Vi nhân giống cây oải hương (Lavandula angustifolia)

Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 42 – 49<br /> <br /> Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology<br /> <br /> VI NHÂN GIỐNG CÂY OẢI HƯƠNG (Lavandula angustifolia)<br /> Đỗ Tiến Vinh1, Mai Thị Phương Hoa1, Lê Bảo Ngọc1, Trần Văn Minh2<br /> Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> <br /> Thông tin chung:<br /> Ngày nhận bài: 11/04/2016<br /> Ngày nhận kết quả bình duyệt:<br /> 10/06/2016<br /> Ngày chấp nhận đăng: 09/2016<br /> Title:<br /> Micropropagation of Lavender<br /> (Lavandula angustifolia)<br /> Từ khóa:<br /> Lavandula angustifolia, tạo<br /> chồi, khử trùng, cấy mô,<br /> vi nhân giống<br /> Keywords:<br /> Lavandula angustifolia,<br /> creating the bud, disinfected,<br /> tissue culture,<br /> micropropagation<br /> <br /> ABSTRACT<br /> Lavender is widely used in medicine. Lavender essential oil has a sedative<br /> effect, antispasmodic, prevent respiratory failure. Lavender should be preserved<br /> and studied deeply about biotechnology in the production of oil. Lavender seeds<br /> are best disinfected at a concentration of 75% javel in 10 minutes. Medium<br /> appropriate for plant growth is WPM. WPM supplemented with BA (0.1 mg/L),<br /> sucrose (30 g/L) is suitable for the process of creating the bud. IAA<br /> concentration (0.5 mg/L) suitable for rooting process in vitro culture. Lavender<br /> trunk is strong and healthy, dark green, thick blade, roots grow as additional<br /> activated carbon into the media at concentrations (1.0 g/L).<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Oải hương được sử dụng rộng rãi trong y học. Tinh dầu oải hương có tác dụng<br /> an thần, chống co thắt, ngăn suy hô hấp. Oải hương cần được bảo tồn và<br /> nghiên cứu sâu sắc về công nghệ sinh học trong sản xuất tinh dầu. Hạt Oải<br /> hương được khử trùng ở nồng độ javel 75% trong 10 phút. Môi trường khoáng<br /> thích hợp để mẫu cây sinh trưởng phát triển tốt là WPM. Môi trường WPM có<br /> bổ sung BA (0,1 mg/L), sucrose (30 g/L) là thích hợp cho quá trình tạo chồi.<br /> Nồng độ IAA (0.5 mg/L) thích hợp cho quá trình nuôi cấy tạo rễ in vitro. Cây<br /> Oải hương có thân to khỏe, lá xanh đậm, phiến lá dày, rễ phát triển khi bổ sung<br /> than hoạt tính vào môi trường với nồng độ (1 g/L).<br /> <br /> ̉<br /> 1. MƠ ĐẦU<br /> <br /> Thành phần chính của tinh dầu oải hương là<br /> linalool, terpinen-4-ol, α-tecpineol, linalyl<br /> anthranilate, geranyl axetat, cumarin, borneol,<br /> lavandulol acetate và các thành phần khoáng như<br /> Mn, Cu, Ca, Mg, Zn, Fe, Na (Adaszyńska et al.,<br /> 2011). Cumarin và Herniarin (Brown, 1962) có<br /> tác dụng chống lại nguyên nhân gây nhiễm nấm<br /> phổ biến ở da người (Adam et al., 1998; Cassella<br /> et al., 2002). Đặc biệt tinh dầu oải hương còn có<br /> tác dụng an thần, chống co thắt, có lợi cho bệnh<br /> nhân suy hô hấp (Lis-Balchin & Hart,1999).<br /> <br /> Oải hương (Lavandula angustifolia) là một loại<br /> cây thuộc họ hoa môi (Lamiaceae) có xuất xứ từ<br /> vùng Địa Trung Hải, là loại cây bụi thường niên<br /> thường có màu tím đặc trưng và mùi thơm nồng,<br /> có khả năng chịu hạn cao, không ưa ẩm. Từ thời<br /> Trung Cổ, loài cây này đã được dùng làm hương<br /> liệu và thảo dược (Upson & Andrews, 2004). Oải<br /> hương được sử dụng rộng rãi trong y học, tinh dầu<br /> Oải hương có tác dụng làm giảm đau, chống<br /> chứng co giật, chữa thấp khớp, kích thích tim,<br /> chữa lành vết thương, bảo vệ dạ dày và giúp tăng<br /> sức khỏe (Oyen & Nguyen Xuan Dung, 1999).<br /> <br /> Trên thế giới, Oải hương được trồng rộng rãi ở<br /> nhiều nước như: Provence (Pháp), Banstead<br /> 42<br /> <br /> Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 42 – 49<br /> <br /> Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology<br /> <br /> gian chiếu sáng 8 giờ/ngày, môi trường nuôi cấy<br /> được khử trùng ở 1 atm trong thời gian 20 phút.<br /> <br /> (Anh), Furano - Hokkaido (Nhật Bản), Dungeness<br /> Sequim (Mỹ), Y Lê (Trung Quốc). Riêng ở nước<br /> ta, chỉ mới được trồng nhiều ở Đà Lạt (Ngô Thị<br /> Giáng Uyên, 2006) và được nhiều người biết đến<br /> qua các loại nước hoa, túi thơm và sản phẩm dược<br /> liệu. Nhu cầu sử dụng hoa Oải hương trong y học,<br /> làm đẹp, ẩm thực… tại nước ta ngày càng nhiều.<br /> Tuy nhiên, nguồn cung trong nước vẫn chưa được<br /> đảm bảo do những khó khăn trong quá trình trồng<br /> trọt, chăm sóc. Đặc biệt là chất lượng cây giống.<br /> <br /> Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí theo hoàn<br /> toàn ngẫu nhiên 3 lần lặp lại. Thí nghiệm được lặp<br /> lại 3 lần, mỗi lần 3 bình tam giác chứa 50 ml môi<br /> trường nuôi cấy, mỗi bình được nuôi cấy 5 mẫu.<br /> Kết quả nghiên cứu được xử lý thống kê bằng<br /> SAS 9.1.<br /> Thiế t kế thí nghiêm<br /> ̣<br /> Thí nghiệm 1: Vô trùng mẫu: Hạt đem rửa bằng<br /> xà bông, sau đó rửa sạch xà bông bằng nước máy,<br /> gói 20 hạt vào giấy đã hấp vô trùng đem vào tủ<br /> cấy lắc cồn 70% trong 1 phút rồi rửa lại bằng<br /> nước cất 3 lần. Tiếp theo ngâm trong Javel (nồng<br /> độ 50% - 75% - 100% với thời gian 10 - 15 phút),<br /> rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng, cuối cùng<br /> cấy vào môi trường MS có bổ sung đường sucrose<br /> 30 g/L, agar 8 g/L.<br /> <br /> Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ra đời<br /> đã không ngừng phát triển và thu được những<br /> thành tựu đáng kể. Kỹ thuật này nhanh chóng có<br /> vị trí quan trọng trong lĩnh vực sản xuất giống cây<br /> trồng (Trần Văn Minh, 2015). Với ưu điểm có thể<br /> nhân nhanh với số lượng lớn trong thời gian ngắn,<br /> giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ (Trần Văn<br /> Minh, 2015). Cây Oải Hương được nhân giống vô<br /> tính bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ sinh<br /> trưởng và phát triển đều, đẹp và năng suất cao<br /> hơn. Các cây con nhân từ hạt đã được tuyển chọn,<br /> có chất lượng tốt, năng suất cao, sạch bệnh (Võ<br /> Châu Tuấn và cs., 2013). Trong bài báo này,<br /> chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhân giống in<br /> vitro cây Oải hương đã được chọn lọc.<br /> <br /> Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của thành<br /> phần khoáng đến khả năng sinh trưởng và phát<br /> triển của cây Oải hương in vitro: Chồi Oải hương<br /> có kích thước 2 cm (có 2 lá) được nuôi cấy trên<br /> các môi trường 1/2 MS, MS, WPM, LV có bổ<br /> sung đường sucrose 30 g/L và agar 8 g/L.<br /> Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA đến<br /> khả năng tạo chồi của Oải hương in vitro: Chồi<br /> Oải hương có kích thước 2 cm (có 2 lá) được<br /> nuôi cấy trên môi trường WPM có bổ sung BA<br /> (0,1 - 0,3 - 0,5 – 1) mg/L, đường sucrose 30 g/L<br /> và agar 8 g/L.<br /> <br /> ́<br /> 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHAP NGHIÊN<br /> CỨU<br /> Vật liêu: Hạt giống cây Oải hương được cung cấ p<br /> ̣<br /> từ bô ̣ sưu tâ ̣p giố ng phò ng thí nghiê ̣m công nghê ̣<br /> sinh ho ̣c thực vâ ̣t khoa Khoa ho ̣c Nông nghiê ̣p và<br /> Công nghê ̣ Sinh ho ̣c, Trườ ng Đa ̣i ho ̣c Nguyễn Tấ t<br /> Thà nh.<br /> <br /> Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của auxin đến<br /> khả năng tạo rễ của Oải hương in vitro: Chồi Oải<br /> hương có kích thước 2 cm (có 2 lá) được nuôi<br /> cấy trên môi trường WPM có bổ sung IAA (0,1 0,3 - 0,5 – 1) mg/L, IBA (0,1 - 0,3 - 0,5 - 1 mg/L),<br /> NAA (0,1 - 0,3 - 0,5 - 1 mg/L), đường sucrose 30<br /> g/L và agar 8 g/L.<br /> <br /> Môi trường khoá ng cơ bản được sử dụng cho<br /> nghiên cứu là MS (Murashige-Skoog, 1962),<br /> WPM (Loyd & McCown, 1980), LV (Litvay et<br /> al., 1985). Các chất bổ sung vào môi trường nuôi<br /> cấy gồm: đường sucrose, BA (benzyladenine),<br /> NAA (α-napthaleneacetic acid), IBA (indole-3butyric acid), IAA (indole-3-acetic acid), than<br /> hoạt tính.<br /> <br /> Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của than hoạt<br /> tính đến khả năng sinh trưởng và phát triển của<br /> chồi Oải hương in vitro: Chồi Oải hương có kích<br /> thước 2 cm (có 2 lá) được nuôi cấy trên môi<br /> trường WPM có bổ sung IAA 0,5 mg/l, đường<br /> <br /> Điều kiện nuôi cấy: thí nghiê ̣m đươ ̣c thực hiê ̣n<br /> trong điề u kiê ̣n nhiệt độ 26 °C ± 2 °C, độ ẩm 70%<br /> - 80%, cường độ ánh sáng (2000 – 3000) lux, thời<br /> <br /> 43<br /> <br /> Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 42 – 49<br /> <br /> Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology<br /> <br /> sucrose 30 g/L và agar 8 g/L than hoạt tính (0,5 - 1<br /> - 1,5 - 2 - 2,5) g/L.<br /> <br /> -<br /> <br /> Các chỉ tiêu theo dõi<br /> <br /> -<br /> <br /> -<br /> <br /> Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%) = (tổng số mẫu nảy<br /> mầm/tổng số mẫu thí nghiệm) x 100.<br /> Tỷ lệ mẫu vô trùng (%) = (tổng số mẫu vô<br /> trùng/tổng số mẫu ban đầu) x 100.<br /> Số lá phát sinh được tính bằng cách đếm số lá<br /> sau 4 tuần nuôi cấy trừ cho số lá ban đầu.<br /> Số chồi phát sinh được tính bằng cách lấy số chồi<br /> sau 4 tuần nuôi cấy trừ cho số chồi ban đầu.<br /> Chiều cao của chồi được tính từ phần tiếp giáp giữa<br /> thân với rễ tới đỉnh chồi cao nhất.<br /> Chiều cao trung bình của chồi (cm) = tổng chiều<br /> cao chồi/tổng số chồi đo đếm.<br /> Chiều dài rễ được tính từ phần tiếp giáp giữa thân<br /> với rễ đến chóp rễ của rễ dài nhất.<br /> <br /> -<br /> <br /> Chiều dài của rễ (cm) = tổng chiều dài rễ/tổng số rễ<br /> đo đếm.<br /> Số rễ được tính bằng cách đếm số rễ sau 4 tuần<br /> nuôi cấy.<br /> Thời gian phát sinh rễ được ghi nhận từ ngày phát<br /> sinh.<br /> <br /> ́<br /> ̉<br /> ̉<br /> 3. KÊT QUA VÀ THAO LUẬN<br /> Thí nghiệm 1: Vô trùng mẫu<br /> Theo kết quả thể hiện ở Bảng 1, đối với cây Oải<br /> hương thì nồng độ javel và thời gian khử trùng<br /> thích hợp là 75% trong 10 phút (tỷ lệ vô trùng<br /> 75,45%, tỷ lệ nảy mầm 30,71%). Hạt Oải Hương<br /> bị nhiễm khi khử trùng ở nồng độ javel và thời<br /> gian khử trùng thấp (50% trong 10 đến 15 phút).<br /> Khi tăng nồng độ javel lên 100% thì tỷ lệ nảy<br /> mầm của hạt giảm đi đáng kể (22,86%).<br /> <br /> Bảng 1. Nồng độ javel và thời gian vô trùng mẫu hạt Oải hương<br /> <br /> Dung dịch Javel<br /> Nồng độ (%)<br /> <br /> Thời gian (phút)<br /> <br /> Tỷ lệ mẫu vô<br /> trùng (%)<br /> <br /> 1.1<br /> <br /> 50<br /> <br /> 10<br /> <br /> 50,00c<br /> <br /> 27,33ab<br /> <br /> 1.2<br /> <br /> 50<br /> <br /> 15<br /> <br /> 73,33b<br /> <br /> 25,41ab<br /> <br /> 1.3<br /> <br /> 75<br /> <br /> 10<br /> <br /> 75,45b<br /> <br /> 30,71a<br /> <br /> 1.4<br /> <br /> 75<br /> <br /> 15<br /> <br /> 83,53ab<br /> <br /> 20,17b<br /> <br /> 1.5<br /> <br /> 100<br /> <br /> 10<br /> <br /> 85,71ab<br /> <br /> 17,65c<br /> <br /> 1.6<br /> <br /> 100<br /> <br /> 15<br /> <br /> 100,00a<br /> <br /> 22,86b<br /> <br /> NT<br /> <br /> Hình 1. Vô trùng mẫu hạt Oải Hương.<br /> (A) Hạt Oải hương nảy mầm; (B) Chồi Oải hương sau 4 tuần nuôi cấy<br /> 44<br /> <br /> Tỷ lệ mẫu nảy mầm<br /> (%)<br /> <br /> Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 42 – 49<br /> <br /> Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology<br /> <br /> chồi Oải hương; môi trường LV mẫu nuôi cấy có phát<br /> triển (số chồi 0,66 chồi; chiều cao 3,36 cm và số lá<br /> 6,06 lá) nhưng vẫn kém hơn môi trường WPM cụ thể<br /> chồi Oải hương cho kết quả sinh trưởng phát triển tốt<br /> nhất với các chỉ tiêu số chồi phát sinh (2,46 chồi), số<br /> lá (15,20 lá) và chiều cao (5,28 cm<br /> <br /> Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thành phần<br /> khoáng đến khả năng sinh trưởng và phát triển<br /> của cây Oải hương in vitro<br /> Sau 4 tuần nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng<br /> khoáng khác nhau kết quả ở Bảng 2 cho thấy: Môi<br /> trường 1/2 MS và MS không thích hợp để nuôi cấy<br /> Bảng 2. Môi trường khoáng nuôi cấy cây Oải hương in vitro<br /> <br /> NT<br /> <br /> Môi trường<br /> <br /> Số chồi phát sinh (chồi)<br /> <br /> Chiều cao chồi (cm)<br /> <br /> Số lá phát sinh (lá)<br /> <br /> 2.1<br /> <br /> ½ MS<br /> <br /> 0,00b<br /> <br /> 2,00c<br /> <br /> 2,00b<br /> <br /> 2.2<br /> <br /> MS<br /> <br /> 0,00b<br /> <br /> 2,00c<br /> <br /> 3,13b<br /> <br /> 2.3<br /> <br /> WPM<br /> <br /> 2,46a<br /> <br /> 5,28a<br /> <br /> 15,20a<br /> <br /> 2.4<br /> <br /> LV<br /> <br /> 0,66b<br /> <br /> 3,36b<br /> <br /> 6,06b<br /> <br /> Hình 2. Nuôi cấy Oải hương trên các môi trường (A) WPM; (B) LV; (C) MS; (D) 1/2 MS<br /> <br /> chồi phát sinh là cao nhất (3,06 chồi), chồi to khỏe<br /> chiều cao đạt 6,35 cm và số lá 18,86 lá. Khi nâng<br /> nồng độ BA lên (0,3 - 1) mg/L thì khả năng tạo<br /> chồi giảm đi rõ rệt (2,73 đến 2,40 chồi), chiều cao<br /> giảm (5,28 - 2,71) cm và số lá hình thành giảm lần<br /> lượt 13,26 đến 8,26 lá. Điều này cho thấy nồng độ<br /> <br /> Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA đến khả<br /> năng tạo chồi cây Oải hương in vitro<br /> Kết quả khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng<br /> tạo chồi của Oải hương in vitro thể hiện sự khác<br /> biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm<br /> thức. Ở nghiệm thức 3.2, nồng độ BA 0,1 mg/L, số<br /> 45<br /> <br /> Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 42 – 49<br /> <br /> Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology<br /> <br /> BA (0, 3 - 1) mg/L đã ức chế khả năng sinh trưởng<br /> của cây. Như vậy, nghiệm thức 3.2 nồng độ BA 0,1<br /> mg/L là thích hợp cho quá trình nuôi cấy tạo chồi<br /> <br /> Oải hương in vitro. Chồi to khỏe vươn thẳng, lá<br /> xanh, phát triển đồng đều.<br /> <br /> Bảng 3. Nồng độ BA nuôi cấy tạo chồi của Oải hương in vitro<br /> <br /> NT<br /> <br /> BA(mg/L)<br /> <br /> Số chồi phát sinh (chồi)<br /> <br /> Chiều cao chồi (cm)<br /> <br /> Số lá phát sinh (lá)<br /> <br /> 3.1<br /> <br /> 0,0<br /> <br /> 2,46b<br /> <br /> 2,76c<br /> <br /> 9,47bc<br /> <br /> 3.2<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 3,06a<br /> <br /> 6,35a<br /> <br /> 18,86a<br /> <br /> 3.3<br /> <br /> 0,3<br /> <br /> 2,40b<br /> <br /> 2,71c<br /> <br /> 8,26c<br /> <br /> 3.4<br /> <br /> 0,5<br /> <br /> 2,73ab<br /> <br /> 5,28b<br /> <br /> 13,26b<br /> <br /> 3.5<br /> <br /> 1,0<br /> <br /> 2,66ab<br /> <br /> 2,88c<br /> <br /> 9,53bc<br /> <br /> Hình 3. Nuôi cấy Oải hương trên môi trường có bổ sung.<br /> (A) BA 0,1 mg/L; (B) 0,3 mg/L; (C) 0,5 mg/l; (D) 1,0 mg/L<br /> <br /> IAA thì sự phát triển của cây oải hương là tốt nhất<br /> cụ thể ở nồng độ IAA 0,1 mg/L có 2,26 rễ, chiều<br /> dài rễ 1,06 cm. Tăng nồng độ IAA lên 0,3 mg/L<br /> thì số rễ là 1,80 rễ, chiều dài rễ 0,94 cm và nồng<br /> độ IAA 0,5 mg/L cho kết quả tốt nhất số rễ 2,60<br /> <br /> Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của auxin đến khả<br /> năng tạo rễ của Oải hương in vitro<br /> Xét trên các chỉ tiêu số rễ, chiều dài rễ, thời gian<br /> phát sinh rễ, các nghiệm thức sử dụng IBA và<br /> NAA cho thấy không thích hợp cho quá trình nuôi<br /> cấy tạo cây hoàn chỉnh. Ở nghiệm thức sử dụng<br /> 46<br /> <br />