có một nghiên cứu nào về sự tác động của hệ vi sinh vật đến

khả năng tạo trầm. Vì vậy, nghiên cứu này tập trung vào sử dụng kỹ thuật mới

metagenomic để nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu để phục vụ cho

các nghiên cứu tiếp theo.

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định đƣợc thành phần giới, họ, chi, loài của các mẫu -

nghiên cứu

So sánh sự giống và khác nhau của các mẫu nghiên cứu -

Nội dung nghiên cứu

Phân lập DNA tổng số từ đất của các mẫu nghiên cứu -

Gắn adapter với mỗi mẫu nghiên cứu -

Xác định trình tự 16S của các mẫu nghiên cứu -

Xác định độ đa dạng của các mẫu nghiên cứu -

Xác định thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu -

So sánh thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu. -

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

4

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Cây dó bầu và khả năng tạo trầm

1.1.1. Nguồn gốc, phân bố

Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm (Aquilaria), họ Trầm

(Thymelaeaceae), bộ Bông (Malvales), lớp Cây gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan.

Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau, tuy nhiên chỉ có 15 loài có khả năng cho

trầm hƣơng gồm: Aquilaria crassna; A.baillonii; A.sinensis hoặc A.chinesis;

A.borneensis ; A.malaccensis ; A.gollocha ; A.hirta; A.rostrata; A.beccariana;

A.cummingiana; A.filaria; A.khasiana; A.microcarpa; A.grandiflora;

A.bancana; A.rugosa, trong đó loài A rugosa đƣợc Kiet và cộng sự phát hiện

năm 2005 (Kiet et al., 2005).

Chi Trầm phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam

Á và miền Nam Trung Quốc. Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng

rậm nhiệt đới thƣờng xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc các tỉnh Tuyên Quang,

Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt là từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa

Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình

Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc (Hình 1, Danh

5

lục các loài thực vật Việt Nam). Trầm hƣơng phân bố tại Việt nam có 4 loài là: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Trầm hƣơng (A.crassna Pierre ex Lecomte); dó baillon (A. baillonii Pierre ex

Lecomte), dó bana (A. banaensae.Phamhoang.) (Phạm Hoàng Hộ 1992) và dó

quả nhăn (A. rugosa L.C. Kiet & Krbler) (Lê Công Kiệt et al., 2005). Trong đó,

cây dó bầu A. crassna là loài đƣợc trồng phổ biến nhất vì khả năng loại trầm tốt

nhất thế giới (Hoàng Cảnh 2006). Các loài dó baillon (A. baillon), dó bana (A.

banaensae) và dó quả nhăn (A. rugosa) đều là đặc hữu có thể bắt gặp tại một

vài địa điểm thuộc Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và Quảng Nam. Trong kho đó,

dó quả nhăn (A. rugosa) là loài mới đƣợc phát hiện tại Kon Tum.

Hình 1.1. Phân bố dó bầu tại Việt Nam

Hiện nay, các cá thể trƣởng thành của trầm hƣơng cơ bản bị tuyệt diệt

trong tự nhiên. Vùng trọng điểm gây trồng cây dó trầm hiện nay ở nƣớc ta là

Bán Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, và Tây Nam Bộ.

Trong đó, vùng Bắc Trung Bộ tập trung chủ yếu tại Hà Tĩnh,vùng Nam Trung

Bộ tập trung chủ yếu tại Quảng Nam, vùng Tây Nguyên chủ yếu tập trung tại

Kon Tum, Đông Nam Bộ tập trung chủ yếu tại Bình Phƣớc, Tây Nam Bộ tập

trung chủ yếu tại Kiên Giang và An Giang.

1.1.2. Giá trị kinh tế, dược liệu và sinh thái

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

6

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Giá trị kinh tế: Giá trị quan trọng nhất của cây dó bầu là nguồn vật liệu

sinh trầm hƣơng. Trầm hƣơng đƣợc coi là một loại lâm sản ngoài gỗ có giá trị

thƣơng mại quốc tế nhất. Trên thế giới, Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chƣng cất

tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cao cấp.

Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, đƣợc dùng trong công nghệ chế biến các loại

chất thơm, các loại nƣớc hoa cao cấp, giá trị. Theo công ƣớc về buôn bán quốc

tế những loài động thực vật hoang dã nguy cấp, khối lƣợng mua bán trầm hƣơng

trên thị trƣờng thế giới thời kỳ 1995 – 1997 khoảng 1.350 tấn. Giá mua bán

Trầm hƣơng đƣợc tính theo kg tùy thuộc vào chất lƣợng. Giá bán Trầm tại thị

trƣờng Dubai (Arabia Saudi) vào năm 1993 dao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại

thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt nhất) (Barden et al., 2000).

Giá trị dược liệu: Trong y học, trầm hƣơng còn đƣợc sử dụng để chữa

một số bệnh hiểm nghèo, chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen

suyển, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích

dục… Trầm hƣơng có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn

Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri, có tính khánh sinh, tạo kháng

thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết thƣơng), có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ

bệnh về tim mạch (suy tim, đau ngực), bệnh về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần

kinh (an thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh….), bệnh về tiêu hoá (đau bụng,

buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện). Đặc biệt có thể dùng trầm

hƣơng để chữa ung thƣ tuyến giáp.

Giá trị sinh thái: Đối với môi trƣờng sinh thái và phát triển bền vững, việc

đƣa dó bầu (Aquilaria sp.) vào cơ cấu cây rừng với mục tiêu 5 triệu hecta rừng

tại tỉnh Hà Tĩnh nói riêng và trong cả nƣớc nói chung đã góp phần thúc đẩy tăng

độ che phủ của rừng, chống xói mòn đất và bảo vệ môi trƣờng. Cây gió bầu góp

phần bảo tồn và phát triển loài cây đặc hữu, qúy hiếm, có giá trị về khoa học và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

7

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

kinh tế của nƣớc ta, đây còn là giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đi đôi

với bảo vệ môi trƣờng, kết hợp lợi ích trƣớc mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu

trên cơ sở khai thác và tái tạo lợi thế đặc hữu, ƣu việt của tài nguyên quốc gia.

Hơn nữa, cây dó bầu còn có ý nghĩa tạo công ăn việc làm cho ngƣời lao động,

mở ra hƣớng phát triển kinh tế bền vững cho nông thôn, vùng sâu vùng xa (Thái

Thành Lƣợm 2009).

1.1.3. Khả năng sinh trầm của dó bầu

Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây dó bầu là sự biến đổi của các phần tử

gỗ do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm…Có 3 giả

thuyết tồn tại đến sự tạo trầm liên quan đến các tác nhân bệnh lý, thƣơng tích

bệnh lý hoặc thƣơng tích không bệnh lý (Ng et al., 1997). Kết quả của nghiên

cứu không cung cấp đƣợc bằng chứng thuyết phục là tác nhân nào trong số 3 tác

nhân trên tác động đến sự tạo trầm của cây. Ngoài ra, nghiên cứu của Oldfield

et al. (1998) cho rằng quá trình tạo trầm có liên quan đến sự đáp ứng của cây với

nấm. Hơn nữa, Heuveling và Phillips (1999) cho rằng nó liên quan đến đáp ứng

với thƣơng tích. Nghiên cứu cho rằng sự xâm nhiễm của nấm có thể làm tăng sự

tạo trầm cũng nhƣ sự đáp ứng của tế bào chủ với vết sự phát triển của nấm xâm

nhiễm. Dó bầu có thể đƣợc xâm nhiễm tự nhiên bởi một vài các loại nấm nhƣ:

Aspergillus spp, Botryodyplodia spp, Diplodia spp, Fusarium bulbiferum, F.

laterium, F. oxysporum , F. solani, Penicillium spp, and Pythium spp. (Anon

1998; Soehartono and Mardiastuti 1997; Wiriadinata 1995). Sự tƣơng tác giữa tế

bào chủ với nấm hay các tác nhân khác để tạo thành trầm vẫn chƣa đƣợc nghiên

cứu kỹ. Sự tƣơng tác này xảy ra một cách tự nhiên năm này sang năm khác. Căn

cứ vào sự hóa nhựa nhiều hay ít mà có những sản phẩm nhƣ: Tóc, Trầm hƣơng

và Kỳ nam. Thực tế cho thấy những cây dó bầu sau khi chết rục thì lƣợng Kỳ

nam hoặc Trầm hƣơng thƣờng đƣợc phát hiện ở phần gốc rễ, nơi thƣờng tiếp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

8

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

xúc với hệ sinh vật đất. Đây cũng có thể là tác nhân sinh học gây bệnh tạo trầm

hƣơng.

Trên cơ chế hình thành trầm trong tự nhiên, 3 kỹ thuật cấy tạo trầm nhân

tạo phổ biến đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu là: phƣơng pháp vật lý

(gây vết thƣơng cơ giới); phƣơng pháp hóa học (xúc tác hóa chất); phƣơng pháp

sinh học (xử lý với men vi sinh). Ngoài ra, một số cách tạo trầm khác nhƣ: kết

hợp một số phƣơng pháp trên với nhau. Kết quả mỗi phƣơng pháp tạo trầm

hƣơng khác nhau về số lƣợng, chất lƣợng, thời gian và chi phí, nhƣng hiệu quả

tạo trầm chƣa cao, nhƣ kỳ vọng của các nhà sản xuất. Hiệu quả tạo trần thấp là

do cơ chế và sự tƣơng tác các tác nhân (đặc biệt tác nhân sinh học) của việc

sinh tạo trầm trong tự nhiên vẫn chƣa đƣợc làm rõ. Hơn nữa, trong những năm

gần đây các nghiên cứu tạo các chromone invitro (thành phần chính trong tinh

dầu trầm) từ nuôi cấy huyền phù tế bào của dó bầu đã thu đƣợc các kết quả khả

quan ban đầu (Qi et al., 2005; Ito et al., 2005).

1.2. Ứng dụng Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu hệ vi

sinh vật

1.2.1. Vai trò của hệ vi sinh vật đối với môi trường và cây trồng

Các vi sinh vật đóng vai trò to lớn đối với các sinh vật sống trên trái đất.

Sự đa dạng của hệ vi sinh vật phản ánh sự phong phú về chức năng, cung cấp

các thành phần cần thiết cho tất cả các dạng sống tồn tại. Các vi sinh vật tham

gia vào hầu hết các chu trình sinh, hóa học trên tái đất từ xử lý rác thải tới thúc

đẩy sự tăng trƣởng và sinh sản của thực vật, động vật. Hơn nữa, vi sinh vật cung

cấp cho con ngƣời các sản phẩm nhƣ: thuốc, các loại sản phẩm lên men và góp

phần vào việc duy trì sức khỏe. Chỉ gần đây các nhà vi sinh vật học mới đánh

giá chính xác sự đa dạng trong hệ vi sinh vật do nhiều vi sinh vật không thể

đƣợc nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả dẫn đến các nhà vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

9

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

sinh vật rất khó để tìm hiểu về các hệ vi sinh vật không thể phát hiện bằng các

phƣơng pháp truyền thống này. Vai trò của các vi sinh vật có thể đƣợc khái quát

nhƣ sau:

Microbial services: Các vi sinh vật là các sinh vật rất quan trọng trên trái

đất nhƣng vai trò của chúng ít đƣợc biết đến do chúng không thể đƣợc phát hiện

bằng mắt thƣờng. Vi sinh vật cung cấp cho con ngƣời không khí, thức ăn và

thực hiện hầu hêt các chức năng của cơ thể, trong khi đó rất ít ngƣời biết về vai

trò của chúng với cuộc sống. Có rất nhiều các ví dụ điển hình cho việc cung cấp

các thành phần thiết yếu của vi sinh vật cho các sinh vật khác (Madigan and

Martinko 2005).

Sự tạo thành oxi: Một bƣớc quan trọng trong lịch sử sống trên trái đất là

sự chuyển từ hô hấp kỵ khí sang hiếu khí đƣợc tạo ra bởi vi sinh vật tự dƣỡng.

Khi sự sống trên trái đất bắt đầu, môi trƣờng sống là hô hấp kỵ khí hoặc không

cần oxi. Khoảng 1 tỷ năm trƣớc đây, một vài vi sinh vật ngoài đại dƣơng tiến

hóa khả năng sử dụng năng lƣợng mặt trời để tham gia vào các phản ứng mà kết

quả là giả phóng oxi. Oxi trên trái đất tích tụ lại tạo thành khí quyển cho đến khi

lƣợng của chúng đủ để hình thành và nuôi dƣỡng các sinh vật hiếu khí. Trong

đó một dạng oxi phân tử cao đƣợc hình thành là O3 do các phân tử O2 va chạm

với nhau. Ozone là một phân tử rất đặc biệt, không giống nhƣ oxi, nó có thể hấp

thụ tia UV. Do đó, sự sống trên bề mặt trái đất có thể phát triển vì tầng ozone đã

lọc hết các tia UV và bảo vệ trái đất khỏi phóng xạ có thể phá hủy DNA và tế

bào. Ngay sau khi hình thành oxi và tầng ozone ở tầng bình lƣu, sự sống bắt đầu

bùng. Tầng oxi và ozone đƣợc hình thành đầu tiên hoàn toàn do vi sinh vật và

ngày nay đƣợc duy trì bởi các vi khuẩn tự dƣỡng và thực vật (Handelsman

2007).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

10

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Sự chuyển hóa nito: Một trong những vai trò quan trọng khác của vi

khuẩn là cung cấp nito dƣới dạng có thể hấp thu đƣợc đối với động vật và thực

vật. Một trong những điều thú vị là mặc dù khí quyển có tới 79% là nito, tuy

nhiên hầu hết các sinh vật đề không thể sử dụng chúng. Nito trong khí quyển tồn

tại dƣới dạng bền N2 nên các sinh vật không thể bẻ gẫy các liên kết này để sử

dụng đƣợc. Thực tế vi khuẩn là sinh vật duy nhất có thể bẻ gẫy các liên kết trong

N2 và cố định chúng (Handelsman 2007).

Duy trì sức khỏe con người: Các hệ vi sinh vật sống trong, trên cơ thể con

ngƣời rất cần thiết cho sức khỏe của vật chủ. Vi khuẩn trong hệ đƣờng ruột bảo

vệ con ngƣời khỏi sự tấn công của các mần bệnh, khi mà sự cân bằng của hệ vi

sinh vật đƣờng ruột bị phá vỡ thì sẽ kéo theo sự xuất hiện của rất nhiều bệnh

nhƣ: nhiễm trùng đƣờng ruột, ung thƣ ruột, béo phì và tiểu đƣờng những bệnh

này không gây ra bởi một sinh vật riêng lẻ mà liên quan tới các quá trình của hệ

vi sinh vật. Trong một số khía cạnh các chức năng của hệ vi sinh vật nhƣ là một

đơn vị trong đó mỗi vi sinh vật phụ thuộc vào các vi sinh vật khác cần thiết cho

cuộc sống và hiệu quả chức năng của hệ thống phụ thuộc vào sự tƣơng tác và

hợp tác giã mỗi thoành viên trong cộng đồng. Các hệ vi sinh vật liên quan tới cơ

thể con ngƣời là chủ đề của hai quá trình tiến hóa. Đầu tiên, chúng đồng tiến hóa

với con ngƣời qua hàng ngàn năm cộng sinh, do đó gen của con ngƣời đã đƣợc

sự hỗ trợ và dựa vào những gen những vi sinh vật này. Thứ hai, mỗi vi sinh vật

trong hệ tiên hóa trong thời gian sống của chúng. Tiến hóa của các hệ vi sinh vật

với loài ngƣời cũng nhƣ với sinh vật khác tạo ra sự phụ thuộc và giao tiếp giữa

chúng. Kết quả là cá vi sinh vật cần đƣợc nghiên cứu về cả hệ vi sinh vật mà

không chỉ nuôi cấy trong phòng thí nghiệm (Handelsman 2007).

Tổng hợp kháng sinh: Các vi sinh vật là nguồn cung cấp hầu hết các

kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1920, Alexander Fleming đã

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

11

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

tìm ra chất tiết penicillin của nấm có thể ngăn cản việc phát triển của vi khuẩn.

Phát hiện ra penicillin đã dẫn tới việc khám phá và thƣơng mại hóa kháng sinh

cho y học và nông nghiệp. Rất nhiều vi khuẩn tiết ra kháng sinh với nhiều tính

chất hóa học và chức năng khác nhau, cung cấp các loại thuốc chúng ta có ngày

nay. Nguyên nhân nấm và vi sinh vật sản sinh ra kháng sinh vẫn chƣa đƣợc biết

nhƣng khả năng phổ biến là chúng rất quan trọng trong đời sống của các sinh vật

này. Một giả thuyết đƣợc quan tâm là các sinh vật này sử dụng để hạn chế sự

phát triển của các vi sinh vật khác; một giả thuyết khác là chúng sử dụng kháng

sinh nhƣ là một tín hiệu để cảnh báo với các loài khác trong khu hệ

(Handelsman 2007).

Các vai trò khác: Vai trò của vi sinh vật với các quá trình sinh hóa và tự

nhiên là vô cung to lớn: tham gia vào các chu trình dinh dƣỡng, hoặc cải tiến y

học. Ngoài ra, chúng còn tham gia vào các quá trình chuyển hóa thức ăn: lên

men, cung cấp các enzyme hay polymers, làm sạch các rác thải độc hại và bảo

vệ sức khỏe của con ngƣời, thực vật và động vật. mặc dù vi sinh vật thƣờng liên

quan tới các bệnh nhƣng các tác nhân gây bệnh chỉ là một phần nhỏ của hệ vi

sinh vật trên trái đất và các vi sinh vật có ích sẽ giúp kiểm soát các tác nhân gây

bệnh (Handelsman 2007).

Ngoài ra, các hệ vi sinh vật tồn tại trên và xung quanh cây trồng đóng vai

trò hết sức quan trọng lên năng suất và chất lƣợng cây trồng. Tuy nhiên, mới chỉ

một số loài vi khuẩn có vai trò đã đƣợc biết đến. Nhiều loài vi sinh vật khác có

khả năng sử dụng các chất từ xác động vật và thực vật phân hủy, hoặc chuyển

hóa một số nguyên tố nhƣ sắt và mangan, thành các hình thức mà thực vật có thể

hấp thụ đƣợc. Thực vật không thể tồn tại và phát triển nếu thiếu hệ vi sinh vật

đất. Trên một số môi trƣờng đất, cây trồng vẫn phát triển tốt ngay cả khi tồn tại

các tác nhân gây bệnh ở mật độ cao. Sau nhiều thập kỷ nghiên cứu, các nhà bệnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

12

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

lý học thực vật phát hiện các hệ vi sinh vật cực kỳ phức tạp đóng vai trò ức chế

tác nhân gây bệnh, các nghiên cứu chỉ ra rằng các phức hệ vi sinh vật này có thể

góp phần vô cùng hữu ích cho sản xuất nông nghiệp. Không một vi sinh vật

riêng lẻ nào đƣợc phân lập lại có khả năng tƣơng tự, điều này cho thấy tác động

qua lại, hỗ trợ nhau trong quá trình ức chế tác nhân gây bệnh của các thành viên

trong hệ vi sinh vật đất. Các nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng của hệ vi sinh

vật đất là rất lớn và nghiên cứu thành công hệ vi sinh vật này hứa hẹn mang lại

nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực sản xuất các chế phẩm sinh học nhƣ phân

bón vi sinh hay tác động đến hệ vi sinh vật đất nhằm cải thiện và nâng cao chất

lƣợng cây trồng. Qua trên có thể thấy rằng Metagenomics là một bƣớc cách

mạng hóa ngành vi sinh vật vì nó đã mở ra một cửa sổ để nghiên cứu thế giới vi

sinh vật khổng lồ mà trƣớc đây chƣa đƣợc nghiên cứu.

1.2.2. Giới thiệu về công nghệ metagenomics

Thuật ngữ "metagenomics" lần đầu tiên đƣợc đƣa ra năm 1985 bởi

nhóm nghiên cứu của Handelsman (Handelsman et al., 1998).

“Metagenomics” là phƣơng pháp phân tích hệ vi sinh vật các loài vi sinh vật

trong các phức hệ vi sinh vật thu trực tiếp từ môi trƣờng tự nhiên mà không cần

nuôi cấy thông qua phƣơng pháp đọc trình tự (Handelsman et al., 1998;

Handelsman and Sjoling, 2007, Chen and Patcher 2005; Riesenfeld et al.,

2004; Schloss et al., 2004; Susannah and Edwward 2005; Patrick et al., 2005).

Đây là một ngành khoa học mới nhằm cung cấp cho các nhà khoa học công cụ

tiếp cận với hầu hết các loài vi sinh vật khó nuôi cấy trên môi trƣờng nhân tạo.

Do đó, metagenomics cho phép nghiên cứu sự đa dạng của hệ vi sinh vật mà

chƣa từng đƣợc nghiên cứu trƣớc đây, vì vậy cung cấp một nhận thức hoàn toàn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

13

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

mới về cấu trúc và chức năng của hệ sinh thái cúng nhƣ sự đa dạng của đại

dƣơng và hệ tiêu hóa của con ngƣời. Nhƣ đã biết, chỉ có khoảng 0,1 đến 10%

trong tổng số lƣợng các loài vi sinh vật đã đƣợc quan sát trong tự nhiên là có thể

nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm. Những sinh vật không thể nuôi cấy

trên môi trƣờng nhân tạo này đôi khi là độc nhất và có những tiềm năng độc đáo

nhƣ phân hủy rác thải hay tổng hợp các hợp chất có thể sử dụng nhƣ là thuốc

hay kháng sinh. Metagenomics là một công cụ mạnh mẽ trong việc tiếp cận với

các nguồn tài nguyên vi sinh vật mà chƣa đƣợc khai thác về đa dạng sinh học

trong các mẫu thu từ môi trƣờng. Metagenomics đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ

của hệ thống điều tra, phân loại và thao tác toàn bộ vật liệu gen phân lập từ môi

trƣờng. Quá trình đa bƣớc này dựa vào 4 bƣớc chính: (1) phân lập các vật liệu

gen; (2) thao tác trên các vật liệu gen này; (3) xây dựng thƣ viện gen; (4) phân

tích các vật liệu gen trong các thƣ viện metagenomic.

Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới và có thể áp dụng rộng rãi

trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học. Mặc dù đã có những bƣớc phát

triển trong biểu hiện các gen khác nhau, xây dựng thƣ viện gen , nhƣng việc thiết

kế vector cần phải cải tiến hơn nữa. Các kỹ thuật phân tử hiện nay đã đƣợc chứng

minh là có đủ khả năng giải quyết các vấn đề về sản phẩm nhƣ: khám phá ra các

loại kháng sinh và các loại enzime mới. Các nghiên cứu gần đây về tảo biển

(Sargasso Sea) (Venter et al., 2004), Acid mine drainage (AMD) (Tyson et al.,

2004), đất (Tringe et al., 2005) đã sử dụng phƣơng pháp giải trình tự đoạn ngắn

(shotgun-sequencing) để phát hiện và thống kê các mẫu trong các mẫu môi trƣờng

khác nhau. Trong mỗi nghiên cứu, các mẫu môi trƣờng đƣợc thu thập và DNA

đƣợc tách chiết trực tiếp từ các mẫu này, sau đó chúng đƣợc nhân dòng trong E.coli

và các dòng nhân ngẫu nhiên này đƣợc giả trình tự. Tuy nhiên, những thƣ viện gen

này không thể giả thích chức năng của các gen của mỗi sinh vật trong trong hệ vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

14

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

sinh vật. Do đó, khi công nghệ metagenomics kết hợp với kỹ thuật gen , kỹ thuật

protein, phân tích dựa vào sự biểu hiện và kính hiển vi sẽ cung cấp các nhận thức

sâu sắc về các vấn đề nhƣ: tiến hóa gen hay các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí

ẩn vì chúng khó có thể đƣợc nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm (Allen et al.,

2005).

Những sự tiến bộ gần đây trong phân tích metagenomic bắt nguồn dựa vào

phân tích trình tự và chức năng của các mẫu từ nƣớc, đất và liên quan với các tế

bào vật chủ. Ý tƣởng nhân dòng DNA trực tiếp từ các mẫu môi trƣờng đƣợc đƣa ra

đầu tiên bởi Pace (Pace et al., 1985), sau đó năm 1991 đã nhân dòng thành công

vector phage (Schmidt et al., 1991). Các bƣớc cải tiến tiếp theo đã đƣợc xây dựng

một thƣ viện metagenomic với DNA bắt nguồn từ hỗn hợp các sinh vật đƣợc nuôi

trên cỏ khô trong phòng thí nghiệm (Healy et al., 1995). Công việc của nhóm

DeLong đã đƣa tiếp nối các thành công của lĩnh vực này khi nhóm đã thực hiện

thành công việc lập thƣ viện từ các loài nhân sơ từ nƣớc biển (Stein et al., 1996).

Mặt khác, một thách thức lớn để tiếp cận với việc phân tích metagenomic là việc

xác định các dòng gen chức năng. Sự thành công yêu cầu sự phiên mã và dịch mã

chính xác gen bao gồm phân tích năng của gen để xác định các loại kháng sinh mới

(Courtois et al., 2003; Gillespie et al., 2003), các loại gen kháng kháng sinh (Diaz

Torres et al., 2003; Riesenfeld et al., 2004), vẩn chuyển Na_Li/(H) (Majernik et al.,

2001) và các loại enzyme phân hủy (Healy et al., 1995; Henne et al., 1999; 2000).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

15

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

1.2.3. Ứng dụng công nghệ metagenomic trong nghiên cứu đa dạng của

các hệ vi sinh vật đất

Hình 1.2. Các bƣớc thực hiện phân tích, đánh giá nguồn gen vi sinh vật

bằng công nghệ metagenomics

Hệ vi sinh vật trong môi trường đất: môi trƣờng đất rất phức tạp khi

nghiên cứu số lƣơng và sự đa dạng các loài trong hệ vi sinh vật. Một ví dụ nhƣ: một gram của đất rừng có chứa khoảng 4x107 tế bào sinh vật nhân sơ, trong khi đó 1 gram của đất trồng trọt và đồng cỏ có chứa khoảng 2x109 tế bào sinh vật

nhân sơ. Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác nhau, số lƣợng

các sinh vật nhân sơ đƣợc xác định từ khoảng 2000 đến 18000 bộ gen trên một

gram đất. Số lƣợng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài hiếm và chƣa

đƣợc biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích. Do đó, số lƣợng và sự đa

dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất nhiều (16177

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

16

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

loài đã đƣợc xác định bởi National Center for Biotechnology Information vào

năm 2005).

Đất là một môi trƣờng thích hợp của vi sinh vật vì nó có chứa các khoáng

chất với các kích cỡ, hình dạng và tính chất khác nhau kết hợp cùng với hệ vi

sinh vật đất và các hợp chất hữu cơ trong các quá trình phân hủy. Các dạng đất

sét hữu cơ phức tạp và sự ổn định của các phân tử đất sét, cát và phù sa thông

qua sự tập hợp là các tính chất cấu trúc nổi bật của hỗn hợp đất. Các khu hệ vi

sinh cho các vi sinh vất đất bao gồm bề mặt của các thành phần của đất và các

cấu trúc lỗ phức tạp có trong đất.

Trong khi đó, phƣơng pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để

khám phá và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất.

Kỹ thuật độc lập với nuôi cấy: Để vƣợt qua các hạn chế trong phƣơng

pháp nuôi cấy trực tiếp vi sinh vật đất, một phƣơng pháp phân tử dựa trên sự

phân lập và phân tích các nucleic acid trong đó chủ yếu là DNA từ các mẫu đất

mà không cần nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đã đƣợc phát triển. Các khảo sát

phát sinh loài vẫn tiếp tục với việc sử dụng phƣơng pháp PCR với ở gen 16S

rRNA của vi sinh vật đất sử dụng các cặp mồi phổ biến cho vi khuẩn và cổ

khuẩn. Những khảo sát này cho phép liệt kê và so sánh sự đa dạng trong các môi

trƣờng sống khác nhau, phân tích sự thay đổi trong cấu trúc hệ sinh thái do sự

thay đổi của các tác nhân. Các gen chỉ thị khác đƣợc sử dụng để nghiên cứu sự

đa dạng hệ vi sinh vật bao gồm dnaK (HSP-70-type molecular chaperone) và

amoA (ammonia monooxygenase). Tuy nhiên, các nghiên cứu về sự đa dạng của

môi trƣờng đất vẫn chỉ mới bắt đầu.

Xây dựng thư viện gen DNA: Mặc dù việc lập thƣ viện gen của vi sinh vật

đất là phụ thuộc vào kích cỡ của metagenome vi sinh vật đất và số lƣợng lớn các

dòng gen và yêu cầu hiểu biết đầy đủ về chúng là một nhiện vụ phức tạp và khó

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

17

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

khăn. Việc nghiên cứu metagenomic ở vi sinh vật đất phải thông qua việc xây

dựng thƣ viện DNA và xác định chức năng của các gen có trong thƣ viện này.

Những năm gần đây, các tiến bộ mới trong phƣơng pháp đọc trình tự đã mang

đến bƣớc đột phá mới trong việc xây dựng thƣ viện gen, giảm bớt đáng kể các

bƣớc thực hiện trong công nghệ metagenomics (Metzker 2010; Mardis 2008).

Công nghệ này đã góp phần xác định vai trò của các vi sinh vật khác nhau trong

phức hệ vi sinh vật đất, nghiên cứu phân tích hệ vi sinh vật của các mẫu đất khác

nhau và sản xuất các chế phẩm mới từ vi sinh vật đất. Trong các nghiên cứu gần

đây, nhiều gen mã hóa các enzyme có ích và kháng sinh đã đƣợc phát hiện nhờ

nghiên cứu phân tích thƣ viện gen của các vi sinh vật đất, việc xác định các gen

mới này đã nói lên tiềm năng to lớn của việc xây dựng và phân tích thƣ viện gen

của các vi sinh vật đất (Hardeman and Sjoling 2007; Lussier et al., 2011).

Nhƣ vậy mặc dù gặp phải những trở ngại khó khăn ban đầu nhƣ quá trình

tách DNA khỏi các tạp chất, số lƣợng khổng lồ các vi sinh vật tồn tại trong môi

trƣờng đất, xây dựng thƣ viện metagenomic, xác định chức năng của các gen

mới v.v… nhƣng cùng với những bƣớc phát triển đột phá trong phƣơng pháp

đọc trình tự và công cụ tin sinh học công nghệ metagenomics hiện nay đã đạt

đƣợc những thành tựu đáng kể và ngày càng đƣợc quan tâm phát triển hơn. Ứng

dụng công nghệ metagenomics đã xác định đƣợc phần lớn các vi sinh vật có mặt

trong môi trƣờng đất, so sánh mức độ đa dạng giữa các môi trƣờng khác nhau,

đánh giá sự thay đổi về cấu trúc thành phần của hệ vi sinh vật dƣới tác động của

các tác nhân khác nhau lên môi trƣờng. Ngày nay số lƣợng lớn dữ liệu thu đƣợc

từ công nghệ metagenomics đã đƣợc công bố rộng rãi, không những tạo điều

kiện thuận lợi cho các nhà khoa học nghiên cứu phân tích các gen mới mà còn

mở ra những hƣớng mới góp phần cải thiện nâng cao sản xuất nông nghiệp,

công nghiệp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

18

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật metagenomics và xây dựng thƣ viện

metagenom cho phép đánh giá đa dạng di truyền và phƣơng pháp trao đổi chất

của các vi sinh vật không thể nuôi cấy trong quần thể vi sinh vật (Handelsman

2004; Iqbal et al., 2012). Các vector tách dòng thích hợp cho nghiên cứu

metagenomics bao gồm BAC, cosmid và plasmid. Phân tích các dòng vô tính ở

các bƣớc tiếp theo có thể thực hiện bằng cách đọc trình tự hoặc thông qua các

công cụ sàng lọc chức năng. Việc phân tích dựa trên kết quả đọc trình tự có thể

tiến hành theo phƣơng pháp shotgun metagenome hoặc touchdown PCR với các

cặp mồi đặc hiệu cho các gen quan tâm (Iqbal et al., 2012).

1.3. Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới trong nghiên cứu

metagenomics

1.3.1. Các thế hệ máy giải trình tự trên thế giới

Ngày nay, các công ty thƣơng mại trên thế giới đã cho ra đời các thế hệ

máy đọc trình tự dựa trên nhiều công nghệ mới (Next Generation Sequencing -

NGS). Các kỹ thuật đọc trình tự gen đã trở nên đơn giản và nhanh hơn nhờ sự

ứng dụng huỳnh quang phân tích tự động (Olsvik et al., 1993; Pettersson et al.,

2009). Các công nghệ đọc trình tự mới luôn hƣớng tới làm tăng dung lƣợng

(throughput), làm giảm thời gian và giá thành (Schadt et al., 2010). Mặc dù vậy,

phƣơng pháp Sanger (dựa trên cơ sở kết hợp của các dideoxynucleotide

(ddNTP) bằng DNA polymerase trong quá trình khuếch đại DNA in vitro) đƣợc

sử dụng rộng rãi trong nhiều năm trƣớc đây vẫn đƣợc thực hiện xen kẽ khi cần

thiết (Sanger et al., 1977).

Đọc trình tự đƣợc thực hiện sau phản ứng khuếch đại DNA (nhƣ ở

phƣơng pháp Sanger) đƣợc thay thế bằng đọc trình tự thực hiện ngay trong giai

đoạn tổng hợp sợi DNA bổ sung cho sợi khuôn (phƣơng pháp pyrosequencing)

(Nyrén, 2007; Ronaghi et al., 1996, 1998). Đây là công nghệ khởi đầu cho kỹ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

19

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

thuật “đọc trình tự bằng tổng hợp”, nền tảng của kỹ thuật đọc trình tự bộ gen hay

còn gọi là kỹ thuật đọc trình tự thế hệ mới sau này. Với ƣu thế thời gian đọc

nhanh, trình tự đọc đƣợc rất chính xác, cƣờng độ phát quang định lƣợng đƣợc

nên dù trình tự đọc đƣợc không dài (<100 bases) nhƣng pyrosequencing thể hiện

rõ ƣu thế hơn hẳn phƣơng pháp Sanger và trở thành một kỹ thuật không thể

thiếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử (Poehlmann et al., 2007).

Nguyên lý đọc trình tự gen thế hệ mới: theo 2 nguyên lý chính bao gồm

đọc trình tự bằng tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS) đã đƣợc các thế hệ

máy Roche 454, Ion Torrent và Illumina sử dụng. SBS liên quan đến việc sử

dụng một hỗn hợp các dNTP đƣợc biến đổi tại vị trí 2’ bao gồm các dNTP bổ

sung tự nhiên và có đánh dấu huỳnh quang. Quá trình xác định trình tự sẽ diễn

ra tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR. Về mặt lý thuyết, độ dài đoạn đƣợc đọc bằng

SBS có thể lên đến hàng trăm base. Nguyên lý thứ hai đó là đọc trình tự gắn nối

(sequencing by ligation, SBL) đƣợc sử dụng ở máy SOLiD do George Church

phát minh. SBL đã đƣợc sử dụng để xác định trình tự genome và là nền tảng cho

các thiết bị đọc trình tự thế hệ mới. SBL là một chu trình tuần hoàn gồm 4 bƣớc.

SBL hoạt động trong cả hai chiều: chiều xuôi (5 'đến 3') và chiều ngƣợc (3 'đến

5') (Margulies et al., 2005; Schuster, 2008; Rusk, 2011, Mardis, 2008, Valouev

et al., 2008).

1.3.2. Công nghệ giải trình tự Illumina (Solexa) sequencing

Nguyên lý công nghệ

Công nghệ giải trình tự của Illumina sử dụng các array đơn dòng và công

nghệ khóa dừng thuận nghịch cho việc giải trình tự trên diện rộng với độ chính

các cao. Hệ thống giải trình tự linh hoạt, hiện đại cho phép thực hiện một loạt

các ứng dụng nghiên cứu genomics, transcriptomics, và epigenomics. Các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

20

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

template giải trình tự đƣợc cố đình trên bề mặt một flow cell (1 loại chip DNA)

đƣợc thiết kế để tạo ra 1 dạng DNA hỗ trợ hoạt động các enzyme trong khi đảm

bảo độ bền của các template bám trên bề mặt và mức độ bám trên bề mặt và

mức độ bám không đặc hiệu thấp của các nucleotide đánh dấu huỳnh quang.

Quá trình nhân bản trên pha rắn tạo ra tới 1000 bản copy giống hệt nhau của mỗi

template trong trạn thái đứng sát nhai (trong đƣờng kính < 1 µm). Vì quá trình

này không bao gồm việc ghi ảnh, thực hiện thao tác cơ học, hay đặt các hạt bead

vào các giếng, nên mật độ của các cluster trên đơn vị diện tích đƣợc đảm bảo.

Công nghệ giải trình tự bằng tổng hợp (SBS) sử dụng 4 nucleotide đánh

dấu huỳnh quang để giải trình tự hàng chục triệu cluster đồng thời trên bề mặt

flow-cell. Trong mỗi chu trình giải trình tự, một deoxynucloside triphosphate

đánh dấu (dNTP) đƣợc thêm vào chuỗi acid nucleic. Nhãn huỳnh quang của

nucleotide đóng vai trò nhƣ một khóa dừng phản ứng polymer hóa, do đó sau

khi mỗi dNTP đƣợc tích hợp, dye huỳnh quang đƣợc ghi lại để xác định

nucleotide và sau đó bị cắt bỏ để tổng hợp nucleotide tiếp theo. Vì cả 4 loại

dNTP gắn khóa dừng tổng hợp thuận nghịch có mặt đồng thời dƣới dạng đơn

phân tử, sự cạnh tranh ngẫu nhiên giúp giảm thiểu việc tổng hợp mất cân đối.

Việc xác định các base dựa trực tiếp vào cƣờng độ tín hiệu đo đƣợc trong mỗi

chu trình, từ đó giảm thiểu các sai số thô so với công nghệ khác.

Ưu nhược điểm của hệ thống

Phƣơng pháp giải trình tự của Illumina dựa trên số lƣợng cực lớn các

đoạn đọc trình tự đồng thời. Khối lƣợng mẫu lớn và độ bao phủ đồng nhất đƣợc

sử dụng để tạo ra một tổng thể và một độ tin cậy cao đƣợc đảm bảo trong việc

xác định các biến dị di truyền. Khối lƣợng mẫu lớn cho phép sử dụng các công

cụ thống kê và cho điểm, tƣơng tự nhƣ các phƣơng pháp truyền thống trong việc

xác định thể đồng hợp, dị hợp và phân biệt các lỗi giải trình tự. Mỗi base đọc thô

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

21

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

có một điểm số chất lƣợng do đó phần mềm có thể sử dụng một số công cụ định

lƣợng trong việc xác định sự sai khác và cho điểm số tin cậy.

Phần mềm thu nhận dữ liệu của Illumina cho phép ngƣời dùng xếp các

trình tự vào một vùng tham chiếu (mẫu) của các ứng dụng giải trình tự. Đƣợc

phát triển dựa trên sự hợp tác của các nhà nghiên cứu, phần mềm bao gồm các

module thu nhận dữ liệu, xử lý và phân tích tạo thành một chuỗi thu nhận và xử

lý dữ liệu với sự can thiệp ít nhất từ ngƣời sử dụng. Định dạng mở của phần

mềm cho phép dễ dàng truy nhập dữ liệu tại nhiều giai đoạn của quá trình xử lý

và phân tích dữ liệu sử dụng các giao duện chƣơng trình đơn giản.

Một quy trình một chiều, khả năng tự đông hóa cao yêu cầu thời gian thao

tác ít nhất. Với khả năng tạo ra hàng Gb dữ liệu DNA trong một lần chạy, ngay

cả các genome lớn của các động vật có vú có thể giải trình tự trong một vài tuần

thay vì một vài năm nhƣ trƣớc kia. Khả năng chạy nhiều mẫu trên 1 flow cell

đồng nghĩa với việc có thể thực hiện nhiều ứng dụng trong một lần chạy.

Một nhƣợc điểm của hệ thống máy giải trình tự của Illumina đó là việc sử

dụng các hóa chất và các thiết bị có giá thành ở mức cao. Chính vì vậy, với

nhƣng nghiên cứu ở quy mô nhỏ với kinh phí thấp sẽ ít có cơ hội đƣợc thực hiện

trên hệ thống này.

Ứng dụng của công nghệ Illumina

Ứng dụng của hệ thống giải trình tự Illumina là rất đa dạng, hệ thống này

cho phép các nhà khoa học nghiên cứu nhiều lĩnh vực trong ngành khoa học sự

sống. Illumina cho phép giải mã một hệ gen hoàn chỉnh trong thời gian ngắn, so

sánh với các công nghệ trƣớc đây. Cụ thể trong việc giải mã một hệ gen ngƣời

hoàn chỉnh, với các công nghệ trƣớc đây chúng ta phải mất tới 10 năm, thì hiện

nay với công nghệ Illumina chúng ta chỉ mất tới 4 ngày. Công nghệ này cho

phép ứng dụng trong lĩnh vực y tế và bảo vệ sức khỏe cộng đồng, thông qua việc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

22

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

giải mã hệ gen của các vi sinh vật, các virus, các tác nhân gây bệnh; phân tích,

phát hiện các điểm đột biến; phân tích các hệ gen phiên mã. Bên cạnh đó, với

các nghiên cứu về biểu hiện gen phục vụ công nghiệp dƣợc đáp ứng thuốc,

nghiên cứu sự tác động của thuốc tới tế bào, Ứng dụng của Illumina cho phép

thay thế các công cụ trƣớc đây, cụ thể nhƣ microarray. Ngoài ra các công nghệ

hiện nay vẫn đang cải tiến liên tục, cho phép phát triển nhiều hơn nữa các ứng

dụng phục vụ trong đa dạng các lĩnh vực (Ayman and Weinbrecht 2013).

1.4. Các nghiên cứu metagenomics trên thế giới và Việt Nam

Các nghiên cứu từ trƣớc cho thấy rằng phần lớn các vi sinh vật tồn tại

trong môi trƣờng xung quanh chúng ta không thể nuôi cấy trên môi trƣờng nhân

tạo trong phòng thí nghiệm và do đó không thể xác định trình tự DNA cũng nhƣ

nghiên cứu phân tích (Amann et al., 1995). Những nghiên cứu đầu tiên về

metagenomics đã tập trung phân tích trình tự 16S rRNA, những trình tự này

thƣờng ngắn, mang tính bảo thủ cao trong cùng một loài và khác nhau giữa các

loài (Woese 1987; Beja et al., 2002). Các nhà khoa học đã phát hiện nhiều trình

tự 16S rRNA đƣợc tìm thấy không thuộc về bất kỳ loài nào đã đƣợc phân lập

trƣớc đây. Điều này cho thấy rằng đã có rất nhiều loài vi sinh vật bị bỏ sót

không đƣợc nghiên cứu đến. Phân tích trình tự các đoạn 16S rRNA thu trực tiếp

từ môi trƣờng tự nhiên cho thấy rằng bằng phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống,

chúng ta chỉ có thể nghiên cứu đƣợc khoảng 1% số lƣợng các loài vi sinh vật tồn

tại trong mẫu tự nhiên thu đƣợc (Hugenholz et al., 2002). Theo Amann et al.

(1995) bằng các phƣơng pháp vi sinh truyền thông chỉ có thể nuôi cấy khoảng

0.001–0.1% các loài vi sinh vật biển, 0.25% loài vi sinh vật nƣớc ngọt, 0.25%

trong trầm tích và chỉ 0.3% sinh vật đất (Amann et al., 1995).

Công nghệ metagenomics ra đời đã khắc phục đƣợc những hạn chế của các

phƣơng pháp truyền thống, hƣớng sự tập trung nghiên cứu vào các vi sinh vật chƣa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

23

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

đƣợc chú ý đến. Bằng cách phân lập và nghiên cứu trực tiếp genome của toàn bộ

các vi sinh vật tồn tại trong một môi trƣờng nghiên cứu, ta có thể có thông tin di

truyền của hệ vi sinh vật ở đó mà không cần phải phân lập và nuôi cấy từng tế bào

riêng lẻ.

Ngƣời đầu tiên đƣa ra ý tƣởng nhân bản trực tiếp các mẫu DNA từ môi

trƣờng là Pace và cộng sự, họ đã chứng minh sự tồn tại của một hệ sinh vật phức

tạp chƣa từng đƣợc nghiên cứu đến (Pace et al., 1986). Năm 1991, Pace and

Delong đã công bố nghiên cứu phân lập các gen cấu trúc từ thƣ viện gen của hệ

vi sinh vật phát triển trên cỏ khô trong điều kiện phòng thí nghiệm (Pace and

Delong 1991). Năm 2002, Breitbart et al. (2002) sử dụng công nghệ

metagenomics cho thấy trong 200 lít nƣớc biển chứa hơn 5000 loại virus khác

nhau (Breitbart et al., 2002). Các nghiên cứu sau đó cho thấy rằng có hơn một

nghìn loài virus trong phân của con ngƣời và khoảng một triệu loại virus khác

nhau cho mỗi kg trầm tích biển, bao gồm cả thể thực khuẩn (Torsvik et al.,

2002; Turnbaugh et al., 2007; Tringe et al., 2005; Rusch et al., 2007). Về cơ

bản tất cả các virus đã đƣợc phát hiện trong các nghiên cứu này đều là những

loài chƣa từng đƣợc phát hiện. Năm 2004, Tyson và các đồng nghiệp tại Đại học

California, Berkeley đã xác định trình tự DNA của hệ vi sinh vật có trong nƣớc

thải nhiễm acid (Tyson et al., 2004). Đây là một bƣớc tiến quan trọng xác định

đƣợc bộ gen hoàn chỉnh, hoặc gần nhƣ hoàn chỉnh của một số vi khuẩn mà trƣớc

đây chƣa nuôi cấy thành công (Hugenholz 2002).

Từ năm 2003, Venter đã đi vòng quanh trái đất bằng đƣờng biển nhằm thu

thập các mẫu và sử dụng công nghệ metagenomics với mục đích xác định các

genome (và theo đó là các sinh vật) mới. Dự án thí điểm, tiến hành trong vùng

biển Sargasso, phát hiện DNA của gần 2000 loài khác nhau, trong đó có 148 loài

vi khuẩn chƣa bao giờ đƣợc xác định trƣớc đây (Venter et al., 2004). Phân tích

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

24

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

hệ sinh vật đất sử dụng công nghệ metagenomics xuất hiện chậm hơn so với

những nghiên cứu phân tích hệ sinh vật biển do trong đất thƣờng tồn tại những

hợp chất liên kết với DNA hoặc ức chế phản ứng PCR, gây khó khăn cho việc

nhân bản các mẫu DNA từ đất (Daniel, 2005). Tuy nhiên trong những năm gần

đây những tiến bộ đáng kể trong nghiên cứu hệ vi sinh vật đất, xây dựng các thƣ

viện gen của các vi sinh vật này đã giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về hệ sinh

vật phức tạp này (Kakirde et al., 2010; Parachin et al., 2011).

Các tiến bộ trong kỹ thuật đọc trình tự DNA đã mở ra phƣơng pháp tiếp

cận mới cho công nghệ metagenomics. Năm 2006, các nhà khoa học tại Đại học

Penn State đã công bố các trình tự thu đƣợc từ một mẫu môi trƣờng bằng

phƣơng pháp pyrosequencing sử dụng kỹ thuật đọc trình tự 454 – kỹ thuật cho

phép đọc tới 400-600 megabases DNA chỉ trong vòng 10 giờ (Poinar et al.,

2006). Kỹ thuật này ra đời cho phép đọc trình tự nucleotit của hệ sinh vật ở quy

mô lớn trong một thời gian ngắn (Edwards et al., 2006). Gần đây công nghệ sinh

học đã thay đổi cách tiếp cận trong việc xác định các gen mới, nghiên cứu chức

năng của các gen, phân tích thành phần loài và các hệ vi sinh vật... Kỹ thuật

metagenomics là một lĩnh vực nghiên cứu mới, đang phát triển mạnh mẽ trong

hơn một thập kỷ qua, đã giúp xác định hệ gen của các vi sinh vật không thể nuôi

cấy, một mặt hoàn thiện những hiểu biết của con ngƣời về các loài vi sinh vật

trên trái đất, mặt khác góp phần giải quyết nhu cầu tìm kiếm các enzyme và hợp

chất sinh học có ích (Schmeisser et al., 2007; Bomar et al., 2011).

Các nghiên cứu phân tích thành phần và hoạt động của các hệ vi sinh vật

tự nhiên cho thấy tiềm năng sản xuất từ các vi sinh vật này các hợp chất sinh học

có giá trị cao sử dụng trong y tế nhƣ thuốc kháng sinh, các chất chống ung thƣ

và ức chế miễn dịch (Raaijmakers et al., 2002). Sử dụng kỹ thuật metagenomic

để đánh giá tiềm năng và hoạt tính sinh học của quần thể vi sinh vật không

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

25

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

thông qua nuôi cấy theo phƣơng pháp cổ điển đã cho thấy tiềm năng ứng dụng

kỹ thuật metagenomic trong nghiên cứu khái thác đa dạng sinh học vi sinh vật là

rất lớn (Hochmuth et al., 2010; Nikolouli and Mossialos 2012).

Tại Việt Nam, Thi Huyen Do (2014) đã tiến hành đề tài nghiên cứu

metagenomic của các gen phân hủy sinh khối của vi khuẩn sống trong ruột của

mối với máy đọc trình tự Illumina. Kết quả của nghiên cứu đã thu đƣợc 5.6 Gb

dữ liệu về gen trong ruột mối Coptotermes gestroi. Trong đó, có 5,4 Gb dẽ liệu

có ích: 125,431 trình tự ORF chứa hơn 78 triệu bp và có hơn 80% dữ liệu của vi

khuẩn. Nghiên cứu cũng chỉ ra 12 loài vi khuẩn có mặt nhiều nhất và xác định

đƣợc hơn 1460 loài. Ngoài ra, trong hơn 125 nghìn ORF, nghiên cứu đã xác

định đƣợc có khoảng 12 nghìn ORF liên quan đến chuyển hóa carbonhydrate.

Có khoảng 587 ORF mã hóa enzyme phân hủy cellulose, hemicelluloses và

pectin, trong đó có khoảng 316 ORF liên quan đến phân hủy cellulose.

Việc áp dụng công nghệ metagenomics vào nghiên cứu hệ gen của vi sinh

vật đất đã, đang và sẽ đóng vai trò to lớn trong các nghiên cứu tiếp theo. Tuy

nhiên, tại Việt Nam chƣa có nhiều các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật

metagenomic trong nghiên cứu hệ vi sinh vật đất nói chung cũng nhƣ hệ vi sinh

vật rễ cây dó bầu nói riêng. Vì vậy, nghiên cứu này tập trung vào đánh giá các

hệ vi sinh vật ở các địa điểm trồng dó bầu khác nhau ứng dụng kỹ thuật

metagenomic.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

26

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

II. VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu – Hóa chất nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu: 3 mẫu đất rừng tại vùng rễ cây dó bầu đƣợc thu tại

Sơn Dƣơng (Tuyên Quang); Nha Trang (Khánh Hòa); Phú Quốc (Kiên Giang)

đƣợc kí hiệu lần lƣợt là TQ, NT, PQ.

Hình 2.1. Bản đồ vị trí thu mẫu đất tại 3 tỉnh

Hóa chất: Bộ Kit PowerSoil® DNA Isolation (MO BIO) cho quá trình

tách DNA từ đất, Bộ kit KAPA2G Robust HotStart Ready Mix (Kapa

Biosystems), Agencourt AMPure XP DNA purification kit (Beckman Coulter),

Nextera XT index kit (Illumina). Hóa chất dùng trong điện di DNA: agarose,

TAE 1X (Tris - Acetic acide - EDTA), ethidium bromide.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

27

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Máy móc, thiết bị: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ),

máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-

transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia

Biotech, Thuỵ Điển), máy vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, Qubit

(Invitrogen; LifeTechnologies Europe BV, Monza, Italy), Agilent 2100

Bioanalyser (Agilent Technologies), cùng với các trang thiết bị khác của

phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp thu mẫu đất

Địa điểm thu mẫu đƣợc định vị tại vùng rễ của các cây Dó bầu khỏe mạnh

từ 5 đến 7 năm tuổi. Các mẫu đất đƣợc thu thập vào cùng một thời điểm vào

mùa khô tháng 8 năm 2013. Tại các vị trí lấy mẫu, phần đất bề mặt đƣợc loại bỏ.

Đất tại vùng rễ đƣợc thu thập bằng cách đào tại độ sâu khoảng 30 cm. Tại mỗi khu vực lấy mẫu khoảng 25 m2 gồm khoảng 3 cây dó bầu, chúng tôi tiến hành

lấy mẫu đất tại 9 vị trí nhƣ trên hình.

Hình 2.2. Vị trí tiến hành thu mẫu tại một khu vực nghiên cứu

Sau khi loại bỏ toàn bộ các viên đá lớn, đất tại 9 vị trí trong 1 khu vực

đƣợc gộp làm một, trộn đều, và sau đó chuyển vào các ống corning 50 ml. Mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

28

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

đất đƣợc bảo quản trong điều kiện tối và ở -20oC tới khi tiến hành các thí

nghiệm tiếp theo.

2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Các mẫu đất thu tại các vùng trồng dó bầu đƣợc tiến hành tách chiết DNA bằng bộ Kit PowerSoil® DNA Isolation. DNA sau khi tách thành công đƣợc tiến

hành do nồng độ và độ tinh sach bằng máy Nano drop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20oC.

B1: Thêm 0,25 gam mẫu đất vào ống PowerBead

B2: Lắc hoặc vortex để trộn đều mẫu

B3: Kiểm tra Giải dung dịch C1. Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60  C cho đến

khi tan trƣớc khi sử dụng

B4: Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngƣợc nhiều lần hoặc lắc thời gian

ngắn.

B5: vortex 5-10p tốc độ tối đa

B6: ly tâm 10.000g 30s ở nhiệt độ phòng, lƣu ý nếu li tâm > 10.000g có

thể ống sẽ vỡ

B7: Chuyển nổi sang ống 2 ml, thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl

B8: Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây. Ủ ở 4  C trong 5 phút

B9: Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g

B10: chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhƣng không nhiều hơn 600 l

B11: Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn. Ủ ở 4  C trong

5 phút

29

B12: Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

B13: chuyển dich nổi vào ống 2 ml không nhiều quá 750 l

B14: Lắc để trộn đệm C4 trƣớc khi sử dụng. Thêm 1200 l đệm C4, lắc

hoặc vortex 5 giây

B15: cho 675 l vào bộ lọc Spin và ly tâm ở 10.000 xg trong 1 phút ở

nhiệt độ phòng, đổ dich qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch

B16: Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở

10.000 xg

B17: Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột

B18: Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút ở 10.000 xg

B19: chuyển thận đặt bộ lọc sang ống 2 ml sạch

B20: Thêm 100 l đệm C6

B21: Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở 10.000 x g.

2.2.3. Phương pháp xác định trình tự vùng 16S RNA

Theo Zuckerkand and Pauling (1965) cho rằng các phân tử sinh học có

thể là “thƣớc đo tiến hóa” và chúng có các đặc điểm sau: phân tử có mặt ở tất cả

các sinh vật; phân tử không đƣợc truyền qua lại giữa các loài; trình tự của các

phân tử này phải có độ bảo tồn và biến động thích hợp với khoảng cách tiến hóa;

phân tử phải có kích thƣớc đử lớn để chứa nhiều thông tin. Một thập kỷ sau đó

Woese et al. (1977) đã xác định đƣợc 16S là phân tử thích hợp làm thƣớc đo tiến

hóa: 16S là phân tử cổ, chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ

thống sống và có độ bảo tồn vừa phải.

Trình tự mồi: các mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu để khuếch đại vùng

V3 và V4 của 16S rRNA với kích thƣớc lý thuyết khoảng 550 bp.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

30

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân hai vùng V3 và V4 (16S Illumina

primers)

Kích Têm mồi 5’-3’ primer thƣớc

TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA 50 bp 16S F GACAGCCTACGGGNGGCWGCAG

GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAG 55 bp 16S R AGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC

Thành phần phản ứng PCR:

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR để nhân hai vùng V3 và V4

Thành Phần Thể tích

DNA vi sinh vật (5 ng/µl) 2,5 µl

Mồi xuôi 16S Amplicon PCR 1 µM 5 µl

Mồi ngƣợc 16S Amplicon PCR 1 µM 5 µl

2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12,5 µl

25 µl Tổng

Chu trình PCR:

25 chu kỳ

95oC 30 giây

95oC 3 phút

72oC 30 giây

72oC 5 phút

4oC

55oC 30 giây

∞

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

31

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Hình 2.3. Chu trình PCR nhân phân đoạn V3 và V4 trên phân tử

16S rRNA

Bổ sung 1 µl sản phẩm PCR vào Bioanalyzer DNA 1000 chip để kiểm

định kích thƣớc. Kích thƣớc dự kiến sau khuếch đại là 550 bp. Sau khi kiểm tra

các sản phẩm đƣợc khuếch đại theo đúng tính toán lý thuyết, các sản phẩm này

sẽ đƣợc tiến hành tinh sạch để phục vụ cho bƣớc tiếp theo.

2.2.4. Gắn Adapter

Các mẫu sau khi tách chiết DNA sẽ đƣợc gắn các adapter để phân biệt

đƣợc chúng trong qua trình xử lý kết quả. Adapter sẽ đƣợc gắn theo bộ kit

Nextera XT Index kit và theo quy trình sau:

Thành phần phản ứng:

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn adapter

Thành Phần DNA Nextera XT Index Primer 1 Thể tích 5 µl 5 µl

Nextera XT Index Primer 2 5 µl

2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix Nƣớc khử ion Tổng 25 µl 10 µl 50 µl

Chạy PCR với chu trình phản ứng:

8 chu kỳ

95oC 30 giây

95oC 3 phút

72oC 30 giây

72oC 5 phút

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 4oC

55oC 30 giây

32

∞

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Hình 2.4. Chu trình gắn index

Sản phẩm sau khi đƣợc gắn Index và nhân lên sẽ đƣợc tinh sạch sản phẩm

Đánh giá thư viện: sản phẩm sẽ đƣợc kiểm tra trên máy Bioanalyser chip,

lựa chọn quy trình V3 và V4 primer, kích thƣớc tính toán trên máy là 630 bp.

Giả trình tự trên máy Miseq: sau khi đánh giá việc lập thƣ viện thành

công, thƣ viện DNA sẽ đƣợc tiến hành biến tính và giải trình tự với chu trình lựa

chọn 16S Metagenomics workflow (quy trình phân tích 16S).

Phân tích dữ liệu: đƣợc thực hiện thông qua công cụ Qiime: trong đó các

trình tự vùng V3 và V4 của đoạn 16S rRNA của một mẫu đƣợc lắp ráp dựa trên

các contig và với các tham số mặc định. Các trình tự chứa các thông tin nhiễu,

các vị trí base có độ tin cậy thấp, các đoạn đọc có kích thƣớc nhỏ hơn 400 bp

hoặc lớn hơn 460 đƣợc loại bỏ. Dữ liệu đáng tin cậy sẽ đƣợc so sánh thẳng hàng

với các trình tự đã công bố dựa trên cơ sở dữ liệu SILVA. Số lƣợng các đơn vị

phân loại (OTUs) có mức độ tƣơng đồng lần lƣợt 97%, 95% và 90% đƣợc sử

dụng để tính toán các giá trị ACE (abundance based coverage estimator), CHAO

(richness), Shannon, Simpson đối với từng mẫu. Kết quả sau khi phân tích đƣợc

đƣa vào phần mềm MEGAN 5 để so sánh mức độ tƣơng đồng và sai khác giữa

ba hệ vi sinh vật.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

33

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

III. KẾT QUẢ

3.1. Kết quả tách chiết mẫu đất tại 3 địa điểm

Các mẫu đất sau đƣợc tiến hành xác đinh loại đất cũng nhƣ xác định tọa

độ nơi thu mẫu và khi đƣợc giữ tại -80oC.

Bảng 3.1. Tọa độ và nhiệt độ và loại đất tại các nơi thu mẫu

Kí hiệu Khu vực Độ Bắc (N) Độ Tây (E) Loại đất Nhiệt độ (oC)

10o13’22’’ 104o00’46’’ 28,5 Đất cát PQ Phú Quốc, Kiên Giang

21o41’36’’ 105o23’54’’ 34,1 SD Sơn Dƣơng, Tuyên Quang Đất vàng đỏ tích mùn

12o19’17’’ 108o57’49’’ 29,2 Đất cát NT Nha Trang, Khánh Hòa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

34

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Bảng 3.1 cho thấy các loại đất đƣợc thu tại các vị trí độ Bắc và độ Tây

khác nhau. Nhiệt độ tại các nơi này cũng khác nhau, trong đó cao nhất ở Tuyên Quang với 34,1 oC và thấp nhất là Phú Quốc với nhiệt độ là 28,5 oC. Một yếu tố

quyết định khác với thành phần và tỷ lệ hệ vi sinh vật đất là loại đất, trong đó,

tại Phú Quốc là đất cát, Tuyên Quang là đất vàng đỏ, Nha Trang là đất cát.

Các mẫu đất sau khi đƣợc thu tại 3 địa điểm này sẽ đƣợc tách chiết DNA tổng số bằng bộ kit PowerSoil® DNA Isolation. DNA đƣợc tách chiết sẽ đƣợc

kiểm tra bằng điện di trên gel agarose và máy NanoDrop để kiểm tra độ sạch và

hàm lƣợng của mẫu tách. Mẫu đất thu thập tại 3 vùng bao gồm hệ vi sinh vật

nấm, khuẩn và động vật nguyên sinh, vì vậy DNA đƣợc tách chiết sẽ bao gồm

DNA tổng số của vi khẩn nấm và những động vật nguyên sinh này.

DNA sẽ đƣợc tách chiết với 0,7 g đất, DNA sau tách đƣợc điện di kiểm

tra trên gel agarose 1% kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA tổng số

của 3 mẫu đất nghiên cứu; M: Marker 1 kb

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA tổng số trên hình 3.1 cho

thấy DNA đƣợc tách chiết có chất lƣợng tốt, các băng vạch sáng rõ, gọn điều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

35

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

này chứng tỏ DNA thu đƣợc có nồng độ cao và độ tinh sạch tốt. DNA tổng số

đƣợc đo hàm lƣợng và độ tinh sạch bằng máy Nanodrop (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Nồng độ và độ tinh sạch 3 mẫu DNA tách từ đất

STT Mẫu Độ tinh sạch Nồng độ

TQ 1 60,9 ng/µl 1,78

NT 2 45,8 ng/µl 1,81

PQ 3 47,3 ng/µl 1,77

Bảng 3.2 cho thấy DNA của 3 mẫu đƣợc tách chiết với hàm lƣợng cao

45,8 – 60,9 ng/µl, trong đó nồng độ DNA của mẫu TQ có nồng độ cao nhất 60,9

ng/µl, tiếp đến là mẫu thu tại PQ có nồng độ 47,3 ng/µl, thấp nhất là mẫu thu tại

NT 45,8 ng/µl. Độ tinh sạch của cả 3 mẫu DNA đều rất tốt năm trong khoảng từ

1,77 -1,78. Kết quả trên chứng tỏ DNA đƣợc tách chiết có hàm lƣợng và chất

lƣợng tốt, các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn để sử dụng cho những nghiên cứu tiếp

theo.

3.2. Kết quả chuẩn bị thƣ viện và gắn adapter

Kết quả phân tích trên máy Agilent 2100 Bioanalyser (Hình 3.2) cho thấy,

các đoạn DNA sau khi khuếch đại có kích thƣớc khoàng 550 bp tƣơng ứng với

tính toán lý thuyết. Kết quả này khẳng định phản ứng khuếch đại hai phân cùng

V3 và V4 của vùng 16S rRNA đƣợc thực hiện tốt, sản phẩm thu đƣợc đảm bảo

điều kiện để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

36

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Hình 3.2. Biểu đồ ghi lại tín hiệu đo kích thƣớc sản phẩm khuếch đại bằng

cặp mồi 16S

Sau khi thực hiện bƣớc gắn các đoạn index vào các sản phẩm 16S rRNA

đã khuếch đại, sản phẩm thu đƣợc này tiếp tục đƣợc kiểm tra trên máy Agilent

2100 Bioanalyser (Hình 3.3).

Hình 3.3. Biểu đồ ghi lại tín hiệu đo kích thƣớc sản phẩm gắn index

Kết quả sau phản ứng gắn index cho thấy sản phẩm của bƣớc gắn cho

kích thƣớc khoảng 630 bp tƣơng ứng với tính toán lý thuyết. Kết quả nêu trên

khẳng định, phản ứng gắn giữa đoạn 16S rRNA và các index đƣợc thực hiện tốt,

đủ điều kiện để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

3.3. Kết quả giải trình tự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

37

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Sau khi tiến hành phân tích mẫu trên máy giải trình tự thế hệ mới Illimina

thu đƣợc tổng số từ 908.987 (TQ) đến 2.539.017 (NT) trình tự đoạn 16S. Trong

đó, với 2.539.017 trình tự đoạn 16S đọc đƣợc của mẫu Nha Trang, sau khi loại

bỏ các dữ liệu không đáng tin cậy, hơn 96% dữ liệu đã đƣợc chọn lọc để tiến

hành phân tích tiếp theo (Bảng 3.3). Tƣơng tự nhƣ vậy, đối với mẫu thu thập từ

Phú Quốc và Tuyên Quang các giá trị này lần lƣợt là 1.557.573 và 908.987 trình

tự đọc đƣợc; trên 96% và trên 94% các trình tự đáng tin cậy lần lƣợt của các

mẫu Phú Quốc và Tuyên Quang đƣợc lựa chọn để thực hiện các phân tích tiếp

theo.

Bảng 3.3. Thống kê dữ liệu trình tự thu đƣợc sau bƣớc giải trình tự

Tổng số trình tự Số lƣợng trình tự có thể sử dụng Mẫu đọc đƣợc để phân tích (%) Kích thƣớc trung bình

2.539.017 2.445.903(96.33%) NT 441

1.557.573 1.508.944(96.88%) PQ 441

908.987 861.431(94.77%) TQ 441

Đơn vị phận loại (OTUs) đƣợc định nghĩa là một trình tự hay một nhóm

trình tự tƣơng đồng trong dữ liệu mẫu. Căn cứ vào các phân tích trên thế giới,

các OTU thƣờng đƣợc chia theo các mức 0,03; 0,05; và 0,1 tƣơng ứng với mức

độ tƣơng đồng giữa các trình tự trong một OTU là 97%, 95%, và 90% (Bảng

3.4). Từ kết quả phân tích các OTU ở mức độ 0,03 cho thấy, số lƣợng OTU cao

nhất thuộc về hệ vi sinh vật ở khu vực Nha Trang với 160.615 OTU cao gấp đôi

so với hệ vi sinh vật ở khu vực Phú Quốc và gấp 2,5 lần so với hệ vi sinh vật ở

khu vực Tuyên Quang. Bên cạnh đó, từ kết quả phân tích trong bảng 3.4 cho

thấy các giá trị Ace và Chao có tỉ lệ tƣơng ứng. Ace và Chao là hai chỉ số cho

phép ƣớc lƣợng số lƣợng các loài trong quần thể thực đƣợc đại diện bởi dữ liệu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

38

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

mẫu. Điểm khác biệt giữa hai chỉ số này đó là công thức tính khác nhau. Cụ thể,

trong phân tích này số lƣợng loài ƣớc lƣợng đƣợc trong hệ vi sinh vật của Nha

Trang là khoảng 439 nghìn loài, cao gấp đôi so với số lƣợng loài ƣớc lƣợng của

Phú Quốc (khoảng 200 nghìn loài) và cao gấp 3 lần số lƣợng loài của hệ sinh vật

của mẫu tại Sơn Dƣơng, Tuyên Quang với khoảng 144 nghìn loài.

Bảng 3.4. Thống kê số liệu phân tích sự đa dạng về dữ liệu giữa các khu

vực nghiên cứu

NT PQ TQ Sample Index ID 2,445,903 1,508,944 861,431

OTU 160.615 83.907 64.004

Ace 439.415 199.597 144.779

Chao 419.075 187.146 142.157 0.03 Coverage 0,96 0,97 0,96

Shannon 11,95 9,89 11,37

Simpson 0,002 0,001 0,004

OTU 51.676 24.531 25.813

Ace 106.003 44.566 45.873

Chao 102.371 44.053 45.572 0.05 Coverage 0,99 0,99 0,99

Shannon 10,28 7,91 9,95

Simpson 0,003 0,001 0,005

OTU 8.773 3.964 6.802

Ace 11.663 5.250 8.650

5.318 8.792 Chao 11.780 0.1

Coverage 0,999 0,999 0,998

Shannon 7,93 5,73 7,98

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

39

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Simpson 0,007 0,003 0,006

Ngoài ra, hai chỉ số đƣợc sử dụng để đánh giá mức độ đa dạng của mẫu

cũng đƣợc xác định là Shannon và Simpson. Hai chỉ số này có cùng ý nghĩa về

mặt phân tích nhƣng khác nhau về mặt giá trị. Trong khi giá trị của Shannon

càng cao càng thể hiện sự đa dạng của mẫu thì giá trị của Simpson càng nhỏ

càng thể hiện sự phong phú đa dạng của mẫu phân tích. Từ bảng 3.4 cho thấy,

mặc dù số lƣợng loài ƣớc lƣợng của hệ vi sinh vật ở khu vực Tuyên Quang là

thấp hơn 3 lần so với số lƣợng loài ƣớc lƣợng ở khu vực Nha Trang, sự đa dạng

giữa các loài ở hai khu vực này đƣợc đánh giá là giống nhau. Cụ thể, giá trị

Shannon của hai mẫu lần lƣợt là 11,9 và 11,4 trong khi giá trị Simpson của hai

mẫu lần lƣợt là 0,002 và 0,004. Đối chiếu với giá trị của hai chỉ số này ở mẫu

Phú Quốc, mặc dù giá trị Shannon thấp hơn hai mẫu còn lại là 9,8; giá trị

Simpson chỉ là 0,001. Điều này cho thấy, mặc dù số lƣợng các loài ƣớc lƣợng ở

các khu vực có thể rất khác nhau, nhƣng sự đa dạng giữa các loài ở cả 3 hệ vi

sinh vật là cao và tƣơng đối giống nhau.

Kết quả này bƣớc đầu cho thấy sự đa dạng cao về hệ vi sinh vật ở các khu

vực nghiên cứu. Điều kiện môi trƣờng đất cát ở 2 khu vực Nha Trang và Phú

Quốc với độ pH thấp phản ảnh sự thích hợp hơn cho nhiều loài vi sinh vật phát

triển, so sánh với đất vàng đỏ có độ pH cao hơn ở khu vực Tuyên Quang. Hơn

thế nữa, căn cứ vào giá trị coverage, có thể thấy mức độ đầy đủ của dữ liệu mẫu,

giá trị 0,96 - 0,97 phản ánh 96% - 97% số lƣợng các loài vi sinh vật trong hệ vi

sinh vật ở cả 3 khu vực đã đƣợc phân tích. Điều này cho phép gia tăng mức độ

tin cậy của các kết luận phân tích sự đa dạng của các hệ vi sinh vật ở các khu

vực nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

40

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Việc đánh giá mối liên hệ giữa các thành phần đất tới sự đa dạng của hệ vi

sinh vật đã có nhiều nghiên cứu. Tuy nhiên, kết quả phân tích cho tới sự đa dạng

về mối tƣơng quan, các giá trị phụ thuộc vào vị trí và thời điểm lấy mẫu dẫn tới

việc ảnh hƣởng tích cực hay tiêu cực tới hệ vi sinh, nghiên cứu này đƣợc nhận

định sẽ đóng góp vào sự hiểu biết chung về mối tƣơng quan này, góp phần làm

sáng tỏ về sự ảnh hƣởng của từng nhân tố cũng nhƣ mức độ ảnh hƣởng này.

Tƣơng tự với phân tích các OTU ở mức độ 0,03, các phân tích tiếp theo

đƣợc thể hiện trong bảng 3.4 đối với các mức 0,05 và 0,1 cũng cho kết luận

tƣơng tự. Việc giảm giá trị tƣơng đồng cũng đồng nghĩa với việc giả thiết sự đa

dạng của các hệ vi sinh vật ở các khu vực khác nhau tăng lên. Và nếu giả thiết

này đúng thì số lƣợng các OTU và các chỉ số khác sẽ giảm và tiến gần tới mức

tƣơng đồng nhau. Từ các kết quả phân tích tại bảng 3.4 cho thấy sự giảm về số

lƣợng các OTU và các chỉ số tiến đến mức tƣơng đồng nhau, điều này góp phần

củng cố và kết luận về sự đa dạng cao về hệ vi sinh vật ở các khu vực nghiên

cứu.

Nhƣ phân tích ở trên, khi phân loại các OTU ở các mức độ 0,03; 0,05; và

0,1; giá trị coverage tăng dần từ 0,96 tới 0,999. Kết quả này cho thấy mức độ

đầy đủ của dữ liệu mẫu là rất cao. Giá trị coverage bằng 1 sẽ là giá trị tối đa,

phản ánh toàn bộ các loài trong hệ vi sinh vật ở các khu vực phân tích đã đƣợc

giải mã và thống kê trong các OTU phân loại đƣợc.

Với các số liệu thu đƣợc, căn cứ vào các kết quả phân tích có thể thấy sự

phong phú rất lớn của các hệ vi sinh vật, để có thể khám phá đầy đủ hơn về các

hệ vi sinh vật này, cần tiếp tục giải mã trình tự hệ vi sinh vật ở với quy mô lớn

hơn.

3.4. Kết quả phân tích thành phần giới

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

41

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Trên tổng số 2.445.903 trình tự phân tích của hệ vi sinh vật ở khu vực

Nha Trang, nghiên cứu đã phân loại đƣợc 14 ngành, 16 lớp, và 21 chi, trong khi

từ mẫu Phú Quốc và mẫu Tuyên Quang, với tổng số 1.508.944 và 861.431 trình

tự lần lƣợt chúng tôi đồng thời phân loại đƣợc 14 ngành, 16 lớp, và 21 chi giống

với mẫu Nha Trang. Trên cả 3 khối dữ liệu phân tích ở cả 3 khu vực, các nhóm

trình tự có tỉ lệ phần trăm trên tổng số trình tự thấp hơn 0,1% đƣợc phân vào

nhóm khác nhau (others), các trình tự không thể phân loại đƣợc thống kê trong

A

B

nhóm Không phân loại (unclassified) (Hình 3.4).

Hình 3.4. Cấu trúc quần thể vi sinh vật ở mức độ giới

A. Biểu đồ hình tròn biểu thị tỉ lệ phần trăm của từng khu vực

B. Biểu đồ hình cột biểu thị sự tƣơng quan giữa các khu vực

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

42

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Từ biểu đồ hình 3.5 cho thấy actinobacteria, chloroflexi, acidobacteria,

planctomycetes và proteobacteria là 5 giới chiếm tỉ lệ phần trăm cao nhất. Đối

với mẫu Tuyên Quang, actinobacteria là giới chiếm ƣu thế lớn nhất với 30%,

trong khi với mẫu Nha Trang giới chiếm ƣu thế là proteobacteria và với mẫu

Phú Quốc là 52% thuộc giới acidobacteria.

3.5. Kết quả phân tích thành phần lớp

Tiếp theo, ở mức độ lớp đã xác định đƣợc 16 lớp trên toàn bộ dữ liệu

A

B

phân tích (Hình 3.5).

Hình 3.5. Cấu trúc quần thể vi sinh vật ở mức độ lớp

A. Biểu đồ hình tròn biểu thị tỉ lệ phần trăm của từng khu vực

B. Biểu đồ hình cột biểu thị sự tƣơng quan giữa các khu vực

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

43

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Từ biểu đồ hình 3.6 cho thấy actinobacteria, anaerolineae, ktedonbacteria,

acidobacteria, solibacteres, phycisphaeratia, planctomycetia và

alphaproteobacteria là 8 lớp chiếm tỉ lệ phần trăm cao nhất. Đối với mẫu Tuyên

Quang, actinobacteria thuộc giới actinobacteria là lớp chiếm ƣu thế lớn nhất với

30%, trong khi với mẫu Nha Trang giới chiếm ƣu thế lớn nhất là

alphaproteobacteria với 35% và với mẫu Phú Quốc là lớp acidobacteria thuộc

giới acidobacteria chiếm 26%.

3.6. Kết quả phân tích thành phần chi

Tiếp theo, ở mức độ chi, chúng tôi xác định đƣợc 21 chi trên toàn bộ dữ

liệu phân tích, các nhóm có tỉ lệ phần trăm thấp hơn 0,1% đƣợc phân vào nhóm

Khác nhau, các trình tự còn lại đƣợc xếp nhóm Không phân loại (Hình 3.6).

Hình 3.6. Cấu trúc quần thể vi sinh vật ở mức độ chi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

44

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Từ biểu đồ hình 3.7 cho thấy, mặc dù số lƣợng các trình tự đƣợc phân loại

ở mức độ chi của mẫu Nha Trang là rất lớn, nhƣng các trình tự này đƣợc tập

trung chủ yếu ở các chi edaphobacter, planctomyces, bradyrhizobium, devosia,

rhodoplanes, mesorhizobium, và telmatospirillum. Tƣơng tự với mẫu Phú Quốc,

với các trình tự có thể phân loại ở mức độ chi, hầu hết tập trung ở các chi:

candidatus solibacter, bradyrhizobium, và rhodoplanes. Trong khi đó, ở mẫu

Tuyên Quang, mặc dù số lƣợng trình tự đƣợc phân loại thấp hơn, nhƣng các

trình tự có sự đa dạng khá cao và phân bố đồng đều ở 16 chi.

Đặc điểm nổi bật của kết quả phân tích này đó là sự khác nhau về số

lƣợng của các trình tự đƣợc phân loại và không đƣợc phân loại ở mức độ chi của

3 mẫu nghiên cứu. Cụ thể, Mẫu Nha Trang có số lƣợng trình tự lớn nhất, tuy

nhiên toàn bộ 100% đã đƣợc phân loại tới mức độ chi. Trong khi đó, hai mẫu

Phú Quốc và Tuyên Quang, mặc dù có số lƣợng trình tự thấp hơn, nhƣng đã cho

thấy sự phong phú rõ rệt về dữ liệu, hầu nhƣ toàn bộ các trình tự đều thuộc các

chi mới chƣa có trong ngân hàng cơ sở dữ liệu SILVA, cụ thể là 85% và 92%

tƣơng ứng.

3.7. Kết quả phân tích sự tƣơng đồng giữa các OTU

Một phân tích tiếp theo đã đƣợc tiến hành, phân tích biểu đồ venn. Biểu

đồ venn cho phép mô tả sự tƣơng đồng và sai khác về số lƣợng các OTU giữa 3

mẫu nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

45

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Hình 3.7. Biểu đồ venn mô tả số lƣợng các OTU của các mẫu

Trên tổng số 160 nghìn OTU của mẫu Nha Trang, 84 ngìn OTU của mẫu

Phú Quốc và 64 nghìn OTU của mẫu Tuyên Quang, chỉ có 2.199 OTU tƣơng

đồng giữa 3 mẫu. Sự tƣơng đồng cao nhất giữa 2 mẫu thuộc về mẫu Nha Trang

và Phú Quốc là hơn 16 nghìn OTU. Sự tƣơng đồng thấp nhất giữa 2 mẫu thuộc

về mẫu Tuyên Quang và Phú Quốc với hơn 2 nghìn OTU. Do đó, có thể dễ dàng

nhận thấy sự đang dạng rất lớn của các hệ vi sinh vật ở các khu vực khác nhau.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

46

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

IV. KẾT LUẬN

Đã tách chiết thành công DNA tổng số có độ tinh sạch cao, đảm bảo về

nồng độ DNA của vi sinh vật ở các mẫu đất thu thập tại 3 vùng trồng dó bầu tại

Việt Nam là Sơn Dƣơng (Tuyên Quang), Nha Trang (Khánh Hòa), và Phú Quốc

(Kiên Giang).

Đã phân tích sự giống nhau và khác nhau của 3 hệ vi sinh vật về thành

phần và số lƣợng dựa trên các trình tự thu đƣợc trên máy illumina.

Đề tài đã phân loại đƣợc 14 ngành, 16 lớp, và 21 chi trên cả 3 hệ vi sinh

vật. Trong đó, 100% các trình tự của mẫu Nha Trang đã đƣợc xác định ở mức độ

chi, 85% trình tự của mẫu Phú Quốc và 92% trình tự của mẫu Tuyên Quang

đƣợc phân loại vào các chi mới chƣa đƣợc công bố trên ngân hàng cơ sở dữ liệu

SILVA.

V. KIẾN NGHỊ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

47

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Cần các đánh giá cụ thể hơn để nghiên cứu có thể xác định đƣợc thành

phần loài của các hệ vi sinh vật hệ rễ dó bầu.

Cần có thêm nhiều các nghiên cứu tiếp theo với các mục đích so sánh khả

năng tạo trầm và giá trị các loại trầm của dó bầu tại các địa điểm thu mẫu.

Tiếp tục đánh giá sự ảnh hƣởng của hệ vi sinh vật tại các khu vực tới cây

dó bầu và phân loại các nhóm vi sinh vật có ảnh hƣởng tới khả năng tạo trầm

của cây dó bầu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1. Hoàng Cảnh (2006). Trầm hƣơng và loại cây tạo ra trầm hƣơng, lợi

ích, thách thức và triển vọng. Hội trầm hƣơng Việt Nam.

http://www.tramhuongvietnam.com/thongtinbaochip1.php.

2. Thái Thành Lƣợm (2009). Kết quả nghiên cứu giống cây trầm

hƣơng 20 năm tuổi (Aquilaria crassna Pierre) trên những dòng cây mẹ có

khả năng tụ nhựa trầm tại vùng đảo Phú Quốc. Tạp chí Nông nghiệp và

phát triển Nông thôn 4: 95-98.

Phạm Hoàng Hộ (1992). Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Trẻ.

Tài liệu tiếng Anh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

48

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

3. Allen EE and Banfield JF (2005). Community genomics in microbial

ecology and evolution. Nat Rev Microbiol 3: 489-498.

4. Amann RI, Ludwig W and Schleifer KH (1995). Phylogenetic

identification and in situ detection of individual microbial cells withOTU

cultivation. Microbiol Rev 59: 143-169.

5. Anon (1998). Medicinal Plant Significant Trade Study (CITES).

India Country Report. TRAFFIC India and WWF-India, New Delhi

103pp.

6. Aragon AD, Torrez-Martinez N and Edwards JS (2012). Genomic

analysis of Saccharomyces cerevisiae isolates that grow optimally with

glucose as the sole carbon source. Electrophoresis 33(23): 3514-3520.

7. Ayman Grada and Kate Weinbrecht (2013). Next-generation

sequencing: methodology and application. Journal of Investigative

Dermatology 133: e11.

8. Azad AK, Curtis A, Papp A, Webb A, Knoell D, Sadee W and

Schlesinger LS (2013). Allelic mRNA expression imbalance in C-type

lectins reveals a frequent regulatory SNP in the human surfactant protein

A (SP-A) gene. Genes Immun 14(2): 99-106.

9. Barden A, Awang AN, Mulliken T and Song M (2000). Heart of

the matter: agarwood use and trade and CITES implementation for

Aquilaria malaccensis. Available from: www.traffic.org/forestry-

reports/traffic_pub_forestry7.pdf.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

49

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

10. Beja O, Koonin EV, Aravind L, Taylor LT et al (2002).

Comparative genomic analysis of archaeal genotypic variants in a single

population and in two different oceanic provinces. Appl Environ

Microbiol 68, 335–345.

11. Bomar L, Maltz M, Colston S and Graf J (2011). Directed

culturing of microorganisms using metatranscriptomics. MBio 2: e00012-

0001

12. Breitbart M, Salamon P, Andresen B, Mahaffy JM, Segall AM,

Mead D, Azam F and Rohwer F (2002). Genomic analysis of uncultured

marine viral communities. Proceedings of the National Academy USA 99

(22): 14250-14255.

13. Castro TL, Seyffert N, Ramos RT, Barbosa S, Carvalho RD, Pinto

AC, Carneiro AR, Silva WM, Pacheco LG, Downson C, Schneider MP,

Miyoshi A, Azevedo V, Silva A (2013). Ion Torrent-based transcriptional

assessment of a Corynebacterium pseudotuberculosis equi strain reveals

denaturing high-performance liquid chromatography a promising rRNA

depletion method. Microb Biotechnol 6(2): 168-177.

14. Chen K and Patcher L (2005). Bioinformatics for whole-genome

shortgun sequencing of microbial communities. PLoS Comput Biol 1: 24.

15. Courtois S (2003). Recombinant environmental libraries provide

access to microbial diversity for drug discovery from natural products. Appl

Environ Microbiol 69: 49-55.

16. Daniel R (2005). The metagenomics of soil. Nat Rev Microbiol

3(6):470-8.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

50

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

17. Daves K (2010). It’s “Watson Meets Moore” as Ion Torrent

Introduces Semiconductor Sequencing. Bio-IT World 2010. Available

from http://www.bio-itworld.com/news/03/01/10/ion-torrent-

semiconductor-sequencing.html

18. Diaz-Torres ML, McNab RD, Spratt A, Villedieu A, Hunt NM,

Wilson and Mullany P (2003). Novel tetracycline resistance determinant

from the oral metagenome. Antimicrob Agents Chemother 47: 1430-1432.

19. Edwards RA, Rodriguez-Brito B, Wegley L, Haynes M, Breitbart

M, Peterson DM, Saar MO, Alexander S, Alexander EC, Rohwer F

(2006). Using pyrosequencing to shed light on deep mine microbial

ecology. BMC Genomics 7: 57.

20. Elliott AM, Radecki J, Moghis B, Li X, Kammesheidt A (2012).

Rapid detection of the ACMG/ACOG-recommended 23 CFTR disease-

causing mutations using ion torrent semiconductor sequencing. J Biomol

Tech 23(1): 24-30.

21. Gillespie DE, Brady SF, Bettermann AD, Cianciotto NP, Liles

MR, Rondon MR, Clardy JR, Goodman M and Handelsman J (2002).

22. Isolation of antibiotics turbomycin A and B from a metagenomic

library of soil microbial DNA. Appl Environ Microbiol 68: 4301-4306.

22. Handelsman J (2004). Metagenomics: Application of genomics to

uncultured microorganisms. Microbiol. Molec Biol Rev 68(4):669-685

23. Handelsman J, Rondon MR, Brady SF, Clardy J, Goodman RM

(1998) Molecular biological access to the chemistry of unknown soil

microbes: a new frontier for natural products. Chem Biol 5(10): 245-249.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

51

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

24. Hardeman F and S Sjoling (2007). Metagenomic approach for the

isolation of a novel low-temperature-active lipase from uncultured

bacteria of marine sediment. FEMS Microbiol Ecol 59: 524-534.

25. Hartwig B, James GV, Konrad K, Schneeberger K and Turck F

(2012). Fast isogenic mapping-by-sequencing of ethyl methanesulfonate-

induced mutant bulks. Plant Physiol 160(2): 591-600.

26. Hassan SS, Guimarães LC, Pereira Ude P, Islam A, Ali A,

Bakhtiar SM, Ribeiro D, Rodrigues Dos Santos A, Soares Sde C, Dorella

F, Pinto AC, Schneider MP, Barbosa MS, Almeida S, Abreu V, Aburjaile

F, Carneiro AR, Cerdeira LT, Fiaux K, Barbosa E, Diniz C, Rocha FS,

Ramos RT, Jain N, Tiwari S, Barh D, Miyoshi A, Müller B, Silva A,

Azevedo V (2012). Complete genome sequence of Corynebacterium

pseudotuberculosis biovar ovis strain P54B96 isolated from antelope in

SOTUh Africa obtained by rapid next generation sequencing technology.

Stand Genomic Sci 7(2): 189-199.

27. Healy FG, Ray RM, Aldrich HC, Wilkie AC, ILO and

Shanmugam KT (1995). Direct isolation of functional genes encoding

cellulases from the microbial consortia in a thermophilic, anaerobic

digester maintained on lignocellulose. Appl Microbiol Biotechnol 43:

667-674.

28. Henne A, Schmitz RA, Bomeke M, Gottschalk G, Daniel R

(2000). Screening of environmental DNA libraries for the presence of

genes conferring lipolytic activity on Escherichia coli. Appl Environ

Microbiol 66: 3113-3116.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

52

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

29. Henne A, Daniel R, Schmitz RA, Gottschalk G (1999). Construction

of environmental DNA libraries in Escherichia coli and screening for the

presence of genes conferring utilization of 4- hydroxybutyrate. Appl Environ

Microbiol 3901-3907.

30. Heuveling van Beek H and Phillips D (1999). Agarwood: Trade

and CITES Implementation in Southeast Asia. Unpublished report

prepared for TRAFFIC Southeast Asia, Malaysia.

31. Hochmuth T, Niederkruger H, Gernert C, Siegl A,

Taudien S,Platzer M, Crews P, Hentschel U and Piel J (2010).

Linkingchemical and microbial diversity in marine sponges: possiblerole

for Poribacteria as producers of methyl-branched fatty acids.

Chembiochem 11: 2572-2578

32. Howden BP, McEvoy CR, Allen DL, Chua K, Gao W, Harrison

PF, Bell J, Coombs G, Bennett-Wood V, Porter JL, Robins-Browne R,

Davies JK, Seemann T, Stinear TP (2011). Evolution of multidrug

resistance during Staphylococcus aureus infection involves mutation of

the essential two component regulator WalKR. PLoS Pathog 7(11):

e1002359.

33. Hugenholz, P (2002). Exploring prokaryotic diversity in the

genomic era. Genome Biology 3 (2): 1-8.

34. Iqbal Z, Caccamo M, Turner I, Flicek P and McVean G (2012). De

novo assembly and genotyping of variants using colored de Bruijn graphs.

Nat Genet 44: 226-232.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

53

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

35. Ito M, Okimoto K, Yagura T, Honda G (2005). Induction of

sesquiterpenoid production by methyl jasmonate in Aquilaria sinensis cell

suspension culture. J Essent Oil Res 17: 175-180.

36. Jünemann S, Prior K, Szczepanowski R, Harks I, Ehmke B,

Goesmann A, Stoye J and Harmsen D (2012). Bacterial community shift

in treated periodontitis patients revealed by ion torrent 16S rRNA gene

amplicon sequencing. PLoS One 7(8): e41606.

37. Kakirde Kavita S, Larissa C Parsley and Mark R Liles (2010). Size

Does Matter: Application-driven Approaches for Soil Metagenomics. Soil

biology & biochemistry 42 (11): 1911-1923.

38. Karow J (20011). At AGBT, Ion Torrent Customers Provide First

Feedback; Life Tech OTUlines Platform's Growth. In Sequence.

39. Kiet L, Kessler PJA and Eurlings M (2005). A new species of

Aquilaria (Thymelaceaceae) from Vietnam. Blumea 50: 135-141.

40. Lussier FX, Chambenoit O, Côté A, Hupé JF, Denis F, Juteau P,

Beaudet R and Shareck F (2011). Construction and functional screening

of a metagenomic library using a T7 RNA polymerase-based expression

cosmid vector. J Ind Microbiol Biotechnol 38 (9): 1321-1328.

41. Madigan M and Martinko J (2005). Brock Biology of

Microorganisms, Chaps 1, 8 and 10. San Francisco, CA: Benjamin

Cummings.

42. Majernik A, Gottschalk G and Daniel R (2001). Screening of

environmental DNA libraries for the presence of genes conferring

Na_(Li_)/H_antiporter activity on Escherichia coli: characterization of the

recovered genes and the corresponding gene products. J Bacteriol 183:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

54

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

6645-6653.

43. Mardis ER (2008). Next-generation DNA sequencing methods.

Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387-402.

44. Margulies M, Egholm M, Altman WE, et al. (2005). Genome

Sequencing in Open Microfabricated High Density Picoliter Reactors.

Nature 437 (7057): 376-380.

45. Mellmann A, Harmsen D, Cummings CA, Zentz EB, Leopold SR,

Rico A, Prior K, Szczepanowski R, Ji Y, Zhang W, McLaughlin SF,

Henkhaus JK, Leopold B, Bielaszewska M, Prager R, Brzoska PM,

Moore RL, Guenther S, Rothberg JM and Karch H (2011). Prospective

genomic characterization of the German enterohemorrhagic Escherichia

coli O104:H4 OTUbreak by rapid next generation sequencing technology.

PLoS One 11; 6(7): e22751.

46. Metzker ML (2005). Emerging technologies in DNA sequencing.

Genome Res 15(12): 1767-1776.

47. Ng LT, Chang YS and Kadir AA (1997). A review on agar

(gaharu) producing Aquilaria species. Journal of Tropical Forest Products

2(2): 272-285.

48. Nikolouli K and Mossialos (2012). Bioactive compounds

synthesized by non-ribosomal peptide synthetases and type-I polyketide

synthases discovered through genome-mining and metagenomics.

Biotechnology Letters 34(8):1393.

49. Nyrén P. (2007). The History of Pyrosequencing. Methods Mol

Biology 373: 1–14.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

55

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

50. Oldfield S, Lusty C and MacKinven A (1998). The Word List of

Threatened Trees. World Conservation.

51. Olsvik O, J Wahlberg, B Petterson, M Uhlén, T Popovic, I K

Wachsmuth and P I Fields (1993). Use of automated sequencing of

polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of

cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. J Clin. Microbiol.

31 (1): 22–5.

52. Pace NR and Delong EF (1991). Analysis of a marine

picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing.

Journal of Bacteriology 173 (14): 4371-4378.

53. Pace NR, Stahl DA, Lane DJ and Olsen GJ (1985). Analyzing

natural microbial populations by rRNA sequences. ASM News 51: 4-12.

54. Pace NR, Stahl DA, Lane DJ and Olsen GJ (1986). The analysis of

natural microbial populations by ribosomal RNA se-quences. Adv Microb

Ecol 9: 1-55.

55. Parachin Nádia Skorupa and Marie F Gorwa-Grauslund (2011).

Isolation of xylose isomerases by sequence- and function-based screening

from a soil metagenomic library. Biotechnology for Biofuels 4 (1): 9.

56. Patrick D, Schloss and Handelsman Jo (2005). Metagenomics for

studying unculturable microorganisms: cutting the Gordian knot. Genome

Biol 6: 229.

57. Perkel J (2011). Making contact with sequencing's fourth

generation. Biotechniques 50(2):93-95.

58. Pettersson E, Lundeberg J and Ahmadian A (2009). Generations of

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

56

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

sequencing technologies. Genomics 93 (2): 105-11.

59. Poehlmann A, Kuester D, Meyer F, Lippert H, Roessner A and

Schneider-Stock R (2007). Kras mutation detection in colorectal cancer

using the Pyrosequencing technique. Pathol Res Pract. 203: 489-497.

60. Poinar HN, Schwarz C, Qi J, Shapiro B, Macphee RD, Buigues B,

Tikhonov A, Huson D, Tomsho LP, Auch A, Rampp M, Miller W and

Schuster SC (2006). Metagenomics to Paleogenomics: Large-Scale

Sequencing of Mammoth DNA. Science 311(5759): 392-394.

61. Pongrawee Nimnoi, Neelawan Pongsilp and Saisamorn Lumyong

(2011). Actinobacterial community and diversity in rhizosphere soils of

Aquilaria crassna Pierreex Lec assessed by RT-PCR and PCR-DGGE.

Biochemical Systematics and Ecology 39: 509-519.

62. Qi SH, He ML, Lin DL, Zhang CH, Hu LJ and Zhang HZ (2005).

Production of 2-(2-phenylethyl) chromones in cell suspension cultures of

Aquilaria sinensis. Biomedical and Life Science 83(2): 217-221.

63. Raaijmakers JM, Weller DM and Thomashow LS (1997).

Frequency of antibiotic-producing Pseudomonas spp. in natural

environments. Appl Environ Microbiol 63: 881-887.

64. Ramos RT, Carneiro AR, Soares Sde C, dos Santos AR, Almeida

S, Guimarães L, Figueira F, Barbosa E, Tauch A, Azevedo V and Silva A

(2013). Tips and tricks for the assembly of a Corynebacterium

pseudotuberculosis genome using a semiconductor sequencer. Microb

Biotechnol 6(2): 150-156.

65. Riesenfeld CS, Goodman RM and Handelsman J (2004).

Uncultured soil bacteria are a reservoir of new antibiotic resistance genes.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

57

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Environ Microbiol 6: 981-989.

66. Ronaghi M, S Karamohamed, B Pettersson, M Uhlén and P Nyrén

(1996). Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate

release. Analytical Biochemistry 242 (1): 84–89.

67. Ronaghi M, Uhlén M, Nyrén P (1998). A sequencing method

based on real-time pyrophosphate. Science 281 (5375): 363.

68. Rusch DB, Halpern AL, Sutton G, Heidelberg KB, Williamson S,

et al (2007). The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition:

Northwest Atlantic through Eastern Tropical Pacific. PLoS Biology 5:

e77.

69. Rusk N (2011). Torrents of sequence. Nat Meth 8(1): 44-44.

70. Sanger F, Nicklen S and Coulson AR (1977). DNA sequencing

with chain‐terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12):

5463–7.

71. Schadt EE, Turner S and Kasarskis A (2010). A window into third-

generation sequencing. Human Molecular Genetics 19 (R2): R227–40.

72. Schloss PD, Larget BR and Handelsman J (2004). Integration of

microbial ecology and statistics: a test to compare gene libraries. Appl

Environ Microbiol. 70: 5485-5492.

73. Schmeisser C, Steele H and Streit WR (2007). Metagenomics,

biotechnology with nonculturable microbes. Appl Microbiol Biotechnol

75: 955-962

74. Schmidt TM, DeLong EF Pace NR (1991). Analysis of a marine

picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing. J

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

58

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Bacteriol 173: 4371-4378.

75. Schuster SC (2008). Next-generation sequencing transforms

todayʹs biology. Nat Meth 5 (1): 16-18.

76. Soehartono T and Mardiastuti A (1997). The current trade in

gaharu in West Kalimantan. Jurnal Ilmiah Biodiversitas Indonesia 1(1).

77. Stein JL, Marsh TL, Wu KY, Shizuya H, DeLong EF

(1996). Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and

analysis of a 40- kilobase-pair genome fragment front a planktonic

marine archaeon. J Bacteriol 178: 591-599.

78. Susannah Green Tringe and Edward M Rubin (2005).

Metagenomics: DNA sequencing of environmental samples. Nature Rev

Gen 6: 805-814.

79. Thi Huyen Do, Thi Thao Nguyen, Thanh Ngoc Nguyen, Quynh

Giang Le, Cuong Nguyen, Keitarou Kimura and Nam Hai Truong (2014).

Mining biomass-degrading genes through Illumina-based de novo

sequencing and metagenomic analysis of free-living bacteria in the gut of

the lower

80. Torsvik V, Daae FL, Sandaa RA and Øvreås L (2002). Microbial

diversity and function in soil: from genes to ecosystems. Curr Opin

Microbiol 5: 240-245.

81. Tringe SG, Von Mering C, Kobayashi A, Salamov AA, Chen K,

Chang HW, Podar M, Short JM, Mathur EJ and Detter JC (2005).

Comparative metagenomics of microbial communities. Science 308: 554-

557.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

59

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

82. Turnbaugh PJ, Ley RE, Hamady M, Fraser-Liggett CM, Knight R,

et al (2007). The Human Microbiome Project Nature 449: 804-810.

83. Tyson GW, Chapman J, Hugenholtz P, Allen EE, Ram RJ,

Richardson PM, Solovyev VV, Rubin EM,Rokhsar DS and Banfield JF

(2004). Community structure and metabolism through reconstruction of

microbial genomes from the environment. Nature 428: 37-43.

84. Valouev A, Ichikawa J, Tonthat T, Stuart J, Ranade S, Peckham H,

Zeng K, Malek JA, Costa G, McKernan K, Sidow A, Fire A and Johnson

SM (2008). A highresolution, nucleosome position map of C. elegans

reveals a lack of universal sequence-dictated positioning. Genome Res. 18

(7): 1051–1063.

85. Venter JC; Remington K, Heidelberg JF, Halpern AL, Rusch D,

Eisen JA, Wu D, Paulsen I, Nelson KE, Nelson W, FOTUs DE, Levy S,

Knap AH, Lomas MW, Nealson K, White O, Peterson J, Hoffman J,

Parsons R, Baden-Tillson H, Pfannkoch C, Rogers Y, Smith HO (2004).

Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea. Science

304 (5667): 66-74.

86. Visi DK, D'Souza N, Ayre BG, Webber Iii CL and Allen MS

(2013). Investigation of the bacterial retting community of kenaf

(Hibiscus cannabinus) under different conditions using next-generation

semiconductor sequencing. J Ind Microbiol Biotechnol 40(5): 465-475.

87. Vogel U, Szczepanowski R, Claus H, Jünemann S, Prior K,

Harmsen D (2012). Ion torrent personal genome machine sequencing for

genomic typing of Neisseria meningitidis for rapid determination of

multiple layers of typing information. J Clin Microbiol 50(6): 1889-1894.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

60

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

88. Whiteley AS, Jenkins S, Waite I, Kresoje N, Payne H, Mullan B,

Allcock R, O'Donnell A (2012). Microbial 16S rRNA Ion Tag and

community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM)

Platform. J Microbiol Methods 91(1): 80-88.

89. Wiriadinata H (1995). Gaharu (Aquilaria spp.) Pengembangan dan

Pemanfaatan yang Berkelanjutan. In Lokakarya Pengusahaan Hasil Hutan

Non Kayu (Rotan, Gaharu, dan Tanaman Obat). Departemen Kehutanan.

Indonesia-UK Tropical Forest Management Programme. Surabaya, 31

July-1 August 1995.

90. Woese CR (1987). Bacterial evolution. Microbiol Rev 51: 221-

271.

91. Woese CR and Fox GE (1977). Phylogenetic structure of the

prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proc Natl Acad Sci USA

74(11): 5088-5090.

92. Yergeau E, Lawrence JR, Sanschagrin S, Waiser MJ, Korber DR

and Greer CW (2012). Next-generation sequencing of microbial

communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil

sands mining activities. Appl Environ Microbiol 78(21): 7626-7637.

93. Zuckerkandl E and Pauling L (1965). Molecules as documents of

evolutionary history. J Theor Biol 8(2): 357-366.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

61

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

62