Xác định độc lực của rắn lục đuôi đỏ và tác động gây loét trên chuột

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC CỦA RẮN LỤC ĐUÔI ĐỎ<br /> VÀ TÁC ĐỘNG GÂY LOÉT TRÊN CHUỘT<br /> Nguyễn Tấn Hiệp*, Nguyễn Thúy Hương**, Nguyễn Thị Nguyệt Thu***, Nguyễn Lê Trang<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Lở loét và hoại tử mô tại chỗ còn là một vấn đề mà kháng huyết thanh không đem lại hiệu lực<br /> tác dụng nào, đặc biệt với nhiễm độc nọc rắn lục đuôi đỏ. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu nào ở Việt Nam báo<br /> cáo về tác động gây loét khi bị rắn lục cắn.<br /> Mục tiêu: Xác định thành phần gây độc chính trong nọc rắn lục đuôi đỏ (Trimeresurus albolabris) và các<br /> yếu tố ảnh hưởng. Độc lực, liều gây tổn thương được tiến hành khảo sát trên chuột và hiệu lực trung hòa hoạt<br /> tính enzyme trong nọc toàn phần của kháng huyết thanh kháng nọc.<br /> Phương pháp nghiên cứu: Thí nghiệm trên chuột thông qua đường tiêm i.v, s.c. và giải phẫu vùng da bị<br /> xuất huyết.<br /> Kết quả: Nọc rắn lục gây xuất huyết tại chỗ được chứng minh rõ ràng, độ trầm trọng lệ thuộc vào liều nọc.<br /> Độc lực của nọc rắn lục được xác định qua đường tiêm tĩnh mạch đuôi chuột (20g ±2, N=5): LD50 = 9,27 µg<br /> nọc/chuột (0,464 µg/g). Liều nọc tối thiểu gây xuất huyết đường kính 10mm vùng dưới da chuột MHD = 2 µg/<br /> chuột. Hiệu lực trung hòa 3 liều nọc MHD của kháng huyết thanh là 1,175 µg (protein kháng huyết thanh).<br /> Enzyme serine protease trong nọc rắn lục đã được tinh chế qua cột Benzamidine Sepharose 6B và chiếm tỉ lệ<br /> 8,72% (g protein/100g nọc khô).<br /> Kết luận: Sự hiện diện với tỷ lệ đáng kể của serine proteinase trong nọc là nguy cơ tiềm năng hoạt hóa<br /> nhiều hệ thống tiền enzyme trong cơ thể của nạn nhân: hệ thống bổ thể, hệ thống cầm máu, gây hoại tử và biến<br /> chứng. Nghiên cứu bước đầu cho thấy tác động gây xuất huyết của serine protease và khả năng trung hòa hoạt<br /> tính enzyme trong nọc của kháng huyết thanh.<br /> Từ khóa: Trimeresurus albolabris, nọc rắn lục, gây loét.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> TRIMERESURUS ALBOLABRIS VENOM’ TOXIN STRENGTH AND NECROTIZING ACTIVITY WAS<br /> DETERMINED IN MICE<br /> Nguyen Tan Hiep, Nguyen Thuy Huong, Nguyen Thi Nguyet Thu, Nguyen Le Trang<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - No 2 - 2014: 43 - 49<br /> Background: Local tissue necrosis is an important problem when patients was bite by Trimeresurus<br /> albolabris because treating with antiserum is not effected. There hasn’t been any study of necrotizing activity with<br /> T. albolabris bite in Vietnam.<br /> Objective: Identification of serine protease activities in Trimeresurus albolabris venom and its affecting.<br /> Venom’ toxin strength, minimum hemorrhagic dose were test of mice injected and neutralization of enzyme<br /> activities of Trimeresurus albolabris venom by antivenom.<br /> Method: Testing on mice via i.v, s.c. injection and haemorrhagic spot in mice local tissue necrosis.<br /> Results: The venom obviously causes local haemorrhage. The LD50 of the venom was determined by i.v.<br /> injections of different doses into the caudal vein of mice (20±2, N=5): LD50 = 9.27 µg (0,464 µg/g). MHD is 2.0<br /> µg/20g. Neutralization of 3MHD (6.0 µg) needed 1,175 µg antivenom protein. The yield of Serine protease<br /> occupied 8.72% of dry venom protein.<br /> *Bệnh Viện Đại Học Y Dược CS1<br /> Tác giả liên lạc: Nguyễn Tấn Hiệp<br /> <br /> ** Đại Học Bách Khoa Tp. HCM<br /> ***Viện Pasteur Tp.HCM<br /> ĐT: 0909338254<br /> Email: hiep.nt@umc.edu.vn<br /> <br /> 43<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014<br /> <br /> Conclusion: The venom serine protease potentially activates hemostatic zymogen systems and causes local<br /> necrosis. Preliminary results showed that haemorrhagic activity of serine protease and neutralization of enzyme<br /> activities of Trimeresurus albolabris venom by antivenom.<br /> Key words: Trimeresurus albolabris, snake venom, snakebite ulcers.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Việt Nam thuộc vùng có địa hình và khí<br /> <br /> của các yếu tố cầm máu (đa số đều là tiền serine<br /> proteinase) với sự hoạt hóa của hệ kinin-<br /> <br /> hậu nhiệt đới thuận lợi cho sự sinh sống, phát<br /> <br /> kallikrein(5).<br /> <br /> triển của các loài rắn nói chung và rắn độc nói<br /> <br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> <br /> riêng. Rắn độc ở Việt Nam có thể chia làm hai<br /> <br /> Mục tiêu tổng quát<br /> <br /> loại: các loài rắn thuộc họ nhỡn kính (elapidae)<br /> <br /> Khảo sát Proteinase của nọc rắn lục đuôi đỏ<br /> <br /> có nọc gây độc thần kinh (neurotoxic) và các<br /> <br /> và tác động gây loét trên chuột.<br /> <br /> loài rắn thuộc họ rắn lục (viperidae) có nọc gây<br /> <br /> Mục tiêu chuyên biệt<br /> <br /> độc hệ huyết mạch (hemotoxic). Huyết thanh<br /> kháng nọc rắn lục (Trimeresurus albolabris) và<br /> kháng một số nọc rắn nhỡn kính đã được sản<br /> xuất và thử nghiệm thành công trên bệnh nhân<br /> nhiễm độc nọc rắn(7,10).<br /> Huyết thanh kháng nọc rắn đã chứng tỏ có<br /> hiệu quả để điều trị nhiễm độc nọc rắn(1,3). Tuy<br /> nhiên, bệnh nhân thường chỉ được điều trị sau<br /> một thời gian trì hoãn (để đến trung tâm y tế).<br /> Thời gian trì hoãn là một nguyên nhân làm<br /> tăng nguy cơ gây tử vong và cũng làm tăng<br /> <br /> 1. Xác định độc lực qua liều gây tử vong<br /> 50% số chuột thí nghiệm (LD50) của nọc rắn lục<br /> đuôi đỏ.<br /> 2. Xác định thành phần gây độc chính ở rắn<br /> lục đuôi đỏ và các yếu tố ảnh hưởng.<br /> 3. Xác định liều gây tổn thương đường kính<br /> 10mm vùng dưới da chuột (MHD).<br /> 4. Xác định hiệu lực trung hòa hoạt tính<br /> enzyme trong nọc toàn phần của kháng huyết<br /> thanh kháng nọc.<br /> <br /> nguy cơ tạo các biến chứng sinh lý bệnh gây<br /> <br /> PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH<br /> <br /> tàn phế, đặc biệt làm tăng độ trầm trọng về<br /> <br /> Vật liệu<br /> <br /> gây hoại tử tại chỗ(2).<br /> Nguyên nhân lở loét được quy cho các<br /> proteins gây độc trong nọc lưu tụ tại chỗ cắn, các<br /> protein đó chủ yếu là các Serine proteases, hoạt<br /> động với cơ chế xúc tác. Khi nhiễm độc nọc rắn<br /> lục, các proteins này sẽ phân hủy các thành phần<br /> <br /> Nọc rắn lục khô do Trung tâm Nuôi trồng<br /> Nghiên cứu Chế biến Dược liệu quân khu 9,<br /> Tiền Giang cung cấp.<br /> Chuột nhắt trắng 18-20g được cung cấp từ<br /> Viện Pasteur Tp.HCM.<br /> Kháng huyết thanh kháng nọc do Viện Vắc<br /> <br /> của mô, phá vỡ mô, gây tổn thương cho vành<br /> <br /> xin Nha Trang cung cấp.<br /> <br /> mạch, làm tăng tuần hoàn máu tập trung vào vết<br /> <br /> Các bước tiến hành<br /> <br /> thương và là nguyên nhân gây sưng phù, xuất<br /> huyết tại chỗ(2). Rắn lục là loài có nanh nọc độc<br /> phát triển nhất trong các loài rắn. Chấn thương<br /> và sự nhiễm khuẩn do nanh nọc độc gây nên<br /> không thể không tạo ra những đáp ứng tự bảo vệ<br /> của cơ thể nạn nhân, trong đó có sự khởi động<br /> <br /> 44<br /> <br /> Xác định liều gây tử vong 50% số chuột thí<br /> nghiệm (LD50) của nọc rắn lục<br /> Nguyên tắc<br /> Thử nghiệm độc tính cấp này dựa trên phản<br /> ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết).<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> duy nhất thuốc thử nghiệm vào con vật với điều<br /> <br /> Tinh chế serine protease trong nọc rắn lục qua<br /> cột Bezamidine Sepharose 6B<br /> <br /> kiện ấn định, ghi phân suất tử vong trong một<br /> <br /> Nguyên tắc<br /> <br /> Nguyên tắc của thử nghiệm là tiêm một liều<br /> <br /> thời gian quy định. Độc lực thường được biểu<br /> <br /> Benzamidine<br /> <br /> SepharoseTM<br /> <br /> là<br /> <br /> p-<br /> <br /> thị bằng giá trị LD50 (lethal dose 50%) – liều tối<br /> <br /> aminobenzamidine cộng hóa trị với Sepharose<br /> <br /> thiểu gây chết 50% số động vật thí nghiệm. Chất<br /> <br /> 6B bằng phương pháp cộng hợp thông qua<br /> <br /> có độc tính càng cao giá trị LD50 càng thấp.<br /> <br /> nhóm epoxy (một nguyên tử oxy liên kết với hai<br /> <br /> Động vật thí nghiệm trong công trình này là<br /> <br /> nguyên tử carbon): p- aminobenzamidine (PAB)<br /> <br /> chuột nhắt trắng hoàn toàn khỏe mạnh, cùng<br /> <br /> là chất ức chế tổng hợp của trypsin dạng serine<br /> <br /> giới tính, độ tuổi, cùng dòng, không mang mầm<br /> <br /> protease. Các Trypsin dạng serine protease này<br /> <br /> bệnh và không mang thai.<br /> <br /> liên kết đặc hiệu với Benzamidine Sepharose 6B<br /> <br /> Gây nhiễm<br /> <br /> được giữ lại trên cột. Sau đó, đẩy Serine Protease<br /> <br /> + Lô đối chứng: tiêm vào chuột 0.2 mL nước<br /> muối sinh lý 0,9%.<br /> + Lô thử: tiêm vào chuột các lượng nọc và<br /> độc tố khác nhau theo cấp số nhất định sao cho<br /> trong đó chứa phân suất gây chết 0% và 100%<br /> động vật thí nghiệm.<br /> - Đọc kết quả trong 48 giờ kế từ tiêm.<br /> - Kết quả được tính theo công thức Kaber-<br /> <br /> ra khỏi cột bằng dung dịch đệm có tính acid<br /> mạnh. Rửa cột và bảo quản ở 4OC. Xác định tỷ lệ<br /> protein thu hồi và đánh giá kết quả tinh chế<br /> bằng điện di trên thạch polyacrylamide 12% với<br /> Sodium dodecylsulfate (SDS-PAGE)(6), hoạt tính<br /> enzyme được xác định qua điện di SDS-PAGE<br /> 12%-gelatine 0,1%.<br /> Thực hiện<br /> Cho 11 mL nọc qua cột Bezamidine<br /> <br /> Behrens:<br /> <br /> Sepharose 6B 3 lần. Rửa cột bằng dung dịch đệm<br /> <br /> Σab<br /> LD50 = Df - n<br /> <br /> Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,5 M, pH=7,4 cho đến<br /> khi dịch rửa không còn protein (OD280=0). Đẩy<br /> thành phần bám trên cột dung dịch glycine<br /> 50mM, pH=3.0 (đến khi dịch ra có OD280=0),<br /> <br /> Với Df: liều tối thiểu làm chết tất cả thú vật trong lô; a: trị<br /> số trung bình của tổng số thú vật chết ở 2 lô kế tiếp; b: hiệu<br /> số 2 liều kế tiếp; n: số thú vật dùng ở mỗi liều.<br /> <br /> Độc lực của nọc được xác định bằng cách<br /> tiêm vào tĩnh mạch đuôi (I.V.) của chuột nhắt<br /> trắng 18-20 g.<br /> <br /> Xác định pH các dung dịch đệm ảnh hưởng đến<br /> hoạt tính enzyme<br /> <br /> trung hòa bằng Tris 1 M, pH=8. Thu enzyme cần<br /> tinh chế. Cân bằng cột với dung dịch Tris-HCl 10<br /> mM, NaCl 0,5 M, pH=7,5. Bảo quản cột ở 40C để<br /> sử dụng cho các lần tinh chế sau.<br /> Xác định liều tối thiểu gây xuất huyết đường<br /> kính 10mm vùng dưới da chuột (MHD)<br /> Nọc rắn được pha loãng hàng loạt theo bậc<br /> <br /> Tiến hành cho 0,2 mg nọc rắn được ủ với<br /> <br /> hai từ 4-0,5 µg. Tiêm 0,1 ml vào vùng dưới da<br /> <br /> casein 2% và các dung dịch đệm ở các pH khác<br /> <br /> mỗi chuột (Sc). Các chuột chứng được tiêm cùng<br /> <br /> nhau tại 37°C trong 10 phút. Thêm TCA<br /> <br /> lượng nước muối sinh lý. Sau 2 giờ, giải phẫu<br /> <br /> (trichloroacetic acid) 5% vào, ly tâm thu nước nổi<br /> <br /> chuột, xác định đường kính vùng xuất huyết.<br /> <br /> và xác định giá trị hấp phụ quang ở 280 nm.<br /> <br /> 45<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Xác định hiệu lực trung hòa hoạt tính enzyme<br /> <br /> Tinh chế enzyme serine protease trong nọc<br /> <br /> trong nọc toàn phần của kháng huyết thanh<br /> <br /> rắn lục qua cột Bezamidine-Sepharose 6B<br /> <br /> kháng nọc<br /> <br /> Dung dịch nọc rắn được nạp vào cột ở pH =<br /> <br /> Dung dịch kháng huyết thanh được pha<br /> <br /> 7.4 với đệm Tris HCl 20mM, NaCl 0,5M; các<br /> <br /> loãng hàng loạt theo bậc 2: 1/2-1/32. Ủ dung<br /> <br /> thành phần không bám đi ra khỏi cột và serine<br /> <br /> dịch kháng huyết thanh với nọc ở 3MHD tại<br /> <br /> protease được giữ lại trên cột. Đẩy serine<br /> <br /> 37°C trong 30 phút. Tiêm 0,1 ml vào vùng dưới<br /> <br /> protease ra khỏi cột bằng glycine 0,1M, pH 2,5.<br /> <br /> da mỗi chuột (S.C). Các chuột chứng được<br /> <br /> Xác định giá trị từng phân đoạn (1,5 mL) bằng<br /> <br /> tiêm 3MHD pha trong nước muối sinh lý. Sau<br /> <br /> hấp phụ quang ở 280 nm.<br /> <br /> 2 giờ, giải phẫu chuột, xác định đường kính<br /> Abs280<br /> <br /> vùng xuất huyết.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Độc lực của nọc rắn lục đuôi đỏ<br /> Kết quả cho thấy độc tính của nọc rắn lục<br /> <br /> 1.2<br /> 0.9<br /> 0.6<br /> 0.3<br /> 0<br /> 0<br /> <br /> 2<br /> <br /> 4<br /> <br /> 6<br /> Đoạn<br /> <br /> 8<br /> <br /> 10<br /> <br /> đuôi đỏ ở Việt Nam LD50 = 9,27µg/chuột<br /> Hình 2: Phân đoạn serine protease giải hấp từ cột<br /> <br /> (chuột 18-20g).<br /> Khảo sát pH các dung dịch đệm ảnh hưởng<br /> <br /> Đánh giá kết quả tinh chế bằng điện di trên<br /> <br /> đến hoạt tính enzyme<br /> <br /> thạch polyacrylamide SDS-PAGE 12% và hoạt<br /> <br /> Bảng 1: Các dung dịch đệm với pH khác nhau<br /> <br /> tính enzyme được xác định qua điện di SDS-<br /> <br /> Dung dịch đệm<br /> Phosphate 0,2 M<br /> Tris-HCl 0,2 M<br /> Glycine 0,2 M<br /> <br /> PAGE 12%-gelatine 0,1%.<br /> <br /> pH<br /> 5,5<br /> 7,5<br /> 8,5<br /> <br /> 6,5<br /> 8,0<br /> 9,5<br /> <br /> 7,5<br /> 8,5<br /> 10<br /> <br /> Phosphate<br /> Glycine<br /> <br /> 8,0<br /> 9,0<br /> 10,5<br /> <br /> Tris-HCl<br /> <br /> Abs (280nm)<br /> <br /> 0.1<br /> <br /> pH<br /> <br /> 0<br /> 4<br /> <br /> 6<br /> <br /> 8<br /> <br /> 10<br /> <br /> 12<br /> <br /> Hình 1: Các dung dịch đệm ảnh hưởng đến hoạt tính<br /> enzyme<br /> Trong các dung dịch đệm khác nhau,<br /> nhưng enzyme vẫn hoạt động tối ưu ở khoảng<br /> pH = 8-8,5.<br /> <br /> Hình 3: Kiểm tra các thành phần sau tinh chế SDSPAGE 12% Hàng 1, 2, 3: Serine protease sau tinh chế<br /> có xử lý DTT Hàng 4: Serine protease sau tinh chế<br /> không xử lý DTT. Hàng 6, 7, 8: Nọc rắn lục có xử lý<br /> DTT. Hàng 9, 10: Nọc rắn lục không xử lý DTT<br /> Mẫu enzyme do tinh chế cho một vạch<br /> ngang với vạch enzyme có trong nọc rắn lục,<br /> <br /> 46<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> sạch và nồng độ cao. Hoạt tính enzyme cũng cho<br /> <br /> protease sau tinh chế Hàng 4: Serine protease chuẩn<br /> Hàng 5, 6, 7: Nọc rắn lục<br /> <br /> kết quả tương tự.<br /> <br /> Xác định liều tối thiểu gây xuất huyết đường<br /> <br /> chứng tỏ enzyme thu được sau tinh chế là tinh<br /> <br /> kính 10mm vùng dưới da chuột (MHD)<br /> Liều tối thiểu gây xuất huyết đường kính<br /> 10mm vùng dưới da chuột là liều cho phép ta<br /> quan sát đường kính xuất huyết rõ nhất dưới da<br /> chuột, không có biểu hiện xuất huyết trên da.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định được<br /> MHD của nọc rắn lục là 2µg.<br /> Tại nồng độ huyết thanh pha loãng 1/8<br /> (0,5875 µg/µl) đã cho phép chứng minh khả<br /> năng trung hòa gần như hoàn toàn và tại nồng<br /> độ huyết thanh pha loãng 1/4 (1,175 µg/µl) cho<br /> thấy kháng huyết thanh hoàn toàn trung hòa<br /> Hình 4: Kiểm tra hoạt tính enzyme sau tinh chế<br /> SDS-PAGE 12%-gelatine 0,1% Hàng 1, 2: Serine<br /> 4 µg<br /> <br /> được nọc rắn lục toàn phần.<br /> <br /> Hàm lượng nọc / 0,1 ml / chuột<br /> 2 µg<br /> 1 µg<br /> <br /> 0,5 µg<br /> <br /> Mẫu chứng<br /> NaCl 0,9%<br /> <br /> Hình 5: Xác định MHD trên chuột<br /> Xác định hiệu lực trung hòa hoạt tính enzyme trong nọc toàn phần của kháng huyết thanh<br /> kháng nọc<br /> <br /> KHT 1/32<br /> <br /> KHT 1/16<br /> <br /> KHT 1/8<br /> <br /> KHT ¼<br /> <br /> KHT 1/2<br /> <br /> 3MHD<br /> <br /> Hình 6: Kháng huyết thanh trung hòa nọc rắn lục toàn phần<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Trên thế giới, các loài rắn thuộc họ rắn lục<br /> <br /> (µg/g) như sau: T. albolabris (0,60µg/g), T.<br /> purpureomaculatus<br /> <br /> (1,27µg/g),<br /> <br /> T.<br /> <br /> samatranus<br /> <br /> (viperidae) có nọc gây độc hệ huyết mạch<br /> <br /> (0,60µg/g), T. popeorium (1,45µg/g), T. flavoviridis<br /> <br /> (hemotoxic) thường có độc lực khá cao. Theo tác<br /> <br /> (2,5µg/g), T. muscrosquamatus (1,50µg/g), T.<br /> <br /> giả Nget Hong Tan và cộng sự(9) nghiên cứu về<br /> <br /> erythrurus (2,10µg/g), T. okinavensis (5,0µg/g), T.<br /> <br /> độc lực nhiều loài rắn Trimeresurus ở Đông Nam<br /> <br /> stejnegeri (1,78µg/g), T. elegans (5,00µg/g), T.<br /> <br /> Á, Trung Quốc, Ấn Độ đã xác định giá trị LD50<br /> <br /> macrops (10,00µg/g), T. wagleri (1,05µg/g). Trong<br /> <br /> 47<br /> <br />