Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
<br />
Số 2/2013<br />
<br />
THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC<br />
<br />
XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC VÀ QUÁ TRÌNH CẢM NHIỄM CỦA VI KHUẨN<br />
Streptococcus iniae VÀO CÁ CHẼM (Lates calcarifer)<br />
INVESTIGATION FOR THE VIRULENCE AND THE ROUTE OF INFECTION OF<br />
Streptococcus iniae IN BARRAMUNDI (Lates calcarifer)<br />
Trần Vĩ Hích1, Nguyễn Hữu Dũng2<br />
Ngày nhận bài: 24/10/2012; Ngày phản biện thông qua: 27/11/2012; Ngày duyệt đăng: 15/5/2013<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Việc ứng dụng kĩ thuật mô hóa miễn dịch đã làm sáng tỏ cách cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cơ<br />
thể cá chẽm khi ngâm cá vào môi trường có chứa 107 CFU/mL vi khuẩn (tương ứng với liều gây chết 50%). Kết quả thí<br />
nghiệm cho thấy sau 6 giờ thí nghiệm, vi khuẩn S. iniae đã được phát hiện ở mang cá. Sau 12 giờ thí nghiệm, vi khuẩn đã<br />
xâm nhập vào lách và thận. Sự xâm nhập của vi khuẩn vào mô ruột, mắt, não và gan chỉ xảy ra sau khi lách và thận cá đã<br />
bị vi khuẩn cảm nhiễm với số lượng lớn. Kết quả này chứng tỏ vi khuẩn S. iniae tồn tại trong môi trường xâm nhập vào cơ<br />
thể cá chẽm qua mang và gây cảm nhiễm hệ thống.<br />
Từ khóa: Barramundi, S.iniae, con đường cảm nhiễm<br />
<br />
ABTRACT<br />
The application of immunohistochemistry technique has allowed to investigate the mode of infection of Streptococcus<br />
niae in barramundi. A bacterial dose of 107CFU/mL corresponding to the LD50 delivered to barramundi through bath<br />
exposure in 1 hour. The results showed that S. iniae was detected first in gill of fish at 6 hours after challenge (HAC).<br />
12 HAC the bacteria was detected at spleen and kidney of fish. The infection of S. iniae in the tissue of the intestine, eye,<br />
brain and liver was only revealed after the spleen and kidney were infected seriously. It is suggested that S. iniae infections<br />
in barramundi are systemic infections. The bacteria entered through the gill to cause the disease.<br />
Key words: Barramundi, S. iniae, route of infection<br />
<br />
I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Thành công của những mô hình thử nghiệm<br />
nuôi cá chẽm ở các ao nuôi tôm hoang hóa đã<br />
khẳng định cá chẽm là đối tượng nuôi mang lại<br />
hiệu quả kinh tế cao. Đặc biệt, từ năm 2005, khi<br />
cá chẽm phi lê đã tìm được thị trường xuất khẩu,<br />
nghề nuôi cá chẽm đã phát triển nhanh chóng ở<br />
các tỉnh Khánh Hòa, Cà Mau, Bến tre... và đưa<br />
Việt Nam trở thành một nước xuất khẩu cá chẽm.<br />
Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của nghề nuôi<br />
cá chẽm, dịch bệnh cũng đã bắt đầu xuất hiện trên<br />
đối tượng này và gây ra những thiệt hại nghiêm<br />
trọng cho người nuôi, đặc biệt là dịch bệnh do<br />
<br />
1<br />
2<br />
<br />
S.iniae gây ra. S.iniae được tìm thấy lần đầu tiên<br />
ở cá heo nước ngọt (Inia geoffrensis) sau đó vi<br />
khuẩn này được tìm thấy ở nhiều loài cá nuôi khác<br />
như cá rô phi Oreochromis niloticus × O. aureus và<br />
Tilapia nilotica x T. aureahybrids, cá đù đỏ Sciaenops<br />
ocellatus, cá chẽm Lates calcarifer. Dấu hiệu của<br />
cá mắc bệnh do S.iniae gây ra khác nhau giữa các<br />
loài nhưng thường có một số biểu hiện như bơi<br />
mất định hướng, màu sắc cơ thể chuyển sậm, xuất<br />
huyết ở thân, gốc vây, lồi mắt.<br />
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định<br />
con đường cảm nhiễm của vi khuẩn S. iniae từ môi<br />
trường vào cá chẽm nuôi.<br />
<br />
ThS. Trần Vĩ Hích: Khoa Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang<br />
TS. Nguyễn Hữu Dũng: Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh thủy sản - Trường Đại học Nha Trang<br />
<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 3<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
1. Chuẩn bị vi khuẩn Streptococcus iniae<br />
Chủng vi khuẩn S.iniae VN091211R phân lập<br />
từ cá chẽm Lates calcarifer nuôi trong hệ thống<br />
mương nổi ở Khánh Hòa, được nuôi cấy tăng sinh<br />
trong môi trường TSB bổ sung 2% NaCl đặt trong tủ<br />
ấm lắc đảo (180rpm) ở nhiệt độ 280C trong 24 giờ.<br />
Tế bào vi khuẩn sau khi thu hoạch được rửa 3 lần<br />
bằng dụng dịch muối sinh lý đệm phosphate (PBS,<br />
pH 7.4) rồi pha loãng trở lại bằng PBS để đạt mật<br />
độ 109 CFU/ml. Mật độ vi khuẩn được xác định bằng<br />
phương pháp đo mật độ quang bằng máy đo quang<br />
phổ () và xác định lại bằng cách nuôi cấy trên đĩa<br />
thạch TSA có bổ sung 2% NaCl.<br />
2. Chuẩn bị cá chẽm thí nghiệm<br />
Cá chẽm (chiều dài thân 3,8 ± 0,2cm) dùng trong<br />
thí nghiệm này được sản xuất và ương nuôi thành cá<br />
giống tại Trung tâm Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh<br />
thủy sản - Trường Đại học Nha Trang. Khỏe mạnh,<br />
không có tiền sử bệnh tật và đã thích nghi với bể nuôi<br />
thí nghiệm từ giai đoạn cá hương cho đến khi bắt đầu<br />
sử dụng cho hoạt động nghiên cứu.<br />
3. Bố trí thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn<br />
Thí nghiệm được bố trí với 7 nghiệm thức, mỗi<br />
nghiệm thức gồm 40 cá chẽm đã được chuẩn bị ở<br />
mục 2 nuôi trong bể composite 1000L chứa 500L<br />
nước biển có độ mặn 30ppt. Tất cả cá thí nghiệm<br />
được ngâm vào các xô chứa 2L nước biển có chứa<br />
vi khuẩn S. iniae với mật độ tăng dần từ 103 CFU/mL<br />
cho nghiệm thức 1 đến 108 CFU/mL cho nghiệm thức<br />
6 trong 1 giờ trước khi đưa lại bể nuôi 500L. Ở nghiệm<br />
thức đối chứng, cá cũng được đưa vào xô chứa 2L<br />
nước biển trong 1 giờ trước khi đưa vào bể nuôi. Liều<br />
gây chết 50% được xác định vào thời điểm sau 7 ngày<br />
kể từ khi cá thí nghiệm dừng chết dựa vào phân tích<br />
probit của phần mềm SPSS STATISTICS ver.19.<br />
4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình xâm<br />
nhập của vi khuẩn vào cá chẽm<br />
Cho 1980ml nước biển (30 ppt) và cho thêm<br />
20ml dịch huyền phù vi khuẩn đã được chuẩn bị ở<br />
trên vào xô nhựa 5L, sục khí và đưa 30 cá chẽm<br />
đã chuẩn bị như ở trên vào xô, giữ trong 60 phút.<br />
Sau đó, đưa cá trở lại nuôi trong nước biển (30 ppt),<br />
nhiệt độ từ 28 ± 20C và cho ăn thức ăn dành cho<br />
cá chẽm của công ty UP theo nhu cầu của cá. Tiến<br />
hành thu mẫu ngẫu nhiên 3 cá vào các thời điểm 6h,<br />
12h, 24h, 48h và 72h sau khi cho cá vào bể nuôi, cố<br />
định các mẫu gan, thận, lách, não, mắt và ruột cá<br />
trong dung dịch Buffered Formallin 10% trong 24h<br />
để nghiên cứu mô học.<br />
<br />
4 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br />
<br />
Số 2/2013<br />
5. Kỹ thuật mô hóa miễn dịch<br />
Các cơ quan cá chẽm thu thập được xử lý theo<br />
phương pháp mô học truyền thống, gắn parafin<br />
và cắt thành những lát mỏng dày 3-6µm. Sau khi<br />
loại bỏ parafin và làm no nước, cho vào hỗn hợp<br />
H2O2 và methanol trong 10 phút nhằm bất hoạt men<br />
peroxidase nội bào. Khóa các vị trí gắn kết không đặc<br />
hiệu bằng cách cho mẫu cần nhuộm vào dung dịch<br />
skim milk 3% (w/v) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng<br />
(260C) trước khi cho 50 - 100µL kháng thể đơn dòng của<br />
chuột kháng S.iniae (mouse anti-Streptococcus iniae,<br />
MAbs, AQUATIC Diagnostics Ltd.) lên lát cắt và<br />
ủ trong buồng ẩm 60 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa<br />
lát cắt 3 lần trong TBS (Tris buffered saline) trước<br />
khi cho thêm kháng thể đa dòng của thỏ kháng<br />
immunoglobulin của chuột có gắn peroxidase<br />
(Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/<br />
HRP, Dako) đã pha loãng trong TSB (1:50) và ủ trong<br />
30 phút. Sau đó hoạt hóa peroxidase horseradish<br />
bằng dung dung dịch 3,3’-Diaminobenzidinetetrahydrochloride (DAB) trong 10 phút. Kết thúc phản ứng<br />
hoạt hóa bằng cách rửa lát cắt dưới vòi nước và<br />
nhuộm thêm haematocyline trong 4 phút. Sự có mặt<br />
của vi khuẩn S. iniae ở lát cắt mô làm mô cá có màu<br />
nâu trên nền màu hơi xanh. Cường độ nhiễm khuẩn<br />
ở các tổ chức được đánh giá theo 3 mức. +, ++ và<br />
+++ tương ứng với tỉ lệ vùng tổ chức nhiễm khuẩn<br />
và vùng tổ chức đó (vùng có màu nâu/vùng màu<br />
xanh) lần lượt là 10%. Các mẫu mô<br />
cá khỏe được sử dụng làm mẫu đối chứng.<br />
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN<br />
1. Xác định độc lực của chủng vi khuẩn<br />
VN091211R. bằng phương pháp ngâm<br />
Kết quả thu được từ thí nghiệm cho thấy đàn cá<br />
thí nghiệm xảy ra hiện tượng chết từ ngày thứ 2 sau<br />
khi cảm nhiễm. Số lượng cá chết tăng mạnh vào<br />
ngày thứ 3 và giảm nhiều vào ngày thứ 4, đến ngày<br />
thứ 6 thì dừng hẳn (hình 1).<br />
<br />
Hình 1. Tỉ lệ cá chẽm chết tích lũy sau khi ngâm vào môi<br />
trường có chứa vi khuẩn S.iniae với các nồng độ khác nhau<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
<br />
Số 2/2013<br />
<br />
Hầu hết cá hấp hối đều thể hiện dấu hiệu bơi lội bất thường như mất thăng bằng, nổi đầu hoặc bơi lờ đờ.<br />
Các dấu hiệu khác như màu sắc cơ thể chuyển đen sậm, xuất huyết ngoài da, sưng thận cũng được tìm thấy<br />
ở cá sau thí nghiệm. Tuy nhiên có nhiều cá chết sau thí nghiệm mà không thể hiện dấu hiệu bệnh lý. Kết quả<br />
phân lập vi khuẩn từ cá thí nghiệm cũng thu được vi khuẩn S.iniae thuần khiết ở não, gan và thận cá. Không có<br />
bất kỳ hiện tượng chết nào xảy ra ở cá đối chứng. Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% khi tắm cá trong 1 giờ được<br />
xác định là 106,8 CFU/mL (hình 2).<br />
<br />
Hình 2. Tương quan giữa nồng độ vi khuẩn S.iniae tiêm vào xoang bụng<br />
và tỉ lệ chết tích lũy của các nhóm cá chẽm thí nghiệm<br />
<br />
2. Con đường cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae ở cá chẽm<br />
Kết quả kiểm tra sự có mặt của vi khuẩn S.iniae ở các cơ quan của cá chẽm sau khi ngâm cá vào môi<br />
trường có chứa vi khuẩn S.iniae với mật độ 107CFU/mL trong 1 giờ cho thấy mang cá là nơi xuất hiện vi khuẩn<br />
lần đầu tiên (bảng 1). Sau 6 giờ thí nghiệm, có thể phát hiện sự tồn tại của vi khuẩn S.iniae ở tơ so cấp (hình<br />
3A). Trong trường hợp nhiễm nặng, vi khuẩn S.iniae còn được phát hiện ở tơ mang thứ cấp và ở độ phóng đại<br />
lớn có thể dễ dàng nhận thấy sự xâm nhập của vi khuẩn S.iniae vào xoang tĩnh mạch (hình 3B).<br />
Bảng 1. Thời điểm phát hiện vi khuẩn S.iniae ở các cơ quan của cá chẽm<br />
Giờ sau khi<br />
ngâm (h)<br />
<br />
Mang<br />
<br />
Gan<br />
<br />
Thận<br />
<br />
Lách<br />
<br />
Não<br />
<br />
Mắt<br />
<br />
Ruột<br />
<br />
6<br />
12<br />
24<br />
48<br />
72<br />
<br />
+<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
<br />
+<br />
+++<br />
+++<br />
<br />
++<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
<br />
++<br />
+++<br />
+++<br />
+++<br />
<br />
+<br />
++<br />
+++<br />
<br />
++<br />
+++<br />
+++<br />
<br />
++<br />
+++<br />
<br />
Hình 3. Mang cá chẽm nhuộm mô hóa miễn dịch với vi khuẩn ở mang sơ cấp, mang thứ cấp và xoang tĩnh mạch mang<br />
(SL: mang thứ cấp; PL: mang sơ cấp; VS: xoang tĩnh mạch; C: tế bào sụn)<br />
<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 5<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
<br />
Số 2/2013<br />
<br />
Thận và lách là 2 cơ quan nội quan đầu tiên mà vi khuẩn S.iniae đến cảm nhiễm. Tại thời điểm 12h sau khi<br />
cảm nhiễm, vi khuẩn S.iniae đã xuất hiện ở thận và lách với mật độ cao. Lúc đầu, vi khuẩn chỉ được phát hiện ở<br />
mô kẽ quanh ống thận (hình 4A) tại thời điểm này cấu trúc ống thận chưa có sự thay đổi. Nhưng ở những mẫu<br />
thận nhiễm vi khuẩn S.iniae với mật độ cao, vi khuẩn tấn công vào bên trong ống thận, phá hủy mô tạo máu,<br />
gây hoại tử và để lại những thương tổn nặng nề cho tổ chức thận (hình 4B).<br />
<br />
Hình 4. Thận cá chẽm nhiễm S.iniae nhuộm mô hóa miễn dịch<br />
<br />
Sự hiện diện của S.iniae ở gan, não và mắt cũng được nhận biết bằng phương pháp mô hóa miễn dịch<br />
(hình 5). Kết quả thí nghiệm cho biết thời điểm vi khuẩn S.iniae xâm nhập vào gan, não và mắt tương đương<br />
nhau. Sau 24 giờ thí nghiệm vi khuẩn mới hiện diện ở các cơ quan này và mật độ vi khuẩn tiếp tục tăng cao ở<br />
48 giờ tiếp theo. Mặt dù không thấy sự khác biệt về vị trí xâm nhập của vi khuẩn ở gan và não cá nhưng ở mắt,<br />
vị trí ưa thích của vi khuẩn S.iniae có lẽ là tầng ngoài của võng mạc mắt. Quá trình cảm nhiễm vào ruột của vi<br />
khuẩn S.iniae hình như tốn nhiều thời gian hơn. Phải sau 24 giờ mới phát hiện được sự có mặt của vi khuẩn<br />
này ở ruột cá.<br />
<br />
B<br />
D<br />
Hình 5. Một số cơ quan cá chẽm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae sau khi nhuộm mô hóa miễn dịch<br />
(A: gan; B,C: lách; D: não; E: võng mạc; F: ruột)<br />
<br />
6 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG<br />
<br />
Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản<br />
3. Thảo luận<br />
Dấu hiệu bệnh lý của cá mắc nhiễm vi khuẩn<br />
S.iniae đã được báo cáo ở nhiều loài cá khác nhau.<br />
Những tổn thương về mô học do vi khuẩn S.iniae<br />
gây ra khác nhau giữa các loài và điều kiện môi<br />
trường khác nhau. Ở thí nghiệm này, cá ít thể hiện<br />
dấu hiệu bệnh lý đặc trưng ra bên ngoài ngoại trừ<br />
dấu hiệu bơi mất định hướng. Tuy nhiên điều này đã<br />
từng xảy ra ở nhiều nghiên cứu khác. Evans (2000)<br />
và các cộng sự cho rằng dấu hiệu bệnh lý của cá<br />
nhiễm S.iniae khác nhau tùy thuộc vào cá mắc<br />
nhiễm tự nhiên hay cá bị nhiễm trong thí nghiệm<br />
và với các phương pháp cảm nhiễm khác nhau thì<br />
cá cũng thể hiện dấu hiệu bệnh lý ra bên ngoài<br />
khác nhau.<br />
So sánh với kết quả thí nghiệm tương tự do<br />
Bromage 1999 và Suanyuk 2010 đã tiến hành thì<br />
dường như độc lực của chủng vi khuẩn S.iniae<br />
phân lập từ cá chẽm bị bệnh ở Khánh Hòa thấp<br />
hơn độc lực của chủng vi khuẩn S.iniae phân lập<br />
từ cá chẽm nuôi ở Úc (LD50 = 3,2 x 104CFU) và ở<br />
Thái Lan (LD50 = 1,08 x 104CFU) (Bromage 1999;<br />
Suanyuk 2010). Tuy nhiên, rất khó để có một sự so<br />
sánh một cách chính xác về độc lực của các chủng<br />
vi khuẩn S.iniae ở nghiên cứu này và các nghiên<br />
cứu trước vì ngoài phương thức lây nhiễm, diễn tiến<br />
bệnh của cá chẽm còn phụ thuộc nhiều yếu tố khác<br />
như kích thước cá, tình trạng sức khỏe của cá hay<br />
tác động của các yếu tố môi trường nuôi…<br />
Kết quả nghiên cứu của Bromage và các cộng<br />
sự năm 1999 cho biết sau khi kết thúc thí nghiệm<br />
cảm nhiễm, vi khuẩn S.iniae vẫn còn tồn tại ở não<br />
của cá chẽm khỏe mạnh. Tuy nhiên trong nghiên<br />
cứu này, không phân lập được vi khuẩn ở bất kì cơ<br />
quan nào ở tất cả cá sống sót sau khi cảm nhiễm.<br />
Việc nghiên cứu con đường cảm nhiễm của vi<br />
khuẩn S.iniae vào cá đã từng được Nguyen thực<br />
hiện trên cá bơn (Paralichthys olivaceus) vào năm<br />
2000. Kết quả nghiên cứu của Nguyen cho thấy<br />
S.iniae xâm nhập vào cơ thể của cá bơn thông qua<br />
<br />
Số 2/2013<br />
những vị trí thương tổn của da và vây. Mắt, mũi và<br />
mang cá là nơi vi khuẩn cảm nhiễm sau khi đã vào<br />
bên trong cơ thể. Kết quả này phù hợp với nghiên<br />
cứu của Rasheed & Plumb (1984) trên cá Fundulus<br />
grandis cũng như nghiên cứu của Foo và các cộng<br />
sự (1985) ở cá Siganus canaliculatus. Tuy nhiên,<br />
nghiên cứu của Bromage và Owens (2002) về khả<br />
năng cảm nhiễm của vi khuẩn S.iniae thực hiện<br />
trên cá chẽm (Lates calcarifer) theo phương pháp<br />
ngâm kết hợp với việc gây tổn thương da cá bằng<br />
cách lấy đi 1cm2 vảy cá chẽm đã chứng minh rằng<br />
những thương tổn trên da của cá không có tác động<br />
gì đến khả năng xâm nhập của vi khuẩn S.iniae vào<br />
cơ thể cá.<br />
Kết quả kiểm tra quá trình xâm nhập của vi<br />
khuẩn S.iniae từ môi trường nuôi vào cơ thể cá<br />
chẽm bằng phương pháp mô hóa miễn dịch cho<br />
thấy mang là vị trí mà vi khuẩn xâm nhập đầu tiên.<br />
Sau 6 giờ thí nghiệm, vi khuẩn đã xuất hiện ở mang<br />
sơ cấp sau đó xâm nhập vào xoang tĩnh mạch. Thận<br />
và lách là 2 cơ quan vi khuẩn hướng đến trước khi<br />
cảm nhiễm vào gan, mắt và não và sau đó là ruột.<br />
Kết quả này phù hợp với nhận định của Nguyen<br />
2000 về quá trình phân tán của vi khuẩn S.iniae<br />
trong cơ thể cá. Vi khuẩn đi theo các mạch máu vào<br />
thận, lách của cá sau đó lại theo máu và xâm nhập<br />
vào các cơ quan khác. Tuy nhiên, trong kết quả<br />
này, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá qua mang<br />
chứ không phải qua những tổn thương ở vây như<br />
nghiên cứu của Nguyen 2000.<br />
IV. KẾT LUẬN<br />
Vi khuẩn S.iniae VN091211R là tác nhân<br />
gây bệnh nguy hiểm cho cá chẽm. Liều gây chết<br />
50% khi ngâm cá trong 1 giờ được xác định là<br />
106,8CFU/mL.<br />
Vi khuẩn S.iniae VN091211R xâm nhập từ<br />
nước vào cơ thể cá chẽm qua mang theo máu đến<br />
thận, lách sau đó lại theo máu xâm nhập đến các<br />
cơ quan khác.<br />
<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
1.<br />
<br />
Agnew W. and Barnes A.C. (2007) Streptococcus iniae: an aquatic pathogen of global veterinary significance and a<br />
challenging candidate for reliable vaccination. Veterinary Microbiology, 122:1-15.<br />
<br />
2.<br />
<br />
AL-Harbi A.H. (1994) First isolation of Streptococcus sp. from hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. aureus) in Saudi<br />
Arabia. Aquaculture, 128:195-201.<br />
<br />
3.<br />
<br />
Bromage E. and Owens L. (2002) Effect of the route of exposure with Streptococcus iniae to infection of barramundi Lates<br />
calcarifer. Diseases of Aquatic Organisms, 52(3):199-205.<br />
<br />
4.<br />
<br />
Bromage E.S., Thomas A. and Owens L. (1999) Streptococcus iniae, a bacterial infection in barramundi Lates Calcarifer.<br />
Disease of aquatic organisms, 36:177-181.<br />
<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 7<br />
<br />