Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism) xác định đột biến gen SMN1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR- RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH<br /> POLYMORPHISM) XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN SMN1<br /> GÂY BỆNH THOÁI HÓA CƠ TỦY<br /> Hoàng thị Huyền*, Đỗ Thị Thanh Thủy*, Nguyễn Thị Thu Tâm*, Nguyễn Kiến Minh**,<br /> Trần Diệp Tuấn***, Nguyễn Thị Băng Sương*<br /> <br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Bệnh thoái hóa cơ tủy là bệnh lý thần kinh cơ do di truyền. Phần lớn bệnh nhân bị đột biến<br /> mất đoạn gen SMN1 ở trên hai allele của nhiễm sắc thể số 5. Việc xác định đột biến gen SMN1 đóng vai<br /> trò quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh cũng như tư vấn di truyền. Kỹ thuật PCR-RFLP được nhiều tác<br /> giả sử dụng để chẩn đoán đột biến mất đoạn SMN1 vì dễ thực hiện, tính đặc hiệu cao và giá thành rẻ hơn<br /> so với các phương pháp khác. Đối tƣợng và phƣơng pháp: Tiến hành trên 22 bệnh nhân SMA được chẩn<br /> đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng, tách chiết DNA của các bệnh nhân. Thực hiện phản ứng PCR khuếch<br /> đại exon 7 và 8 của gen SMN, sau đó dùng enzyme cắt giới hạn DraI (cắt exon 7) và DdeI (cắt exon 8).<br /> Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 3% và phân tích kết quả. Kết quả: Phát hiện được 14 bệnh nhân<br /> đột biến mất cả 2 exon 7 và 8 của gen SMN1, 1 bệnh nhân đột biến mất exon 7 nhưng không mất đoạn<br /> exon 8 và 7 bệnh nhân không bị đột biến mất exon 7 và exon 8. Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện quy<br /> trình và ứng dụng thành công kỹ thuật PCR-RFLP trong chẩn đoán đột biến mất đoạn gen SMN1 gây<br /> bệnh SMA.<br /> Từ khóa: Thoái hóa cơ tủy, gen SMN, SMA, RFLP.<br /> <br /> TECHNICAL APPLICATION OF PCR-RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH<br /> POLYMORPHISM) FOR DIAGNOSIS OF MUTATION SMN1 GENE WHICH CAUSES<br /> SPINAL MUSCULAR ATROPHY<br /> Hoang Thi Huyen, Do Thi Thanh Thuy, Nguyen Thi Thu Tam, Nguyen Kien Minh,<br /> Tran Diep Tuan, Nguyen Thi Bang Suong<br /> ABSTRACT<br /> Introduction: Spinal muscular atrophy (SMA) is a genetic neuromuscular disease caused by<br /> homozygous deletion of the SMN1 gene in most of patients. Detection of the SMN1 deletion is important<br /> for diagnostic purposes and for genetic counseling. We present the PCR-RFLP technique to determine<br /> SMN1 deletion, this technique is simple, specific and efficient. Patients and methods: We tested 15<br /> patients who were diagnosed SMA by clinical symptoms. Genetic screening was performed to detect the<br /> homozygous deletion of exon 7 and exon 8 in SMN1 by PCR-RFLP using DraI and DdeI. Results: Ten<br /> patients showed deletion in SMN1 gene. Conclusions: We have successfully applied the technique of<br /> PCR-RFLP for the diagnosis of spinal muscular atrophy.<br /> Keywords: Spinal muscular atrophy, SMN gene, RFLP.<br /> -----------------------------------------<br /> <br /> * Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược TP.HCM<br /> ** Khoa thần kinh nội tiết, Bệnh viện nhi đồng 1 TP.HCM<br /> *** Bộ môn Nhi, Đại học Y Dược TP.HCM<br /> Tác giả liên lạc: Nguyễn Thị Băng Sương, ĐT: 0914007038, email: suongnguyenmd@gmail.com<br /> <br /> 1<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Bệnh Thoái hóa cơ tủy (Spinal muscular atrophy- SMA) là bệnh lý thần kinh cơ do di truyền. Tần<br /> suất mắc bệnh ước tính vào khoảng 1/10000 trẻ sinh sống và tần suất người lành mang gen đột biến chiếm<br /> 1/40-1/50[3]. Bệnh đặc trưng bởi sự thoái hóa của các tế bào sừng trước tủy sống, dẫn đến yếu cơ đối xứng<br /> gốc chi, trương lực cơ và phản xạ gân xương giảm hoặc mất, biến dạng lồng ngực và cứng khớp. Trường<br /> hợp nặng, bệnh nhi chết trong vòng năm đầu tiên của cuộc đời do biến chứng viêm phổi và suy hô hấp.<br /> Đây là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, cả cha và mẹ là người lành mang gen bệnh, khi đó<br /> khả năng mỗi lần sinh con mắc bệnh là 25%. Về phương diện lâm sàng, người ta chia SMA thành ba thể:<br /> I, II và III dựa trên tuổi khởi phát và mức độ nghiêm trọng của bệnh [4]. Thể I được gọi là bệnh Werdnig-<br /> Hoffmann, là thể nặng nhất. Bệnh nhân mắc thể I không thể ngồi hoặc nâng đầu được. Bệnh nhân thể II<br /> có thể ngồi, bệnh nhân thể III có thể tự đứng một mình hoặc đi lại nhưng đôi khi mất khả năng đi lại vào<br /> tuổi thiếu niên, hoặc thậm chí vào tuổi trưởng thành[4].<br /> Cơ chế gây bệnh SMA là do đột biến gen SMN (survival motor neuron), gen nằm trên nhánh dài<br /> của nhiễm sắc thể số 5 (5q13), vùng này chứa nhiều trình tự lặp lại và trình tự đảo ngược. Gen SMN gồm<br /> hai bản sao SMN1 và SMN2, hai gen này có trình tự gần như giống nhau, chỉ khác nhau ở 5 nucleotid<br /> (hình 1). SMN1 nằm ở vùng telomer, còn SMN2 nằm ở vùng centromer. Cả hai gen SMN1 và SMN2 đều<br /> tổng hợp ra protein tương ứng, tuy nhiên do sự khác nhau ở một vài nucleotid nên SMN1 tổng hợp được<br /> protein có chức năng, trong khi protein do gen SMN2 tổng hợp có chức năng rất hạn chế. Các tác giả<br /> khẳng định đột biến gen SMN1 là nguyên nhân chính gây nên bệnh SMA. Theo nhiều nghiên cứu 94-<br /> 99% bệnh nhân SMA là do đột biến mất đoạn exon 7; 8 của gen SMN1, 3-6% là do đột biến điểm[1].<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Vị trí các nucleotide khác nhau của gen SMN 1 (trên) và SMN 2 (dưới)<br /> Hiện nay, vẫn chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu bệnh SMA, phần lớn chỉ điều trị triệu chứng,<br /> hầu hết bệnh nhân tử vong sớm. Do vậy cần phải chẩn đoán đột biến gen SMN1 ở bệnh nhân, từ đó tiến<br /> hành phát hiện người lành mang gen bệnh (bố, mẹ, anh chị em,…) để quản lý và hạn chế sự lan truyền<br /> gen bệnh trong cộng đồng. Bên cạnh đó, cần tiến hành chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện các thai nhi<br /> mắc bệnh để có hướng xử trí kịp thời, hạn chế được tổn thương cho gia đình và xã hội.<br /> Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài với mục tiêu: Xác định đột biến mất đoạn exon<br /> 7 và exon 8 của gen SMN1 gây bệnh thoái hóa cơ tủy.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Đối tƣợng nghiên cứu<br /> - Nhóm nghiên cứu: 15 bệnh nhi đã được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh thoái hóa cơ tủy.<br /> - Nhóm đối chứng: 20 người bình thường không mắc bệnh lý gì đặc biệt. Các mẫu đối chứng này<br /> được dùng để chuẩn kỹ thuật và chạy cùng với mẫu bệnh nhân.<br /> Phƣơng pháp nghiên cứu<br /> Tách chiết DNA tổng số.<br /> - Bước 1: Thu 2 ml máu tĩnh mạch chống đông EDTA với bệnh nhi.<br /> - Bước 2: Sử dụng 200 µl máu tĩnh mạch chống đông EDTA để tách chiết DNA tổng số, sử dụng<br /> bộ QIAamp DNA Blood mini kit (Qiagen).<br /> <br /> 2<br />  - Bước 3: Hòa mẫu DNA trong 200 µl TE 1X, bảo quản -200C.<br /> Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng máy đo quang phổ<br /> Sử dụng 1-5 µl DNA sau khi tách chiết, kiểm tra bằng hệ thống máy định lượng quang phổ DNA<br /> Nanodrop 2000c. Độ tinh sạch nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0 mới được sử dụng để tiến hành phản ứng<br /> tiếp theo<br /> Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).<br /> Khuếch đại exon 7 và exon 8 của gen SMN bằng kỹ thuật PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho từng<br /> exon, các hóa chất cung cấp bởi hãng Takara, phản ứng PCR được thực hiện trên máy khuyếch đại gen<br /> Eppendorft.<br /> Kỹ thuật điện di thường trên gel agarose.<br /> Kiểm tra sản phẩm PCR đặc hiệu exon 7 và 8 trên gel agarose 3%, đệm TBE 1X.<br /> Phản ứng cắt DNA sử dụng Enzyme giới hạn<br /> - Cắt sản phẩm PCR exon 7 bằng enzyme DraI<br /> - Cắt sản phẩm PCR exon 8 bằng enzyme DdeI<br /> - Ủ 370C trong 2-3 tiếng.<br /> Điện di sản phẩm PCR.<br /> Sản phẩm PCR sau khi cắt bằng enzyme giới hạn được điện di trên gel agarose nồng độ 3%, đọc kết<br /> quả trên máy geldoc. Mẫu bệnh nhân luôn được tiến hành cùng với mẫu người bình thường và mẫu chứng<br /> dương (người mắc bệnh SMA đã biết kết quả trước là bị đột biến mất đoạn exon 7 và 8 của gen SMN1).<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> Kết quả bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn exon 7,8<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng DraI (exon 7) và DdeI (exon 8) của bệnh nhân S01<br /> <br /> Nhận xét:<br /> Hình ảnh điện di sản phẩm cắt của exon 7 cho thấy mẫu người bình thường và mẫu bệnh nhân S01<br /> xuất hiện 2 vạch có kích thước 190 bp (tương ứng với gen SMN1) và 170 bp (tương ứng với gen SMN2).<br /> Trong khi đó ở mẫu đối chứng dương (người bị mất đoạn exon 7 của SMN1) chỉ xuất hiện 1 vạch kích<br /> thước 170 bp (tương ứng với gen SMN2) mà không hiện diện vạch 190 bp. Điều này chứng tỏ bệnh nhân<br /> S01 không bị đột biến mất exon 7 của SMN1.<br /> Phân tích tương tự hình ảnh sau cắt của exon 8 ta thấy, mẫu người bình thường và bệnh nhân S01<br /> xuất hiện 3 vạch 190 bp (tương ứng với gen SMN1) và 2 vạch của gen SMN2 có kích thước 120 và 70 bp.<br /> Trong khi đó mẫu chứng dương (người bị mất đoạn exon 8 của gen SMN1) chỉ xuất hiện 2 vạch 120 và<br /> 70 bp của gen SMN2 mà không xuất hiện vạch 190 bp. Như vậy bệnh nhân S01 không bị đột biến mất<br /> đoạn exon 8 của gen SMN1.<br /> <br /> <br /> 3<br /> Kết quả bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon 7,8<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng DraI (exon 7) và DdeI (exon 8) của bệnh nhân S04<br /> <br /> Nhận xét:<br /> Phân tích kết quả của exon 7 ta thấy ở mẫu người bình thường xuất hiện 2 vạch tương ứng với<br /> exon 7 của gen SMN1 (190 bp) và của gen SMN2 (170 bp). Trong khi đó ở mẫu chứng dương và bệnh<br /> nhân S04 chỉ xuất hiện vạch 170 bp. Như vậy bệnh nhân bị mất đoạn exon 7 của gen SMN1.<br /> Kết quả exon 8 cho thấy mẫu chứng dương và bệnh nhân có hình ảnh điện di như nhau, đều xuất<br /> hiện 2 vạch là sản phẩm cắt của exon 8 thuộc gen SMN2, trong khi đó không xuất hiện vạch 190 bp của<br /> SMN1. Như vậy bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon 8 của SMN1.<br /> Kết quả bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon 7 nhƣng không mất đoạn exon 8<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng DraI (exon 7) và DdeI (exon 8) của bệnh nhân S10<br /> <br /> Nhận xét:<br /> Kết quả exon 7 của mẫu bệnh nhân S10 không xuất hiện vạch 190 bp mà chỉ xuất hiện vạch 170 bp,<br /> kết quả này tương tự như mẫu chứng dương. Như vậy bệnh nhân bị mất đoạn exon 7.<br /> Đối với exon 8, bệnh nhân S10 có xuất hiện đủ 3 vạch như mẫu người bình thường, trong đó có<br /> vạch 190 bp của gen SMN1. Như vậy chứng tỏ bệnh nhân không bị đột biến mất đoạn exon 8.<br /> Tỷ lệ bệnh nhân SMA bị đột biến mất đoạn<br /> Vị trí đột biến Số bệnh nhân Tỷ lệ (%)<br /> Đột biến mất exon 7 và 8 14 63,6<br /> Đột biến mất exon 7, không mất 1 4,6<br /> exon 8<br /> Không đột biến mất exon 7 và 8 7 31,8<br /> Tổng 22 100<br /> <br /> <br /> <br /> 4<br /> BÀN LUẬN<br /> Khu vực gen SMN có tính không ổn định, do vậy thường xảy ra hiện tượng xóa đoạn và chuyển đổi<br /> gen. Số lượng các đơn vị lặp lại có thể thay đối từ 0 đến 4 bản sao trên một nhiễm sắc thể. Nguyên nhân<br /> chính của sự thay đổi này là do sự trao đổi chéo không tương ứng giữa các đơn vị lặp lại trong quá trình<br /> giảm phân, dẫn đến mất một đoạn gen nào đó hoặc chuyển từ gen này sang một bản sao tương đồng khác.<br /> Liên quan đến bệnh SMA, có hai gen quan trọng nằm trong vùng lặp lại này là gen SMN1 ở telomere và<br /> SMN2 ở centromer. Trong quá trình giảm phân, gen SMN1 có thể bị đột biến mất đi hoặc chuyển thành<br /> gen SMN2. Hiện nay toàn bộ chiều dài của phân tử cDNA của SMN1 và SMN2 đã được xác định và cho<br /> thấy chúng gần như giống nhau, ngoại trừ sự khác biệt quan trọng ở hai exon 7 và exon 8. Đối với exon 7,<br /> nucleotide của gen SMN2 là T, thay vì nucleotide C ở gen SMN1. Với exon 8, nucleotide ở SMN1 là G,<br /> trong khi ở SMN2 là A (hình 1). Sự chuyển đổi nucleotide C thành T tại vị trí exon 7 làm cản trở quá<br /> trình cắt intron và nối exon trong quá trình hoàn thiện phân tử mRNA, hậu quả là đa số phân tử mRNA<br /> của SMN2 không có exon 7, do vậy protein do gen SMN2 tổng hợp không được ổn định và bị thoái hóa<br /> nhanh chóng ở trong cơ thể. Trong khi đó mRNA của SMN1 chứa đầy đủ các exon được phiên mã từ gen<br /> SMN1 và tổng hợp được phân tử protein có chức năng[1][3][8].<br /> Các nhà khoa học khẳng định đột biến gen SMN1 là nguyên nhân chính gây nên bệnh SMA.<br /> Nghiên cứu của Wirth đưa ra kết luận đột biến mất đoạn SMN1 chiếm đa số ở bệnh nhân SMA, tác giả<br /> cũng cho rằng SMN2 không liên quan chặc chẽ đến bệnh SMA vì 26% người bình thường trong quần thể<br /> nghiên cứu thiếu cả hai bản sao của gen SMN2[9]. Ngoài ra các nghiên cứu cũng cho thấy đột biến mất<br /> đoạn exon 7 của SMN1 đóng vai trò chính trong cơ chế gây bệnh SMA trong khi vai trò của exon 8 là thứ<br /> yếu. Mất đoạn exon 7 luôn gây biểu hiện kiểu hình. Cobben (1995), Rodrigues (1995) cho thấy tất cả các<br /> bệnh nhân SMA thể I đều bị đột biến mất cả hai exon 7 và 8, trong khi đó có 5-6% bệnh nhân SMA thể II<br /> bị đột biến exon 7 nhưng không đột biến exon 8[2][7]. Trong nghiên cứu của chúng tôi có 1/22 bệnh nhân<br /> bị đột biến mất exon 7 nhưng exon 8 hoàn toàn bình thường.<br /> Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán di truyền bệnh SMA nhưng phương pháp RFLP vẫn<br /> được nhiều tác giả sử dụng vì tính ổn định, dễ thực hiện và có giá thành phù hợp hơn so với các phương<br /> pháp khác. Tác dụng của enzyme cắt giới hạn rất đặc hiệu nên phương pháp này cho kết quả âm tính giả<br /> rất thấp. Để khảo sát exon 7 của gen SMN chúng tôi sử dụng enzyme DraI, có tác dụng cắt tại vị trí<br /> TTT^AAA. Trình tự này hiện diện ở gen SMN2, do vậy DraI cắt sản phẩm PCR của SMN2 (190 bp)<br /> thành 2 đoạn 170 bp và 20 bp. Trong khi đó ở SMN1 nucleotid T bị thay thế bằng C nên SMN1 không có<br /> trình tự TTTAAA như ở SMN2 mà thay bằng trình tự TTCAAA. Như vậy enzyme DraI không thể cắt<br /> sản phẩm PCR của SMN1 (hình 5). Kết quả khi điện di sản phẩm cắt của người bình thường ta sẽ thu<br /> được 3 vạch: 190 bp, 170 bp và 20 bp. Tuy nhiên vạch 20 bp có kích thước nhỏ sẽ không quan sát được<br /> khi điện di trên gel agarose 2%, do vậy hình ảnh điện di sẽ xuất hiện 2 vạch 190 (tương ứng với gen<br /> SMN1) và 170 (tương ứng với gen SMN2). Ở bệnh nhân bị đột biến mất đoạn exon 7 của gen SMN1 thì<br /> kết quả điện di chỉ xuất hiện 1 vạch của gen SMN2 có kích thước 170 bp (hình 3).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5. Vị trí và sản phẩm cắt của enzyme DraI<br /> <br /> <br /> 5<br />  Để khảo sát exon 8 chúng tôi sử dụng enzyme DdeI. Enzym này sẽ cắt exon 8 của SMN2 thành 2<br /> đoạn 120 bp và 70 bp nhưng không cắt exon 8 của SMN1 do sự thay đổi nucleotide từ A (gen SMN2)<br /> thành G trên gen SMN1. Như vậy điện di sản phẩm cắt của người không mất đoạn exon 8 sẽ xuất hiện 3<br /> vạch: 190 bp, 120 bp và 70 bp. Trong khi đó kết quả của bệnh nhân bị mất đoạn exon 8 chỉ xuất hiện 2<br /> vạch 120 bp và 70 bp (hình 3). Quy trình xác định đột biến gen SMN1 của chúng tôi được tiến hành<br /> tương tự như nghiên cứu của Pieri và của Qu YJ [5][6].<br /> Trong 22 bệnh nhân SMA được phân tích gen chúng tôi phát hiện được 15 bệnh nhân bị đột biến<br /> mất đoạn SMN1 và 7 bệnh nhân không đột biến mất đoạn exon 7 và 8. Tỷ lệ 15/22 (68,2%) bệnh nhân<br /> SMA có đột biến mất đoạn SMN1 thấp hơn so với các nghiên cứu khác. Pieri cho thấy 95% bệnh nhân<br /> SMA mang đột biến mất đoạn đồng hợp tử gen SMN1[5]. Zeng nghiên cứu trên 23 gia đình bệnh nhân<br /> SMA và phát hiện 21/23 bệnh nhân mang đột biến mất đoạn đồng hợp tử SMN1, chiếm tỷ lệ 91% [10]. Tỷ<br /> lệ phát hiện đột biến trong nghiên cứu chúng tôi thấp có thể do cỡ mẫu còn hạn chế. Bên cạnh đó, việc<br /> chẩn đoán SMA ở Việt Nam chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng mà không có các xét nghiệm cận<br /> lâm sàng đặc hiệu như sinh thiết cơ, hóa mô miễn dịch,… do vậy sai sót trong chẩn đoán là điều khó tránh<br /> khỏi. Mặt khác bên cạnh đột biến mất đoạn, có 3-6% bệnh nhân bị đột biến điểm, có thể ở Việt Nam tỷ lệ<br /> bệnh nhân SMA mang đột biến điểm cao hơn các nước khác. Muốn xác định bản đồ đột biến gen SMN1<br /> ở người Việt Nam, cần phải tiến hành nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn. Chúng tôi vẫn tiếp tục tiến hành<br /> nghiên cứu này, bên cạnh kỹ thuật RFLP chúng tôi sẽ sử dụng một số kỹ thuật hiện đại để phát hiện các<br /> dạng đột biến khác của gen SMN1 cũng như phát hiện được người lành mang gen bệnh. Hy vọng trong<br /> thời gian tới chúng tôi sẽ đưa ra được các dạng đột biến gen SMN1 và tỷ lệ của chúng ở bệnh nhân SMA<br /> Việt Nam.<br /> KẾT LUẬN<br /> Nghiên cứu đã thành công trong việc hoàn thiện quy trình kỹ thuật PCR-RFLP và ứng dụng thành<br /> công kỹ thuật này trong chẩn đoán bệnh thoái hóa cơ tủy ở bệnh nhân Việt Nam. Đây là kỹ thuật đơn<br /> giản, dễ thực hiện nhưng có thể phát hiện được đột biến gen SMN1 với độ chính xác cao.<br /> Tài liệu tham khảo<br /> <br /> 1. Anhuf D, Eggermann T, Rudnik-Schoneborn S, Zerres K. Determination of SMN1 and SMN2 copy number using<br /> Taq Man technology. Hum Mut. 2003; 22:74-8.<br /> 2. Cobben JM, van der Steege G, Grootscholten P, de Visser M, Scheffer H, Buys CH. Deletions of the survival<br /> motor neuron gene in unaffected siblings of patients with spinal muscular atrophy. Am J Hum Genet. 1995;<br /> 57(4):805-8.<br /> 3. Kesari A, Idris MM, Chandak GR, Mittal B. Genotype-phenotype correlation of SMN locus genes in spinal<br /> muscular atrophy patients from India. Exp Mol Med. 2005; 37(3):147-54.<br /> 4. Munsat TL, Davies KE (1992) International SMA consortium meeting. Neuromuscul Disord. 1992; 2:423–428.<br /> 5. Pieri Pde C, Nogueira Jde A, Marques-Dias MJ, Resende B, Kim CA, Reed UC, Okay TS. A duplex allele-<br /> specific amplification PCR to detect SMN1 deletion. Genet Test Mol Biomarkers. 2009;13(2):205-8.<br /> 6. Qu YJ, Song F, Yang YL, Jin YW, Bai JL. Compound heterozygous mutation in two unrelated cases of Chinese<br /> spinal muscular atrophy patients. Chin Med J (Engl). 2011;124(3):385-9.<br /> 7. Rodrigues NR, Owen N, Talbot K, Patel S, Muntoni F, Ignatius J, Dubowitz V, Davies KE. Gene deletions in<br /> spinal muscular atrophy. J Med Genet. 1996; 33(2):93-6.<br /> 8. Wang CC, Chang JG, Jong YJ, Wu SM. Universal multiplex PCR and CE for quantification of SMN1/SMN2<br /> genes in spinal muscular atrophy. Electrophoresis. 2009;30(7):1102-10.<br /> 9. Wirth B. An update of the mutation spectrum of the survival motor neuron gene (SMN1) in autosomal recessive<br /> spinal muscular atrophy (SMA). Hum Mut. 2000;15:228-37.<br /> 10. Zeng J, Lin Y, Yan A, Ke L, Zhu Z, Lan F. Establishment of a molecular diagnostic system for spinal muscular<br /> atrophy experience from a clinical laboratory in china. J Mol Diagn. 2011;13(1):41-7.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 6<br />