Vi sinh đại cương P2

Chia sẻ: Mr Yo Ko | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:19

Thêm vào BST

Báo xấu

102
lượt xem 52
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Phương tiện và thủ thuật trong vi sinh vật

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Vi sinh đại cương P2

®¹i häc cÇn th¬ - khoa n«ng nghiÖp gi¸o tr×nh gi¶ng d¹y trùc tuyÕn §êng 3/2, Tp. CÇn Th¬. Tel: 84 71 831005, Fax: 84 71 830814 Website: http://www.ctu.edu.vn/knn email: dminh@ctu.edu.vn, vtanh@ctu.edu.vn Vi sinh ®¹i c−¬nG Ch−¬ng 2: Ph−¬ng tiÖn vµ thñ thuËt trong vi sinh häc
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 CHÆÅNG II PHÆÅNG TIÃÛN VAÌ THUÍ THUÁÛT DUÌNG TRONG VI SINH HOÜC **** A. PHÆÅNG TIÃÛN : I. KÊNH HIÃØN VI QUANG HOÜC : 1. Kênh hiãøn vi thæåìng : Kênh naìy gäöm nhiãöu tháúu kênh quang hoüc âãø phoïng âaûi váût quan saït lãn nhiãöu láön. Kênh coï 2 hãû thäúng tháúu kênh : váût kênh vaì thë kênh. Váût kênh gäöm nhiãöu tháúu kênh, phoïng âaûi váût quan saït lãn nhiãöu láön hån næîa. Do âoï noï coï khaí nàng phoïng âaûi váût lãn tæì vaìi tràm âãún khoaíng 25000 láön låïn hån. Ngoaìi hãû thäúng tháúu kênh chênh naìy, caïc kênh hiãøn vi coìn coï hãû thäúng chiãúu saïng. Âån giaín nháút laì mäüt gæång phàóng hoàûc gæång loîm âãø phaín chiãúu aïnh saïng tråìi hoàûc aïnh saïng cuía mäüt ngoün âeìn, taûo thaình mäüt chuìm saïng chiãúu xuyãn qua váût quan saït. Âãø coï thãø âiãöu chènh âæåüc cæåìng âäü chiãúu saïng, coï mäüt hãû thäúng quang hoüc gäöm nhiãöu tháúu kênh coï muûc âêch biãún chuìm tia saïng thaình chuìm tia häüi tuû nãn tàng cæåìng âäü chiãúu saïng lãn (Hçnh 2-1). Kênh hiãøn vi quan saït váût nhåì caïc tia saïng chiãúu xuyãn qua váût nhåì âoï coï thãø quan saït âæåüc cå cáúu bãn trong cuía váût nãúu chuïng ta càõt moíng váût ra. Yãúu âiãøm cuía kênh naìy laì khäng quan saït âæåüc hçnh daûng näøi bãn ngoaìi cuía váût vç chè nhçn âæåüc váût trãn cuìng mäüt màût phàóng thàóng goïc våïi äúng ngàõm. 2. Kênh phoïng âaûi hai äúng ngàõm hay kênh hiãøn vi soi näøi (loupe binoculaire, stereomicroscope) : Kênh naìy duìng âãø quan saït bãn ngoaìi cuía váût våïi hçnh aính näøi cuía váût áúy. Âäü phoïng âaûi thæåìng nhoí, khäng quaï 200 láön. Kênh naìy gäöm hai äúng ngàõm gheïp song song nhau vaì quan saït våïi hai màût cuìng mäüt luïc. Nhåì âoï chuïng ta tháúy âæåüc hçnh näøi cuía váût. 6
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 Hçnh 2-1: Hçnh veî màût càõt doüc cuía mäüt mäüt kênh hiãøn vi quang hoüc thæåìng duìng 7
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 Khaïc våïi kênh hiãøn vi thæåìng, kênh naìy duìng tia saïng phaín chiãúu cuía váût âãø quan saït (Hçnh 2-2). Hçnh 2-2: Kênh hiãøn vi soi näøi (kênh phoïng âaûi hai äúng ngáúm). 3. Kênh hiãøn vi âaïy âen (Darkfield microscope) : Kênh hiãøn vi naìy gäöm mäüt kênh hiãøn vi thæåìng coï gàõn bäü häüi tuû tia saïng (condenser) âàûc biãût. Bäü häüi tuû naìy hoàûc âæåüc cáúu taûo âàûc biãût hoàûc âæåüc che åí pháön giæîa, do âoï ngàn caïc tia saïng chiãúu thàóng vaìo váût maì chè cho caïc tia saïng chiãúu xiãn vaìo váût maì thäi (Hçnh 2-3). Hçnh 2-3: Så âäö bäü tuû quang âaïy âen trong mäüt kênh hiãøn vi âaïy âen 8
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 Khi quan saït, chuïng ta seî tháúy thë træåìng coï maìu âen, vç chè quan saït âæåüc våïi tia saïng xiãn. Nãúu coï váût, tia saïng xiãn chiãúu vaìo váût seî cho tia bæïc xaû, chuïng ta quan saït âæåüc aính bãn ngoaìi cuía váût nhåì caïc tia bæïc xaû naìy. Cäng duûng cuía kênh hiãøn vi naìy laì coï thãø quan saït váût khäng cáön nhuäüm maìu do âoï quan saït âæåüc váût âang coìn säúng. 4. Kênh hiãøn vi tæång phaín (Contrast phase microscope) : Cuìng muûc âêch våïi kênh hiãøn vi âaïy âen, kênh hiãøn vi tæång phaín duìng âãø quan saït caïc váût quaï nhoí trong tçnh traûng âang säúng cuía váût áúy (khäng nhuäüm maìu). Kênh hiãøn vi tæång phaín cho hçnh aính cuía váût roî hån kênh hiãøn vi âaïy âen, tháúy âæåüc caïc chi tiãút bãn trong. Kênh hiãøn vi naìy cuîng chè laì kênh hiãøn vi thæåìng, nhæng coï gàõn thãm hai bäü pháûn âàûc biãût: voìng måí tia saïng (annular diaphram) åí bäü pháûn âiãöu chènh læu læåüng aïnh saïng vaì âéa taûo tæång phaín hay taûo lãûch pha (phase shipting element) âàût trong váût kênh (Hçnh 2-3). Nhåì 2 bäü pháûn naìy, aïnh saïng âi ngang qua váût quan saït âæåüc phán têch thaình hai chuìm tia, mäüt chuìm tia saïng cæïng âi ngang qua váût vaì chuìm tia saïng bë khuïc xaû âi qua chung quanh váût. Vç váût cháút trong vi sinh váût coï chiãút suáút gáön bàòng nhau do âoï ráút khoï nháûn tháúy nãúu khäng nhuäüm maìu (nhæ khi ta quan saït mäüt miãúng thuíy tinh âàût trong cháûu næåïc). Nhåì duìng 2 chuìm tia coï âäü daìi soïng khaïc nhau chiãúu xuyãn qua nãn ta coï thãø tháúy âæåüc caïc váût khaïc nhau coï chiãút suáút gáön giäúng nhau. II. KÊNH HIÃØN VI ÂIÃÛN TÆÍ : 1. Nguyãn tàõc : Kênh hiãøn vi quang hoüc ngaìy caìng âæåüc caíi tiãún. Tæì tháûp niãn 1690 âãún nay, kênh hiãøn vi tæì laì mäüt tháúu kênh âån giaín våïi âäü phoïng âaûi läúi vaìi mæåi láön, ngaìy nay chuïng ta coï kênh hiãøn vi quang hoüc våïi âäü phoïng âaûi 2.500 láön. Tuy váûy kênh hiãøn vi quang hoüc khäng thãø væåüt lãn khoíi giåïi haûn trãn âæåüc, do âoï khäng thãø giuïp chuïng ta quan saït âæåüc viruït. Lyï do cuía giåïi haûn naìy laì vç aïnh saïng thæåìng maì chuïng ta duìng âãø quan saït trong kênh hiãøn vi quang hoüc, coï âäü daìi soïng tæång âäúi låïn, tæì 400 - 700mµ. Våïi âäü daìi soïng låïn nhæ váûy chuïng ta khäng thãø quan saït caïc váût nhoí, nhæ thê duû trong Hçnh 2-5. 9
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 Hçnh 2-4: Så âäö âæåìng âi cuía caïc tia saïng trong kênh hiãøn vi tæång phaín âãø taûo ra sæû lãûch pha giuïp cho tháúy roî caïc chi tiãút bãn trong máùu váût hån. 10
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 Hçnh 2-5: Thê duû chæïng minh vç sao kênh hiãøn vi quang hoüc khäng thãø quan saït váût coï kêch thæåïc quaï nhoí (viruït). A: våïi caïc haût buûi mën (bæåïc soïng cuía tia âiãûn tæí) baìn tay seî hiãûn roî ra våïi âáöy âuí chi tiãút cuía caïc ngoïn tay. B: Våïi caïc haût to hån (bæåïc soïng cuía aïnh saïng tháúy âæåüc), caïc ngoïn tay khäng thãø hiãûn ra âæåüc. Do âoï trong hæåïng phaït minh ra nhæîng duûng cuû giuïp chuïng ta quan saït âæåüc nhæîng váût cæûc nhoí, nàm 1931 Knoll vaì Ruska åí Âæïc, âaî thæûc hiãûn láön âáöu tiãn kênh hiãøn vi âiãûn tæí. Kênh hiãøn vi naìy aïp duûng nguyãn tàõc laì nãúu mäüt nguäön bàõn âiãûn tæí âàût åí mäüt hiãûu thãú cao (khoaíng 30 - 150 KV) seî bàõn caïc âiãûn tæí coï âäü daìi soïng ráút ngàõn (0,5mµ). Caïc âäü daìi soïng naìy coï thãø bë tæì træåìng laìm lãûch âæåìng âi (giäúng nhæ tháúu kênh laìm lãûch âæåìng âi cuía tia saïng) (Hçnh 2-6). AÏp duûng nguyãn tàõc trãn kênh hiãøn vi âiãûn tæí âæåüc cáúu taûo nhæ sau . 2. Cáúu taûo kênh hiãøn vi âiãûn tæí xuyãn thàóng (transmittion electron microscope): (Hçnh 2-7) Táút caí caïc bäü pháûn âæåüc âàût trong mäüt truû kên vaì taûo chán khäng bàòng mäüt båm huït. Trong chán khäng hoaût âäüng cuía âiãûn tæí khäng bë caín tråí. Caïc âiãûn tæí bàõn xuyãn qua máùu váût âæåüc caïc váût kênh vaì thë kênh bàòng âiãûn tæí laìm taín räüng ra (phán kyì), sau cuìng hiãûn lãn maìng huyình quang coï bäü maïy chuûp aính âãø chuûp aính khi cáön. Tia âiãûn tæí khi xuyãn qua máùu váût seî bë ngàn caín hoàûc khäng 11
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 tuyì theo tênh cháút cuía máùu váût seî hiãûn hçnh trãn maìng huyình quang thaình aính âen tràõng. Caïc nåi cuía máùu váût ngàn caín tia âiãûn tæí seî coï maìu âen. (A) (B) Hçnh 2-6: Nguyãn tàõc cáúu taûo cuía kênh hiãøn vi âiãûn tæí (A) so saïnh våïiì kênh hiãøn vi quang hoüc (B) Hçnh 2-7: AÍnh chuûp bãn ngoaìi cuía mäüt kênh hiãøn vi âiãûn tæí xuyãn thàóng 12
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 Âãø coï thãø quan saït våïi kênh hiãøn vi âiãûn tæí, máùu váût âæåüc càõt laït (vi pháùu thuáût) thaình nhæîng laït tháût moíng, bãö daìy dæåïi 1µ, coï thãø âaût âãún khoaíng 0,02µ. Âãø càõt nhæîng laït moíng nhæ váûy máùu váût âæåüc âënh hçnh, sau âoï ngám vaì âuïc khuän räöi càõt laït våïi maïy siãu vi phán. Dao âãø càõt laït laìm bàòng thuíy tinh, âãø coï thãø taûo nhæîng caûnh tháût beïn måïi coï thãø taûo âæåüc nhæîng pháùu thæïc cåî âoï. Máùu váût cáön âæåüc nhuäüm våïi caïc cháút ngàn caín âiãûn tæí âãø taûo sæû tæång phaín cuía hçnh aính trãn maìng huyình quang. Coï ráút nhiãöu hoïa cháút duìng âãø nhuäüm máùu váût, thæåìng gàûp laì basic lead citrate, hoàûc uranyl acetate 1% hoàûc phosphotungstic acid ... Vé chæïa máùu váût laì miãúng læåïi âäöng, bãn trãn phuí bàòng mäüt låïp phim tháût moíng bàòng váût cháút khäng háúp thu hoàûc khäng laìm taín maït tia âiãûn tæí, phaíi âuí bãön, khäng bë tia âiãûn tæí bàõn thuíng. Ngoaìi ra âãø quan saït hçnh näøi cuía váût, coï thãø phuí lãn trãn mäüt låïp moíng kim loaûi (shadowing). Thuí thuáût naìy âæåüc thæûc hiãûn trong mäüt läöng kên chán khäng, såüi kim loaûi vaìng hoàûc palladium ..., âæåüc âun noïng bàòng âiãûn vaì bäúc håi, håi kim loaûi råi xuäúng phuí trãn váût quan saït. Nãúu váût quan saït âæåüc âàût nghiãng so våïi hæåïng phuí cuía kim loaûi, seî coï boïng ngaî tuìy theo chiãöu cao cuía váût, nhåì âoï khi quan saït chuïng ta tháúy âæåüc hçnh cuía váût näøi lãn. AÍnh do kênh hiãøn vi âiãûn tæí cung cáúp coï thãø quan saït træûc tiãúp âæåüc, cuîng coï thãø chuûp aính nhåì mäüt bäü pháûn chuûp aính âàût bãn dæåïi maìng huyình quang. 3. Cáúu taûo kênh hiãøn vi âiãûn tæí soi näøi (Scanning electron microscope) : Hçnh 2-8: Kçnh hiãøn vi âiãûn tæí näøi (Scanning electron microscope) 13
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 Ngoaìi ra, våïi cuìng nguyãn tàõc trãn, tia âiãûn tæí thay vç xuyãn qua máùu váût, trong kênh hiãøn vi âiãûn tæí soi näøi (scanning electron microscope) (cuîng coìn goüi laì kênh hiãøn vi âiãûn tæí queït) tia âiãûn tæí chiãúu lãn bãö màût cuía máùu váût vaì phaín chiãúu laûi vaì hiãûn hçnh aính bãn ngoaìi cuía máùu váût lãn maìng huyình quang. (Hçnh 2-8) Âãø coï thãø quan saït våïi kênh hiãøn vi âiãûn tæí näøi, máùu váût cáön âæåüc phuí bàòng mäüt låïp kim loaûi, thæåìng duìng vaìng, âãø coï thãø phaín chiãúu caïc tia âiãûn tæí laûi. II. MAÏY LY TÁM : Maïy ly tám laì duûng cuû duìng âãø làõng caïc váût thãø to trong mäüt dung dëch hoàûc âãø phán taïch caïc váût thãø coï khäúi læåüng khaïc nhau trong mäüt dung dëch. Maïy ly tám coï thãø laì : 1. Bäü ly tám quay tay : Quay bàòng tay, cáúu taûo âån giaín. Váûn täúc quay thæåìng keïm, khoaíng 700 - 1500 voìng/phuït. Thæåìng duìng âãø làõng tuyãún truìng, baìo tæí náúm, vi khuáøn. 2. Maïy ly tám thäng thæåìng : Quay bàòng âäüng cå âiãûn, váûn täúc thæûc duûng täúi âa khoaíng 16000 voìng/phuït, thäng thæåìng laì 3.000 voìng/phuït . Ráút thäng duûng trong caïc phoìng nghiãn cæïu vi sinh hoüc. 3. Maïy siãu ly tám : (Ultracentrifuge) Coï váûn täúc quay ráút nhanh, coï thãø âaût âãún 100.000 voìng/phuït. Tuy nhiãn åí váûn täúc trãn 25.000 voìng/phuït, maïy cáön coï bäü pháûn taûo chán khäng cho näöi quay khäng bë ma saït vç khäng khê, âãø traïnh nguy hiãøm. Ngoaìi ra, maïy coìn âæåüc trang bë thãm bäü pháûn laìm laûnh åí nhiãût âäü cäú âënh. Maïy ráút cáön thiãút cho caïc nghiãn cæïu vãö viruït (virus). Khi sæí duûng maïy ly tám, nháút laì maïy siãu ly tám cáön quan tám âãún viãûc laìm cán bàòng troüng læåüng caïc äúng ly tám. Mäüt sæû chãnh lãûch nhoí vãö troüng læåüng giæîa hai äúng ly tám âäúi xæïng nhau, coï thãø gáy nguy hiãøm chãút ngæåìi nãúu quay våïi váûn täúc quay låïn. 14
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 B. CAÏC THUÍ THUÁÛT CÀN BAÍN AÏP DUÛNG TRONG VI SINH HOÜC : I. NHUÄÜM MAÌU : Khi quan saït máùu vi sinh váût qua kênh hiãøn vi quang hoüc, pháön låïn cå cáúu bãn trong cuía vi sinh váût coï chiãút suáút gáön bàòng nhau cho nãn ráút khoï phán biãût âæåüc. Âãø coï thãø quan saït dãù daìng hån chuïng ta phaíi nhuäüm maìu váût. Tuìy theo loaûi maìu aïp duûng toaìn thãø vi sinh váût hoàûc mäüt vaìi cå quan bãn trong vi sinh váût àn maìu khiãún cho hçnh aính caïc cå quan naìy coï thãø quan saït âæåüc roî raìng hån. Pháön låïn maìu nhuäüm trong vi sinh hoüc laì caïc muäúi vaì âæåüc phán laìm hai nhoïm : nhoïm maìu acid gäöm caïc muäúi maì ion mang maìu laì anion (mang âiãûn têch -) vaì nhoïm caïc bazå coï ion mang maìu laì cation (mang âiãûn têch +). Thê duû : sodium+ eosinate- laì maìu eosin coï tênh acid vaì methylene blue (methylene+ chloride- ) coï tênh bazå. Maìu acid vç ion mang maìu håüp våïi mäüt bazå (NaOH) âãø cho ra mäüt muäúi maìu. Coìn maìu bazå vç ion mang maìu coï taïc âäüng nhæ mäüt bazå, phäúi håüp våïi mäüt acid (HCl) cho ra mäüt muäúi maìu. Mäüt caïch täøng quaït maìu acid phäúi håüp chàût (àn maìu) våïi thaình pháön cuía tãú baìo cháút cuía tãú baìo vaì maìu bazå phäúi håüp (àn maìu) våïi thaình pháön cuía nhán tãú baìo (coï tênh acid). Mäüt säú caïc maìu nhuäüm chè bao phuí ngoaìi màût máùu váût âæåüc nhuäüm do quaï trçnh háúp thu hoàûc laì noï tan hay kãút tuía chung quanh váût âæåüc nhuäüm. 1. Nhuäüm âån : Pháön låïn duìng maìu âãø nhuäüm âån, thæåìng duìng laì methylene blue, crystal violet, basic fuchsin. Chuïng thuäüc nhoïm maìu aniline (hàõc in). Coï ráút nhiãöu cäng thæïc vaì thuí thuáût âãø nhuäüm âån máùu váût. Âäúi våïi vi khuáøn, thæåìng duìng dung dëch Loeffler's methylene blue : - Methylene blue 0,3g. Dëch A Dëch B : KOH (0,01%) 100ml. - Ethyl alcohol 95% 30,0ml. 15
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 Hoìa hai dung dëch A vaì B laûi, coï Loffler's methylene blue. Âãø daình láu âæåüc . Dung dëch Loffler giuïp quan saït âæåüc nhiãöu chi tiãút vãö hçnh daûng vaì cáúu truïc cuía tãú baìo. Hçnh 2-9: Kãút quaí cuía viãûc nhuäüm maìu trong khi quan saït vi khuáøn dæåïi kênh hiãøn vi quang hoüc: (A): nhuäüm våïi crystal violet; (B) nhuäüm våïi iodine; (C) nhuäüm våïi cäön; (D) nhuäüm våïi safranin; (E) nhuäüm våïi nigrosin. (F) hçnh veî chè caïc vi khuáøn gram + vaì gram - cho tháúy coï sæû àn maìu khaïc nhau vaì thãø hiãûn hçnh daûng khaïc nhau giæîa vi khuáøn gram + vaì gram -. 16
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 Âäúi våïi náúm, thæåìng duìng dung dëch Lactophenol cotton blue : - Phenol (tinh thãø tinh roìng) 20g. - Lactic acid (sp.gr. 1.21) 20g. - Glycerol 40g. - Næåïc cáút 20ml. - Cotton blue (methyl blue) 0,05g. Cotton blue nhuäüm xanh nguyãn sinh cháút cuía náúm. Lactophenol coï chiãút xuáút laì 1,45 nãn giuïp quan saït náúm roî raìng hån. Lactophenol coï laìm cho tãú baìo håi co laûi nãn máùu quan saït âæåüc håi nhoí hån bçnh thæåìng. 2. Nhuäüm gram : Duìng âãø nhuäüm vi khuáøn. Âáy laì phæång phaïp nhuäüm maìu coï phán biãût, vç khäng phaíi nhuäüm táút caí vi khuáøn maì chè nhuäüm mäüt säú chi vi khuáøn coìn caïc chi vi khuáøn khaïc thç khäng àn maìu. Qua phæång phaïp nhuäüm Gram, chuïng ta chia vi khuáøn ra laìm hai nhoïm, vi khuáøn gram dæång vaì vi khuáøn gram ám. Phæång phaïp naìy ráút quan troüng trong viãûc phán loaûi vi khuáøn. Âãø nhuäüm gram, træåïc hãút ta nhuäüm máùu váût våïi maìu crystal violet (läúi 30 giáy). Sau khi ræía saûch maìu, nhuäüm thãm våïi dung dëch lugol iodine (läúi 30 giáy). Táút caí vi khuáøn âãöu àn maìu têm sáùm. Âem nhuïng máùu trong cäön 95o (20 giáy âãún 1 phuït), cäön seî táøy maìu têm trãn mäüt säú vi khuáøn. Ta goüi caïc vi khuáøn coìn giæî maìu têm laì vi khuáøn gram dæång (+), coìn vi khuáøn bë táøy maìu laì gram ám (-). Âãø coï thãø phaït hiãûn vi khuáøn gram -, ta nhuäüm máùu våïi maìu âoí eosin, hoàûc âoí safranin hoàûc luûc brillant green hoàûc náu Bismarck brown. Vi khuáøn gram + coï maìu têm coìn vi khuáøn gram- coï maìu âoí hoàûc luûc hoàûc náu tuìy hoïa cháút. Lyï do cuía vi khuáøn gram - bë khæí maìu têm båíi cäön 95o laì do cáúu taûo lyï tênh vaì hoïa tênh cuía vaïch tãú baìo vi khuáøn 2 nhoïm naìy khaïc nhau. Vi khuáøn gram + coï vaïch daìy coìn vi khuáøn gram - coï vaïch gäöm nhiãöu låïp phæïc taûp. Cáúu taûo lyï tênh vaì hoïa tênh cuía vaïch vi khuáøn gram + âaî taûo ra tçnh traûng giæî maìu têm crystal violet vaì iod ráút chàût nãn khäng bë cäön khæí. 17
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 3. Nhuäüm roi : Âæåìng kênh roi cuía vi khuáøn ráút nhoí nãn khoï quan saït âæåüc qua kênh hiãøn vi quang hoüc. Âãø quan saït âæåüc cáön nhuäüm maìu âàûc biãût. Nguyãn tàõc laì, træåïc hãút phuí lãn roi mäüt låïp hoïa cháút âãø laìm cho roi to ra, vaì hoïa cháút naìy cuîng giæî maìu nhuäüm. Hoïa cháút âãø tä phuí roi coï thãø laì tannic acid, maìu nhuäüm coï thãø duìng pararosaniline. II. KHÆÍ TRUÌNG : Trong khi nghiãn cæïu vi sinh váût, chuïng ta thæåìng aïp duûng thuí thuáût nuäi cáúy vi sinh váût thuáön chuíng. Trong mäüt äúng nghiãûm hoàûc loü kên hoàûc âéa petri nãúu chè chæïa thuáön mäüt chuíng loaûi vi sinh váût maì thäi, ta goüi laì mäüt meí cáúy (inoculum). Trong luïc nuäi cáúy, âãø coï thãø giæî âæåüc mäüt meí cáúy thuáön chuíng, cáön phaíi thæûc hiãûn viãûc nuäi cáúy trong âiãöu kiãûn vä truìng. Vi sinh váût coï màût åí khàõp nåi, trong khäng khê, trong håi thåí ... vaì trong mäi træåìng âãø nuäi cáúy nãn laìm cho meí cáúy bë nhiãùm vi sinh váût laû. Do âoï, chuïng ta cáön khæí truìng mäi træåìng vaì duûng cuû nuäi cáúy. 1. Nguyãn tàõc : Coï 3 nguyãn tàõc trong khæí truìng : a/ Thanh truìng (Sterilization) : Tiãu diãût táút caí vi sinh váût trãn vaì trong duûng cuû cáön thanh truìng. Thæåìng duìng nhiãût, håi nhæ formol, ethylen oxide ... caïc dung dëch hoïa cháút nhæ HgCl2, Sodium hypochloride ... hoàûc duìng caïc tia cæûc têm, tia gamma. Hoàûc taïch vi sinh váût ra khoíi dung dëch cáön thanh truìng våïi phæång phaïp ly tám, phæång phaïp loüc, .. b/ Táøy âäüc (disinfection) : Chè diãût hoàûc taïch caïc vi sinh váût coï thãø gáy nhiãùm truìng, khäng cáön phaíi taïch hoàûc diãût táút caí caïc vi sinh váût. Thê duû : táøy âäüc sæîa tæåi (milk pasteurization). Âãø gçn giæî sæîa tæåi trong nhiãöu ngaìy åí nhiãût âäü laûnh maì sæîa khäng hæ, ngæåìi ta âæa sæîa lãn âãún 71 - 80oC trong 15 - 30 giáy âäöng häö. ÅÍ nhiãût âäü vaì thåìi gian naìy táút caí caïc vi sinh váût chëu laûnh âãöu chãút hãút, chè coìn laûi vi sinh váût chëu nhiãût âäü trung bçnh vaì vi sinh váût chëu noïng. Hai nhoïm naìy khäng phaït triãøn âæåüc åí nhiãût âäü laûnh cuía tuí täön træî (4 -10oC). Ngoaìi ra phæång phaïp táøy âäüc naìy khäng laìm máút dæåîng cháút coï trong sæîa tæåi. 18
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 c/ Kiãöm haîm (microbistasis) : (Stasis = giæî laûi, khäng cho phaït triãøn thãm). Nguyãn tàõc náöy khäng coï muûc âêch giãút vi sinh váût ngay maì chè giæî vi sinh váût coï sàôn trong tçnh traûng báút âäüng (khäng gia tàng thãm máût säú) trong mäüt thåìi gian láu daìi vaì sau âoï vi sinh váût áúy tæû chãút dáön maì khäng sinh saín thãm. Thæåìng duìng caïc taïc nhán nhæ sæû khä raïo, nhiãût âäü laûnh, cháút khaïng sinh, caïc antiseptic, caïc hoïa cháút thuäüc nhoïm sulfonamic, mäüt säú maìu nhuäüm dung dëch æu træång. 2. Phæång phaïp : Caïc phæång phaïp khæí truìng thæåìng duìng laì : a/ Phæång phaïp duìng nhiãût : Duìng nhiãût khä : aïp duûng âãø thanh truìng caïc duûng cuû khäng chaïy, thê duû nhæ kim loaûi, thuíy tinh, ... Pháön låïn vi sinh váût bë giãút chãút åí 100oC. Tuy nhiãn coï mäüt säú chi vi khuáøn coï khaí nàng taûo näüi baìo tæí (näüi baìo tæí coìn âæåüc goüi laì nha baìo = endospore) vaì chëu âæûng âæåüc nhiãût âäü naìy trong mäüt thåìi gian. Do âoï khi thanh truìng duûng cuû bàòng phæång phaïp nhiãût khä chuïng ta phaíi duìng nhiãût âäü 150oC- 180oC trong täúi thiãøu 1 giåì hoàûc 120oC trong täúi thiãøu 4 giåì, måïi âaím baío giãút âæåüc vi sinh váût baïm trãn duûng cuû. Duìng nhiãût æåït : âãø thanh truìng hoàûc táøy âäüc mäi træåìng nuäi cáúy, thæûc pháøm hoàûc duûng cuû, hoïa cháút. + Thæåìng duìng håi næåïc säi (100oC) âãø táøy âäüc våïi muûc âêch loaûi viruït vaì mäüt säú vi khuáøn thæåìng gàûp. Thæåìng aïp duûng khi nghiãn cæïu viruït. Thåìi gian táøy âäüc täúi thiãøu 1 giåì. + Âãø thanh truìng vi khuáøn vaì náúm, phaíi duìng håi næåïc säi trong näöi kên âãø taûo aïp suáút tæì 1kg/cm2 tråí lãn, âãø âæa nhiãût âäü lãn âãún 121oC. Thåìi gian thanh truìng täúi thiãøu 20 phuït (näöi autoclave). + Âäúi våïi caïc hoïa cháút bë phán huíy åí nhiãût âäü trãn 100oC ta thanh truìng åí nhiãût âäü 100oC trong 1 giåì, sau âoï âãø åí nhiãût âäü thæåìng (20 - 30oC) trong 1 ngaìy. Häm sau laûi thanh truìng åí nhiãût âäü 100oC trong 1 giåì räöi âãø åí nhiãût âäü thæåìng. Láûp laûi 3 láön (phæång phaïp naìy coìn goüi laì Tyndallization). Lyï do : 19
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 . ÅÍ 100oC giãút táút caí caïc vi sinh váût åí daûng âang hoaût âäüng træì caïc daûng læu täön nhæ näüi baìo tæí, bç baìo tæí, ... Caïc daûng læu täön seî chuyãøn sang daûng hoaût âäüng khi tråí laûi nhiãût âäü bçnh thæåìng. . Sau âoï chuïng ta giãút chuïng åí nhiãût âäü 100oC trong 1 giåì våïi láön thanh truìng thæï hai. . Láön thanh truìng thæï ba våïi muûc âêch âaím baío diãût táút caí vi sinh váût coìn soït laûi sau hai âåüt thanh truìng træåïc. + Læu yï: Khi sæí duûng näöi thanh truìng bàòng håi næåïc cáön kiãøm tra laûi xem âoï laì näöi autoclave hay näöi thanh truìng Tyndall (Tyndallization). b/ Phæång phaïp duìng hoïa cháút : Coï ráút nhiãöu hoïa cháút coï khaí nàng diãût táút caí vi sinh váût nãn âæåüc duìng âãø thanh truìng nhæ : - Caïc halogens : + CaCl2 : duìng åí näöng âäü tæì 0,5 -5%. Cháút taïc âäüng thanh truìng laì chlor. Thæåìng duìng khæí âäüc næåïc duìng trong thaình phäú. + Iodine : laì mäüt cháút thanh truìng täút nhæng êt duìng hån vç âàõt vaì vç noï coï maìu. Ngaìy xæa, ngaình y tãú thæåìng duìng cäön iod 2% thanh truìng vãút thæång. - Caïc kim loaûi nàûng : + Chlorua thuíy ngán (Bichloride of mercury) HgCl2 : duìng åí daûng o dung dëch 1 /oo hoàûc 1/5000. Duìng khæí âäüc ngoaìi màût máùu váût khi nuäi cáúy. + Sulfat baûc : thuäúc nhoí màõt daình cho treí så sinh (1%). + Sulfat âäöng : duìng âãø diãût rong xanh (laìm xanh næåïc) trong häö næåïc vaì laì thuäúc diãût náúm trong näng nghiãûp. Læu yï laì caïc kim loaûi nàûng laì nhæîng cháút læu tänö ráút bãön ngoaìi thiãn nhiãn, trong dáy chuyãön thæûc pháøm. Noï laì mäüt trong caïc cháút gáy ä nhiãùm cho mäi træåìng säúng. Cáön hãút sæïc tháûn troüng trong khi sæí duûng. Khäng âæåüc âäø caïc cháút náöy qua âæåìng cäúng thoaït næåïc maì khäng coï hãû thäúng xæí lyï chäúng ä nhiãùm. 20
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 - Caïc cháút khaïc : + Phenol : laì cháút chäúng vi sinh váût ráút täút, âæåüc duìng trong y khoa, nhæ táøy ræía phoìng mäø. Vaìo thåìi sau Pasteur, caïc baïc sé phaíi ræía tay bàòng acid phãnic loaîng træåïc khi vaìo phoìng mäø. + Cäön : cäön ethyl vaì cäön isopropyl âæåüc duìng âãø thanh truìng: ræía tay, thanh truìng vãút thæång khi chêch. Cäön ethyl duìng thanh truìng täút nháút åí 70%. Duìng näöng âäü cao hån 95% hoàûc 100%, hiãûu quaí keïm hån. + Xaì bäng : xaì bäng cuîng coï taïc duûng thanh truìng tay. Duìng ræía tay, duûng cuû. + Cháút táøy: bäüt giàût täøng håüp coï tênh thanh truìng täút, nhæït laì våïi viruït. + Formol : coï tênh thanh truìng maûnh, giãút âæåüc baìo tæí vi khuáøn. Formol bäúc håi nhanh, håi formol coï thãø thanh truìng nhaì cæía, phoìng äúc hoàûc duûng cuû. Âiãöu kiãûn täút nháút âãø håi formol phaït huy taïc duûng thanh truìng laì áøm âäü 70% vaì nhiãût âäü khoaíng 22oC. Formol hoìa næåïc cuîng coï khaí nàng thanh truìng maûnh. c/ Phæång phaïp duìng tia saïng : - Tia cæûc têm (ultraviolet light) : tia cæûc têm coï tênh thanh truìng maûnh, diãût âæåüc caí baìo tæí vi khuáøn. Tia cæûc têm coï âäü daìi soïng raíi ra tæì 13,6mµ - 400mµ. Chè coï caïc tia 230 - 280mµ, âàûc biãût laì 253,7mµ µ , laì coï taïc duûng thanh truìng maûnh nháút. Duìng thanh truìng phoìng äúc, duûng cuû. Cáön baío vãû màõt. -3 -6 Ghi chuï: 1mµ (mili-micromeït)= 1nm (nanomeït)= 10 µm (micromeït)= 10 mm -6 -9 1mµ = 1 x 10 mm = 1 x 10 m. - Tia ám cæûc (cathode ray) : tæïc tia âiãûn tæí coï khaí nàng thanh truìng vaì xuyãn qua kim loaûi moíng. Duìng thanh truìng duûng cuû y khoa âaî âoïng goïi, thët, rau caíi vaì thæûc pháøm khaïc âaî âoïng goïi. d/ Phæång phaïp loüc : Ruäüt bàòng sæï xäúp cuía bçnh loüc næåïc, caïc loaûi giáúy loüc âàûc biãût nhåì coï caïc läù hoíng nhoí nãn coï thãø âãø cho caïc cháút loíng âi qua nhæng ngàn caín vi khuáøn, náúm laûi, nãn coï thãø duìng âãø thanh truìng hoàûc táøy âäüc. 21
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 Maìng loüc cæûc min (ultra-filter) âæåüc laìm bàòng collodion cellulose acetate hoàûc nhæîng cháút tæång tæû coï läù ráút nhoí nãn âæåüc duìng cho ráút nhiãöu muûc âêch. Kêch thæåïc läù loüc coï thãø tæì 0,005 - 1µm. Nhåì âoï coï thãø duìng maìng loüc thêch nghi âãø loaûi táút caí vi sinh váût, kãø caí viruït nhoí nháút ra khoíi dung dëch muäún thanh truìng. III. LY TÁM : Ly tám âæåüc sæí duûng nhiãöu trong nghiãn cæïu vãö vi sinh hoüc. Nguyãn tàõc cuía phæång phaïp ly tám laì khi mäüt váût bë taïc duûng båíi ly tám seî bë läi keïo båíi mäüt læûc vaì di chuyãøn theo chiãöu hæåïng ly tám. Khäúi læåüng cuía váût bë taïc duûng caìng låïn, læûc ly tám caìng låïn. Trong mäüt dung dëch coï chæïa vi sinh váût, nãúu chëu taïc duûng cuía ly tám, caïc vi sinh váût coï kêch thæåïc to seî chëu taïc duûng cuía læûc ly tám låïn coï khuynh hæåïng di chuyãøn vãö phêa âaïy äúng nãúu læûc ly tám thàõng âæåüc âäü nhåït cuía cháút loíng. ÅÍ mäüt täúc âäü quay nháút âënh, caïc váût to seî bë làõng vaìo âaïy äúng. Coìn caïc váût nhoí seî coìn lå læíng trong dung dëch. AÏp duûng nguyãn tàõc naìy trong viãûc : a/ Táøy âäüc dëch chæïa vi khuáøn, làõng vi khuáøn xuäúng âaïy äúng, dëch bãn trãn khäng chæïa vi khuáøn. ÅÍ täúc âäü 6000 voìng/phuït trong 20 phuït ta coï thãø làõng táút caí vi khuáøn trong næåïc xuäúng âaïy äúng. Caïc vi sinh váût nhoí hån, nhæ viruït thç haîy coìn lå læíng trong næåïc. Nhæ váûy, chuïng ta coï thãø taïch vi khuáøn ra khoíi dëch chæïa viruït våïi phæång phaïp ly tám. b/ Thu tháûp hay cä âoüng vi sinh váût trong mäüt huyãön phuì våïi máût säú cao hån: ly tám våïi täúc âäü quay vaì thåìi gian thêch håüp âãø vi sinh váût áúy làõng xuäúng âaïy äúng. Sau khi chàõt boí låïp dëch bãn trãn, ta cho mäüt êt cháút loíng måïi, coï thãø laì dung dëch âãûm (buffer), räöi khuáúy vi sinh váût áúy lãn cho hoìa laûi trong dung dëch âãûm naìy. c/ Tinh roìng vi sinh váût: trong mäüt dëch chæïa nhiãöu loaûi vi sinh váût vaì caïc thaình pháön nhoí cuía vi sinh váût, chuïng ta coï thãø aïp duûng phæång phaïp ly tám âãø phán taïch caïc vi sinh váût vaì caïc váût thãø coï kêch cåí khaïc nhau chæïa trong dëch naìy ra tæìng låïp riãng biãût. Træåïc hãút phaíi ly tám åí váûn täúc quay vaì thåìi gian thêch håüp âãø coï thãø làõng vi sinh váût muäún tinh roìng xuäúng âaïy äúng âãø cä âoüng laûi, âäöng thåìi loaûi båït caïc thaình pháön nhoí hån. Trong dëch måïi chuïng ta coï vi sinh váût muäún tinh roìng láùn våïi 22
Vi sinh hoüc âaûi cæång Chæång 2 vi sinh váût khaïc cuìng kêch thæåïc hoàûc to hån, âäöng thåìi coï láùn caïc taûp cháút coï cuìng kêch thæåïc hoàûc to hån. Sau âoï âem nhoí dëch naìy lãn trãn màût dung dëch âæåìng coï âäü nhåìn tàng dáön tæì trãn xuäúng âaïy cuía caïc äúng ly tám. Sau âoï âem ly tám åí täúc âäü vaì thåìi gian cáön thiãút (sugar gradient centrifugation). Vç âäü nhåìn cuía dung dëch âæåìng låïn vaì âæåüc sàõp xãúp âãø coï näöng âäü tàng dáön tæì trãn xuäúng dæåïi âaïy äúng, nãn sau cuìng caïc váût cháút seî âæåüc sàõp xãúp laûi thaình tæìng låïp trong äúng ly tám, mäùi låïp chæïa mäüt säú váût cháút coï kêch thæåïc bàòng nhau. Vi sinh váût muäún tinh roìng cuîng âæåüc táûp trung mäüt låïp riãng biãût, chuïng ta coï thãø thu tháûp båíi mäüt maïy nhoí gioüt tæì âaïy äúng ly tám.. Taìi liãûu âoüc thãm: 1. Madigan, M. T. , J. M. Martinko & J. Parker, 1997. Brock Biology of Microorganisms. Prentice Hall International, Inc. Trang 397-429. 2. Frobisher, M.,1968. Fundamental of Microbiology. W. B. Saunder Co.. Trang 14-31. 23