Xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790m trên gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ kháng với thuốc điều trị đích

Chia sẻ: Thi Thi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

62
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Các bệnh nhân này đã được xác định trước đó là có đột biến đáp ứng với thuốc TKI (xoá đoạn exon 19 hoặc L858R) trên gen EGFR. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790M exon 20 trên gen EGFR ở 11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ đã được xác định là có dấu hiệu kém đáp ứng với thuốc ức chế EGFR TKI

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790m trên gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ kháng với thuốc điều trị đích

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC THỨ PHÁT T790M TRÊN GEN EGFR Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ KHÁNG VỚI THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÍCH Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Trần Quốc Đạt Trường Đại học Y Hà Nội Khoảng 50% bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có xuất hiện đột biến kháng thuốc thứ phát T790M sau khoảng 10 - 20 tháng điều trị với thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase (TKI, tyrosine kinase inhibitor) của EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Các bệnh nhân này đã được xác định trước đó là có đột biến đáp ứng với thuốc TKI (xoá đoạn exon 19 hoặc L858R) trên gen EGFR. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790M exon 20 trên gen EGFR ở 11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ đã được xác định là có dấu hiệu kém đáp ứng với thuốc ức chế EGFR TKI. DNA đã được tách chiết từ mẫu mô sinh thiết lại để xác định đột biến T790M exon 20 trên gen EGFR, kỹ thuật giải trình tự gen truyền thống và kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions - Amplification Refractory Mutation System) với độ nhạy cao khoảng 0,01% đã được áp dụng để xác định đột biến.Kết quả cho thấy đã phát hiện được 5/11 (45%) bệnh nhân có đột biến kháng thuốc T790M exon 20 trên gen EGFR, trong đó 2 trường hợp có thể xác định được đột biến bằng cả 2 kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpions ARMS và 3 trường hợp chỉ phát hiện được bằng kỹ thuật Scorpions ARMS. Đây mới chỉ là nghiên cứu bước đầu, chúng tôi cần có một nghiên cứu với cỡ mẫu nghiên cứu lớn hơn để đưa ra một kết quả toàn diện hơn. Từ khóa: Ung thư phổi không tế bào nhỏ, Kháng TKI, Đột biến T790M I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, trên toàn thế giới và tại Việt biến gen EGFR làm tăng tính nhạy cảm với Nam, ung thư phổi là loại ung thư phổ biến EGFR TKI có tỷ lệ đáp ứng với thuốc EGFR TKI rất cao, trên 60%, và kéo dài được thời nhất và có tỷ lệ tử vong cao nhất [1], với 80 90% là thể không tế bào nhỏ, còn lại là thể tế gian sống bệnh không tiến triển (PFS) trung bình trên 9 tháng [4]. Tuy nhiên, dưới áp lực bào nhỏ.Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô EGFR (epidermal growth factor receptor) đã chọn lọc của các tế bào khối u với thuốc, sau khoảng 10 - 20 tháng điều trị, bệnh tiến triển trở thành đích nhắm cho liệu pháp điều trị mới đối với nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào trở lại ở hầu hết các bệnh nhân có đáp ứng tốt nhỏ [2]. Ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột ban đầu, thể hiện tình trạng “trơ” của tế bào khối u với thuốc [5]. Y học đã ghi nhận một số biến gen EGFR đáp ứng tốt với thuốc ức chế tyrosine kinase của EGFR (EGFR TKI), là cơ cơ chế gây nên tình trạng kháng thuốc EGFR TKI; trong đó có sự xuất hiện một số đột biến sở cho liệu pháp điều trị trúng đích [3]. Nhiều nghiên cứu cho thấy bệnh nhân ung thư phổi mới tại chính phân tử EGFR (đột biến T790M tại exon 20, đột biến L747S hoặc D761Y tại không tế bào nhỏ giai đoạn muộn mang đột exon 19, đột biến T854A tại exon 21…), sự Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội Email: huytihinhda@yahoo.com Ngày nhận: 10/10/2015 Ngày được chấp thuận: 26/02/2016 40 khuếch đại gen cMET (gen mã hóa thụ thế yếu tố phát triển tế bào gan), sự chuyển dạng biểu mô - trung mô hoặc sự chuyển từ dạng không tế bào nhỏ sang dạng tế bào nhỏ. Đột biến thứ phát T790M trên exon 20 gen EGFR TCNCYH 99 (1) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC là nguyên nhân phổ biến nhất, chiếm khoảng theo tiêu chuẩn RECIST v1.1 và được đánh 50% các trường hợp [6; 7]. Chẩn đoán phân tử thông qua tái sinh thiết khối u để xác định giá tình trạng kháng thứ phát thuốc EGFR TKI theo tiêu chuẩn của Jackman và cộng sự [9] cơ chế kháng thuốc từ đó lựa chọn hướng điều trị mới cho bệnh nhân đóng vai trò quan Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội trọng. Có nhiều kỹ thuật phát hiện đột biến kháng thuốc T790M exon 20 trên gen EGFR và độ nhạy của mỗi kỹ thuật phụ thuộc vào mật độ tế bào ung thư trong mẫu mô. Hai kỹ thuật đang được sử dụng phổ biến là giải trình tự gen và Scorpion ARMS. Kỹ thuật giải trình tự gen có giá thành cạnh tranh hơn nhưng không phát hiện được đột biến gen nếu mẫu mô có ít tế bào đột biến. Kỹ thuật Scorpions ARMS có độ nhạy cao hơn có thể phát hiện đột biến gen EGFR khi alen đột biến chiếm tỷ lệ nhỏ, nhưng giá thành rất cao [8]. Đề tài được thực hiện với mục tiêu: Xác định đột biến T790M trên gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ bằng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpions ARMS. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng Mẫu mô sinh thiết lại hoặc khối tế bào của 11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ được thu thập tại Bệnh viện K Trung ương, Bệnh viện Hữu Nghị và Bệnh viện Bạch Mai. Các bệnh nhân này được chẩn đoán xác định ung thư phổi biểu mô tuyến giai đoạn từ IIIB IV dựa vào đặc điểm lâm sàng và kết quả mô bệnh học. Bệnh nhân đã được xét nghiệm gen EGFR ở mẫu mô sinh thiết lần 1 trước khi điều trị đích và đã được xác định có đột biến đáp ứng với với thuốc ức chế EGFRTKI (6 bệnh nhân có đột biến mất đoạn điển hình LREA tại exon 19 và 5 bệnh nhân có đột biến L858R tại exon 21), ngoài ra không phát hiện thêm bất cứ đột biến nào khác trên gen EGFR. Bệnh nhân được sử dụng thuốc ức chế EGFRTKI, được theo dõi đáp ứng thuốc TCNCYH 99 (1) - 2016 2. Phương pháp - Kỹ thuật tách chiết DNA: mẫu mô được lựa chọn chính xác vùng tế bào ung thư. Parafin được loại bỏ bằng xylen. DNA được tách chiết theo qui trình phenol/chloroform (protein được phân huỷ bằng Proteinase K với nồng độ 1 mg/mL). Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được xác định bằng máy Nano Drop, những mẫu DNA đạt giá trị OD 280/ OD260 ≥ 1,8 được sử dụng để phân tích. - Kỹ thuật giải trình tự gen: sau khi khuyếch đại exon 19, và exon 21 của gen EGFR bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel agarose, sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA) và sau đó được đưa vào giải trình tự bằng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA). Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự Genebank của gen EGFR. - Kỹ thuật Scorpions ARMS: là sự kết hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpions trong phản ứng real - time PCR để phát hiện các đột biến gen EGFR và đột biến kháng thuốc T790M ở exon 21. Quy trình kỹ thuật theo Kit của hãng QIAGEN [10]. 3. Đạo đức trong nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức nghiên cứu trong Y học. Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật. 41 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III. KẾT QUẢ biến kháng thuốc T790M exon 20, trong đó 2 Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS để phát hiện đột biến gen EGFR trường hợp xác định được đột biến bằng cả 2 kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpions ARMS cho đối tượng nghiên cứu. Kết quả cho thấy đã phát hiện được 5/11 (45%) bệnh nhân có đột và 3 trường hợp chỉ phát hiện được đột biến bằng kỹ thuật Scorpions ARMS (bảng 1). Bảng 1. Kết quả phát hiện đột biến gen EGFR trước và sau điều trị EGFR TKI Đột biến gen sau điều trị EGFR TKI Chẩn đoán Đột biến gen trước điều lâm sàng trị EGFR TKI Giải trình tự gen Scorpions ARMS 1 K phổi LREA LREA LREA, T790M 2 K phổi LREA LREA LREA 3 K phế quản L858R L858R L858R 4 K phổi LREA LREA LREA, T790M 5 K phổi L858R L858R, T790M L858R, T790M 6 K phế quản LREA LREA LREA 7 K phế quản L858R L858R L858R, T790M 8 K phổi L858R L858R L858R 9 K phổi LREA LREA, T790M LREA, T790M 10 K phế quản LREA LREA LREA 11 K phổi L858R L858R L858R MS Tại thời điểm trước điều trị EGFR TKI, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS, bệnh nhân có đột biến L858R exon 21, không có đột biến gen EGFR nào khác, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân chỉ có đột biến L858Rexon 21 làm tăng tính nhạy cảm với thuốc EGFR TKI. Tại thời điểm bệnh tiến triển, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS, ngoài đột biến L858R exon 21 đã phát hiện trước khi điều trị, xuất hiện thêm đột biến T790M exon 20, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân đã xuất hiện thêm đột biến thứ phát T790M gây kháng thuốc EGFR TKI (hình 1). 42 TCNCYH 99 (1) - 2016 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết quả giải trình tự gen Kết quả Scorpion ARMS Hình 1. Kết quả xác định đột biến gen EGFR của bệnh nhân MS5 trước điều trị (A) và sau khi điều trị (B) Tại thời điểm trước điều trị EGFR TKI, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn LREA exon 19, không có đột biến gen EGFR nào khác, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân chỉ có đột biến LREA exon 19 làm tăng tính nhạy cảm với thuốc EGFR TKI. Tại thời điểm bệnh tiến triển, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen thấy có tín hiệu nghi ngờ của đột biến T790M exon 20. Khi kiểm tra lại bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, ngoài đột biến LREA exon 19 đã phát hiện trước khi điều trị, xuất hiện thêm đột biến T790M exon 20, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân đã xuất hiện thêm đột biến thứ phát T790M exon 20 gây kháng thuốc EGFR TKI (hình 2). TCNCYH 99 (1) - 2016 43 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết quả giải trình tự gen Kết quả Scorpion ARMS Hình 2. Kết quả xác định đột biến gen EGFR của bệnh nhân MS9 trước điều trị (A) và sau khi điều trị (B) IV. BÀN LUẬN Cơ chế kháng thuốc điều trị đích đầu tiên ở tốt với thuốc điều trị đích [10; 11]. Sự biến đổi bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ cấu trúc tại vùng giữ chức năng tyrosine được chứng minh là sự xuất hiện đột biến điểm T790M tại exon 20 gen EGFR. Phát hiện kinase (exon 18 21) của protein EGFR gây này được công bố bởi hai nhóm nghiên cứu độc lập của Kobayashi và Pao năm 2005 sau gắn ATP. Do đó, phân tử thuốc EGFR TKI khi tiến hành phân tích những bệnh nhân mang đột biến LREA, L858R xuất hiện tính kháng sau khoảng thời gian ban đầu đáp ứng 44 giảm ái lực của protein EGFR với ATP tại khe không phải cạnh tranh với ATP và EGFR trở nên nhạy cảm hơn với thuốc [12]. Theo thời gian tiếp xúc liên tục với thuốc điều trị đích EGFR TKI, gen EGFR của tế bào ung thư đã TCNCYH 99 (1) - 2016