Ứng dụng kỹ thuật realtime-PCR xác định đột biến gen BRAF V600E từ mẫu máu và mẫu mô phủ parafin ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

7
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

BRAF là gen tổng hợp protein B-raf chịu trách nhiệm kiểm soát hoạt động phát triển và phân chia của nhiều loại tế bào trong cơ thể. Đột biến gen BRAF làm cho các tế bào bất thường này nhân lên một cách không kiểm soát và hình thành ung thư. Mục đích nghiên cứu: Hoàn thiện kỹ thuật Realtime-PCR xác định đột biến gen BRAF V600E từ mẫu máu và mẫu mô phủ parafin ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng kỹ thuật realtime-PCR xác định đột biến gen BRAF V600E từ mẫu máu và mẫu mô phủ parafin ở bệnh nhân ung thư tuyến giáp

TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 478 - THÁNG 5 - SỐ 1 - 2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO risk scores with the extent of coronary artery disease in patients with non-ST-elevation acute 1. Trần Nguyễn Thu Thủy (2016), "Đánh giá thang coronary syndrome", J Pak Med Assoc. 63 (6), pp. điểm TIMI và GRACE trong dự đoán mức độ bệnh 691-695. động mạch vành ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp 6. Neeland I. J., Patel R. S., Eshtehardi P. et al. không ST chênh lên", Đại học Y học Phạm Ngọc (2012), "Coronary angiographic scoring systems: Thạch. Luận Văn Thạc Sỹ Y học. an evaluation of their equivalence and validity", Am 2. Cakar M. A., Sahinkus S., Aydin E. et al. Heart J. 164 (4), pp. 547-552.e541. (2014), "Relation between the GRACE score and 7. Roffi M., Patrono C., Collet J. P. et al. (2016), severity of atherosclerosis in acute coronary "2015 ESC Guidelines for the management of acute syndrome", J Cardiol. 63 (1), pp. 24-28. coronary syndromes in patients presenting without 3. de Araujo Goncalves P., Ferreira J., Aguiar C. persistent ST-segment elevation: Task Force for et al. (2005), "TIMI, PURSUIT, and GRACE risk the Management of Acute Coronary Syndromes in scores: sustained prognostic value and interaction Patients Presenting without Persistent ST-Segment with revascularization in NSTE-ACS", Eur Heart J. Elevation of the European Society of Cardiology 26 (9), pp. 865-872. (ESC)", Eur Heart J. 37 (3), pp. 267-315. 4. Go A. S., Mozaffarian D., Roger V. L. et al. 8. Barbosa C. E., Viana M., Brito M. et al. (2012), (2013), "Heart disease and stroke statistics--2013 "Accuracy of the GRACE and TIMI scores in update: a report from the American Heart predicting the angiographic severity of acute Association", Circulation. 127 (1), pp. e6-e245. coronary syndrome", Arq Bras Cardiol. 99 (3), pp. 5. Mahmood M., Achakzai A. S., Akhtar P. et al. 818-824. (2013), "Comparison of the TIMI and the GRACE ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN BRAF V600E TỪ MẪU MÁU VÀ MẪU MÔ PHỦ PARAFIN Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP Bùi Thị Lành*, Nguyễn Thị Trang* TÓM TẮT cao gấp 22 lần so với kiểu gen bình thường. Kết luận: Hoàn thiện thành công quy trình kỹ thuật 20 BRAF là gen tổng hợp protein B-raf chịu trách REALTIME-PCR để xác định đột biến gen BRAFV600E nhiệm kiểm soát hoạt động phát triển và phân chia từ mẫu máu và mẫu mô phủ parafin ở bệnh nhân ung của nhiều loại tế bào trong cơ thể. Đột biến gen BRAF thư tuyến giáp. làm cho các tế bào bất thường này nhân lên một cách Từ khóa: Ung thư tuyến giáp, Realtime-PCR, không kiểm soát và hình thành ung thư. Theo nhiều BRAF V600E nghiên cứu, đột biến tại codon 600 của exon 15 (V600E) là đột biến phổ biến nhất trên gen BRAF. Đột SUMMARY biến này là nguyên nhân dẫn đến nhiều bệnh ung thư trong đó có ung thư tuyến giáp. Mục tiêu: Hoàn REALTIME-PCR APPLICATION FOR thiện kỹ thuật realtime-PCR để xác định đột biến gen DETERMINING MUTATION V600E OF GENE BRAF V600E ở mẫu máu và mẫu mô phủ parafin của BRAF FROM BLOOD SAMPLE AND PARAFIN bệnh nhân ung thư tuyến giáp. Đối tượng và EMBEDDED TISSUE SAMPLE IN THYROID CANCER phương pháp nghiên cứu: 50 mẫu máu và 21 mẫu Background: BRAF gene is known as a tumor mô phủ parafin của bệnh nhân ung thư tuyến giáp, 21 suppressor gene in Thyroid cancer (TC), which plays a mẫu chứng của người khỏe mạnh bình thường. Sử role in DNA repair. The mutation in BRAF have been dụng kỹ thuật REALTIME PCR để xác định đột biến associated with different types of cancer. The present gen BRAF V600E từ mẫu máu và mẫu mô phủ parafin. Kết quả: Tỷ lệ xuất hiện đột biến ở mẫu máu là 4% study was aimed at studying the association between (2 trường hợp dị có kết quả dị hợp tử); mẫu mô là BRAF V600E mutation and TC. Material and 33,33% trong đó 4,76% là đồng hợp tử, 28,57% là dị method: Peripheral blood was collected from 50 hợp tử. Trong khi đó ở nhóm chứng không ghi nhận patients and 50 normal healthy controls into a test bất kỳ trường hợp nào mang alen đột biến. Kiểu gen tube containing EDTA were extracted by DNA-express DHT+ĐHT có nguy cơ gây bệnh ung thư tuyến giáp and 21 tissue samples were removed parafin by xylene, extracted DNA by Qiagen kit. We analyzed mutations V600E within BRAF gene in 71 patients with TC and 21normal healthy controls according to *Trường Đại học Y Hà Nội Realtime -PCR by BRAF V600E kit (Rusian). Results: Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Thị Trang The prevalence of mutation V600E in BRAF was 4.0% Email: trangnguyen@hmu.edu.vn and 33,33%, from blood samples and tissue Ngày nhận bài: 2.3.2019 respectively. In the control group, no mutation was Ngày phản biện khoa học: 18.4.2019 reported. The heterozygous and homozygous Ngày duyệt bài: 23.4.2019 73
vietnam medical journal n01 - MAY - 2019 genotypes is 22 times more likely to cause thyroid Trong đó: 1- α/2 = 0.95; ε = 0.10; p = 95% cancer than a normal gene. Conclusion: Successful (độ chính xác của quy trình tham chiếu). n = số lần completion of the Realtime-PCR technique to identify thực nghiệm cần thực hiện, tính được bằng 21. mutation BRAF V600E in thyroid cancer patient. Keywords: Thyroid cancer, Realtime-PCR, BRAF 2.2. Phương pháp nghiên cứu: Phương V600E. pháp mô tả cắt ngang có đối chứng 2.2.1. Tách chiết DNA. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Mẫu mô: sử dụng xylen để loại bỏ parafin, Ung thư tuyến giáp là bệnh ác tính thường sau đó dùng kit Qiagen để tách chiết DNA. gặp nhất trong số các bệnh nhân ung thư tuyến Mẫu máu: tách bằng kit DNA-epress nội tiết (90%) và khoảng 1% các loại ung thư DNA thu được với độ tinh sạch đạt chuẩn nói chung. BRAF là gen tiền ung thư nằm trên được khuếch đại bằng máy CFX96 (BioRad, Mỹ) nhánh dài nhiễm sắc thể số 7. Đột biến gen với chu trình luân nhiệt: 95oC - 3 phút, 40 chu kì BRAF tại codon 600 của exon 15 (V600E) được (95oC-15s, 63oC-40s) phát hiện với tỷ lệ cao trong ung thư tuyến giáp 2.3. Đạo đức nghiên cứu: Các số liệu và thể nhú, đột biến này làm tín hiệu nội bào theo thông tin nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, con đường MAPK/ERK được kích hoạt mạnh mẽ, trung thực và khách quan đã được xác nhận và giúp tế bào ung thư tăng sinh, biệt hóa, kháng chấp thuận bởi cơ sở nghiên cứu. Những thông chết theo chương trình [1]. Những bệnh nhân tin về bệnh nhân được giữ bí mật và chỉ phục vụ ung thư tuyến giáp mang đột biến BRAF V600E công tác nghiên cứu. có tỷ lệ tái phát và di căn cao, tiên lượng kém hơn, tỷ lệ sống còn thấp hơn [2]. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Mục đích nghiên cứu: Hoàn thiện kỹ thuật 3.1. Kết quả tách chiết DNA: 21 mẫu mô Realtime-PCR xác định đột biến gen BRAF V600E nghiên cứu được loại bỏ parafin bằng xylen trước từ mẫu máu và mẫu mô phủ parafin ở bệnh khi tách DNA bằng phương pháp Qiagen (Đức) nhân ung thư tuyến giáp. và 50 mẫu máu được tách bằng phương pháp DNA-express (Lytech, Nga). Tuy nhiên chúng tôi II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU có cải tiến trong bước loại bỏ parafin (bằng cách 2.1. Đối tượng nghiên cứu dùng hóa chất là xylen) và chỉ dùng 200µl máu Nhóm bệnh: là 71 bệnh nhân đã được chẩn ngoại vi và 200µl dung dịch tách DNA, thay vì đoán ung thư tuyến giáp bằng xét nghiệm giải 550µl máu ngoại vi và 550µl dung dịch tách DNA phẫu bệnh, đồng ý tham gia nghiên cứu. Trong như trong protocol DNA-express. Tiến hành kiểm đó 50 bệnh nhân lấy máu và 21 bệnh nhân lấy tra độ tinh sạch đạt chuẩn thu được kết quả sau: mẫu mô sinh thiết làm xét nghiệm tìm đột biến. Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ tinh sạch Nhóm chứng: là 21 người khỏe mạnh không DNA theo phương pháp DNA-express mắc bất kì bệnh ung thư nào. Nồng độ Nồng độ DNA Độ tinh • Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2017 đến DNA (Ng/µl) sạch tháng 4 /2019. Thấp nhất 203,7 1,81 • Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm tư vấn di Cao nhất 658,3 2,01 truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Trung bình 2,98±15,43 1,86±0,260 • Cỡ mẫu nghiên cứu: Công thức tính cỡ mẫu Nhận xét: Lượng DNA thu được từ các mẫu cho một nghiên cứu mô tả tính theo công thức tương đối cao và ổn định với nồng độ cao nhất của S.K.Luanga và Lemeshow: đạt 658,3ng/µl, thấp nhất đạt 203,7ng/µl; độ tinh sạch cao nhất là 2,01 thấp nhất là 1,81. 3.2 Kết quả REALTIME – PCR Bảng 3.2: Kết quả REALTIME – PCR Kiểu gen Kit REALTIME-PCR Bình thường 74
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 478 - THÁNG 5 - SỐ 1 - 2019 Dị hợp tử đột biến Đồng hợp tử đột biến Ghi chú: - Hex (xanh lá cây): Alen bình thường - Fam (xanh nước biển): Alen đột biến Nhận xét: Hình ảnh sau khi chạy bằng kỹ thuật REALTIME -PCR cho kết quả rõ nét, đảm bảo yêu cầu, dù đã cải tiến ở bước xử lý mẫu mô và tách chiết DNA. 3.3. Xác định đột biến gen BRAF V600E bằng kĩ thuật REALTIME - PCR Bảng 3.3. Kết quả xác định đột biến gen bằng kỹ thuật REALTIMER-PCR Nhóm bệnh Nhóm chứng Kiểu gen X2(p) OR (CI, 95%) N(%) N(%) BT 14 (66,67) 21 (100%) 0,04 (0,00-0,85) 8,4 (0,004) DHT+ĐHT 7 (33,33) 0 (0%) 22,24 (1,18-420,39) Ghi chú: BT – kiểu gen bình thường, DHT – dị hợp tử; ĐHT – đồng hợp tử đột biến. Nhận xét: Khảo sát kiểu gen c.1799T>A nhận lượng hóa chất tách chiết cần thiết, góp phần thấy ở nhóm bệnh, 50 mẫu máu có 2 trường hợp giẩm giá thành dịch vụ. Kết quả thu được vẫn dị hợp tử (chiếm 4%), không có trường hợp mang đảm bảo nồng độ DNA với độ OD đạt tiêu chuẩn, kiểu gen đồng hợp tử đột biến; 21 mẫu mô có 6 cho phép tiến hành Realtime-PCR. trường hợp dị hợp tử (chiếm 28,57%) và 1 trường 4.2. Kết quả xác định kiểu gen đột biến hợp đồng hợp tử (chiếm 4,76%). Trong khi đó ở bằng phương pháp Realtime– PCR nhóm chứng không ghi nhân bất kỳ trường hợp Ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú (PTC) nào mang alen đột biến. Kiểu gen DHT+ĐHT có chiếm 80%-90% ung thư tuyến giáp và là ung nguy cơ gây ung thư tuyến giáp cao gấp 22 lần so thư có tiên lượng tốt [3,4]. Mặc dù được xem là với kiểu gen bình thường. có tiên lượng tốt song tỷ lệ di căn hạch chiếm 50% và di căn xa chiếm 10% [5]. Tỷ lệ mắc ung IV. BÀN LUẬN thư tuyến giáp tăng nhanh ở cả nữ giới và nam 4.1. Loại bỏ parafin bằng xylen sau đó giới [6]. Do đó các phương pháp điều trị mới nên tách chiết DNA bằng bộ kit Quiagen cải được nghiên cứu và phát hiện. Braf được biết tiến. Tách chiết DNA là công đoạn rất quan đến như một gen tiền ung thư, hoạt động như trọng trong hầu hết các kỹ thuật sinh học phân serine/threonin kinase kích hoạt con đường tử. Để các phản ứng tiếp theo được tối ưu và truyền tín hiệu nội bào MAPK [7]. Nhiều nghiên chính xác, mẫu DNA cần đảm bảo đủ nồng độ, cứu đã chứng minh rằng đột biến V600E nằm độ tinh sạch, không bị đứt gãy trong quá trình trong vùng kích hoạt Braf (CR3) làm tăng cường tách chiết. Do các mẫu mô đã được xử lý bằng kích hoạt con đường MAPK một cách liên tục, formalin và bọc trong parafin nên việc làm sạch thúc đẩy các dòng tế bào ung thư phát triển. Tỷ parafin trước khi tách DNA là vô cùng quan lệ đột biến BRAF V600E ở bệnh nhân ung thư trọng. Nó ảnh hưởng lớn tới độ tinh sạch của tuyến giáp được báo cáo từ 28-83% phụ thuộc DNA. Nghiên cứu sử dụng xylen là hóa chất dễ vào các yếu tố dịch tễ và chủng tộc [8]. Phát tìm, giá thành phù hợp để loại bỏ parafin, sau đó hiện đột biến gen BRAF V600E là yêu cầu được tách DNA bằng kit Quiagen giúp tiết kiệm tối đa đặt ra nhằm phục vụ nhu cầu chẩn đoán và điều 75
vietnam medical journal n01 - MAY - 2019 trị ung thư tuyến giáp cũng như nhiều loại ung TÀI LIỆU THAM KHẢO thư khác liên quan đến đột biến này. 1. Agnieszka Czarniecka, Małgorzata Oczko- Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành tìm đột Wojciechowska, Marcin Barczyński. BRAF biến trên cả mẫu máu và mẫu mô. Kết quả ghi V600E mutation in prognostication of papillary nhận 2 trường hợp mang gen dị hợp tử trong 50 thyroid cancer (PTC) recurrence. Gland Surg. 2016 Oct; 5(5): 495–505. doi: 10.21037/gs.2016.09.09 mẫu máu (chiếm tỷ lệ 4%), 6 trường hợp dị hợp 2. Xing M et al (2005). BRAF mutation predicts a tử (chiếm tỷ lệ 28,57%) và 1 trường hợp đồng poorer clinical prognosis for papillary thyroid hợp tử (chiếm 4,76%) trong 21 mẫu mô phủ carcinôm. J Clin Endocrinol Metab, 90: 6373‐6379. parafin của 71 bệnh nhân đã được chẩn đoán 3. Rubinstein WS. Endocrine cancer predisposition ung thư tuyến giáp và không ghi nhận bất kỳ syndromes: hereditary paraganglioma, multiple trường hợp đột biến nào ở nhóm chứng. Kiểu endocrine neoplasia type 1, multiple endocrine neoplasia type 2, and hereditary thyroid gen DHT+ĐHT có nguy cơ gây bệnh ung thư cancer. Hematol Oncol Clin North tuyến giáp cao gấp 22 lần kiểu gen bình thường. Am. 2010;24:907–937. Mặc dù kĩ thuật đã được cải tiến để đơn giản, 4. Kushchayeva YS, Kushchayev SV, Wexler JA, thuận tiện, tiết kiệm chi phí hơn, bước đầu đã Carroll NM, Preul MC, Teytelboym OM, thu được những kết quả đáng mong đợi. Chúng Sonntag VK, Van ND, Burman KD, Boyle LM. Current treatment modalities for spinal metastases tôi hy vọng rằng những kỹ thuật này sẽ được secondary to thyroid kiểm chứng trên cỡ mẫu lớn hơn để có độ chính carcinoma. Thyroid. 2014;24:1443–55. xác cao hơn trước khi ứng dụng trong lâm sàng 5. Wang F, Yu X, Shen X, Zhu G, Huang Y, Liu R, chẩn đoán và điều trị ung thư tuyến giáp. Viola D, Elisei R, Puxeddu E, Fugazzola L. The prognostic value of tumor multifocality in clinical V. KẾT LUẬN outcomes of papillary thyroid cancer. J Clin - Hoàn thiện thành công kỹ thuật Realtime - Endocrinol Metab. 2017;102:3241–3250. PCR để xác định đột biến gen BRAF V600E từ 6. Carhill AA, Litofsky DR, Ross DS, Jonklaas J, Cooper DS, Brierley JD, Ladenson PW, Ain mẫu máu và mẫu mô phủ parafin ở bệnh nhân KB, Fein HG, Haugen BR. Long-term outcomes ung thư tuyến giáp. following therapy in differentiated thyroid - Tỷ lệ xuất hiện đột biến gen ở mẫu máu là carcinoma: NTCTCS registry analysis 1987-2012. J 4%(2 trong số 50 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp Clin Endocrinol Metab. 2015;100:3270–3279. tử); ở mẫu mô là 33,33%, gồm 28,57% là kiểu 7. Kim KH, Kang DW, Kim SH, Seong IO, Kang DY. Mutations of the BRAF gene in papillary gen dị hợp tử và 4,76% là kiểu gen đồng hợp tử. thyroid carcinoma in a Korean population. Yonsei Trong khi đó ở nhóm chứng không phát hiên bất Med J. 2004;45:818–21. kỳ trường hợp nào mang alen đột biến. Kiểu gen 8. Mercer KE, Pritchard CA. Raf proteins and DHT+ĐHT có nguy cơ gây bệnh ung thư tuyến cancer: B-Raf is identified as a mutational giáp cao gấp 22 lần so với kiểu gen bình thường. target. Biochim Biophys Acta. 2003;1653:25–40. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM TRIỆU CHỨNG NGOÀI VẬN ĐỘNG TRÊN BỆNH NHÂN PARKINSON Nguyễn Văn Hướng*, Vũ Hồng Vân** TÓM TẮT đoán các triệu chứng ngoài vận động dựa vào các tiêu chuẩn của các hiệp hội chuyên môn Y khoa Quốc tế. 21 Mục tiêu: Nghiên cứu nhằm đánh giá và mô tả Kết quả: Tỷ lệ các triệu chứng ngoài vận động: rối một số đặc điểm triệu chứng ngoài vận động trên loạn thần kinh thực vật chiếm 75%. rối loạn giấc ngủ bệnh nhân mắc bệnh Parkinson. Đối tượng và (63,3%), rối loạn đại tiểu tiện (60%), đau (51,6%), phương pháp: Nghiên cứu trên 60 bệnh nhân được hạ huyết áp tư thế (30%), rối loạn chức năng sinh dục chẩn đoán mắc Bệnh Parkinson theo tiêu chuẩn của (41,6%). Sa sút trí tuệ, sút cân, loạn thần chỉ chiếm ngân hàng não hội Parkinson Vương quốc Anh. Chẩn 18,3%. Rối loạn chức năng sinh dục ở nhóm bệnh nhân nam giới cao gấp 18,2 lần so với nhóm bệnh *Trường Đại học Y Hà nội, nhân nữ giới có ý nghĩa thống kê với p < 0,000. Các **Bệnh viện Đại học Y Hà nội triệu chứng ngoài vận động khác giữa hai giới không Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Văn Hướng thấy có sự khác biệt (p > 0,05). Không có sự khác biệt Email: vanhuong73@hotmail.com về triệu chứng ngoài vận động giữa các nhóm tuổi có Ngày nhận bài: 26.2.2019 ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Kết luận: Triệu chứng Ngày phản biện khoa học: 2.4.2019 ngoài vận động trên Parkinson: Hay gặp là rối loạn Ngày duyệt bài: 15.4.2019 thần kinh thực vật, rối loạn giấc ngủ, rối loạn đại tiểu 76