Xác định genotype, đột biến BCP của HBV và codon 249 của gen P53 ở người trong huyết thanh của bệnh nhân HCC

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015<br /> <br /> XÁC ĐỊNH GENOTYPE, ĐỘT BIẾN BCP CỦA HBV VÀ CODON 249<br /> CỦA GEN P53 Ở NGƯỜI TRONG HUYẾT THANH<br /> CỦA BỆNH NHÂN HCC<br /> Đỗ Thị Thanh Thủy*, Lương Bắc An*, Vũ Diễm My*, Nguyễn Thị Cẩm Hường*, Phạm Thị Lệ Hoa*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu: Ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) là một loại ung thư thường gặp, là nguyên nhân hàng đầu dẫn<br /> đến tử vong ở các bệnh nhân ung thư. Nguyên nhân chính gây ung thư biểu mô tế bào gan, virus gây viêm gan<br /> B, viêm gan C và aflatoxin B1 (AFB) chiếm 80% các trường hợp HCC ở người. Kiểu gen của HBV, đôt biến đôi<br /> 1762T/1764A ở vùng basal core promotor (BCP) của virus HBV và đột biến tại codon R249S của gen p53 ở người<br /> được xem là những dấu ấn sinh học giúp tiên đoán khả năng mắc HCC ở bệnh nhân viêm gan do HBV và phơi<br /> nhiễm aflatoxin B1.<br /> Mục tiêu: Xác định kiểu gen của HBV bằng kỹ thuật PCR, phát hiện đột biến đôi 1762T/1764A ở vùng BCP<br /> của HBV bằng kỹ thuật giải trình tự và phát hiện đột biến codon R249S ở gen p53 ở người bằng kỹ thuật PCRRFLP và giải trình tự.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 22 mẫu máu của bệnh nhân<br /> được chẩn đoán là HCC có HBsAg (+) và HBV DNA > 1.000 IU/ml tại phòng khám viêm gan bệnh viện Đại học<br /> Y Dược Tp.HCM. Thiết lập kỹ thuật xác định kiểu gen của HBV, phát hiện đột biến đôi tại vùng BCP bằng<br /> phương pháp giải trình tự, phát hiện đột biến R429S của gen p53 ở người bằng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình<br /> tự, phân tích kết quả bằng phần mềm tin sinh học.<br /> Kết quả: Trong 22 trường hợp thỏa mãn tiêu chí của nghiên cứu, tỉ lệ nam/nữ = 2,1, có 9 trường hợp HBV<br /> genotype B (41%), 13 trường hợp HBV genotype (59%). Phát hiện có 16 trường hợp mang đột biến tại<br /> 1762T/1764A của vùng BCP (72,7%), 6 trường hợp không có đột biến đôi này. Không phát hiện có đột biến tại<br /> codon 249 của gen p53 ở người trong cả 22 trường hợp khảo sát trên.<br /> Kết luận: Nghiên cứu ứng dụng thành công kĩ thuật PCR, PCR-RFLP và kĩ thuật giải trình tự trong việc<br /> phát hiện kiểu gen của HBV, đột biến đôi 1762T/1764A tại vùng BCP của HBV và đột biến tại vị trí thường gặp<br /> R249S của gen p53 ở người trên bệnh nhân HCC. Bước đầu cho thấy HBV genotype C và đột biến đôi<br /> 1762T/1764A trên vùng BCP của HBV phổ biến ở bệnh nhân HCC. Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu trên cỡ<br /> mẫu lớn hơn nhằm xác định xem các đột biến này có là các dấu ấn tiên lượng khả năng mắc HCC ở bệnh nhân bị<br /> viêm gan do HBV và phơi nhiễm aflatoxine B1.<br /> Từ khóa: Genotype, HCC, PCR-RFLP, sequencing, mutation.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> IDENTIFICATION OF GENOTYPE AND MUTATION AT BCP OF HBV AND MUTATION AT<br /> CODON 249 OF HUMAN P53 IN SERUM OF HCC PATIENTS.<br /> Do Thi Thanh Thuy, Luong Bac An, Vu Diem My, Nguyen Thi Cam Huong, Pham Thi Le Hoa<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - Supplement of No 2 - 2015: 332 - 337<br /> Background: Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common cancer, a leading cause of death in cancer<br /> patients. The main causative agents of HCC- hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), and aflatoxin B1<br /> <br /> * Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dược TP. HCM<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS.BS. Đỗ Thị Thanh Thủy<br /> <br /> 332<br /> <br /> ĐT: 0908487425<br /> <br /> Email: thuyprenatal@gmail.com<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> (AFB) are responsible for about 80% of all HCCs in humans. Genotype of HBV, the double mutation 1762T/1764A<br /> at the basal core promoter (BCP) of HBV and the mutation at codon R249S of human p53 are considered<br /> biomarkers to help predict susceptibility to HCC in patients with HBV infection and aflatoxine B1 exposure.<br /> Objective: Identify genotype of HBV by PCR, detect the double mutation 1762T/1764A at BCP of HBV by<br /> sequencing, and detect the mutation at codon R429S of p53 gene by PCR-RFLP and sequencing.<br /> Method: Descriptive cross-sectional study performed on 22 blood samples from HCC diagnosed patients<br /> with positive HbsAg and HBV DNA > 1.000 UI/ml at Hospital of University Medical Center, HCMC. Setting<br /> up techniques for identifying HBV genotype by PCR, detecting double mutations at BCP region by sequencing<br /> and detecting R249S mutation at p53 human gene by PCR-RFLP and sequencing as well as result analysis by<br /> bioinformatics software.<br /> Result: In 22 cases met the criteria of our study, male/female = 2.1, there were 9 cases of HBV genotype B<br /> (41%) and 13 cases of HBV genotype C (59%). We detected 16 cases carrying the double mutation 1762T/1764A<br /> in BCP region (72.7%) and 6 cases with no mutation. We did not detect any case with the mutation at codon 249<br /> of p53 human gene.<br /> Conclusion: Our research successfully applied PCR, PCR-RFLP, and sequencing in detection of HBV<br /> genotypes, double mutation 1762T / 1764A in the BCP region of HBV and the hotspot mutation at position 249 of<br /> p53 human gene in HCC patients. Initially, the study showed that HBV genotype C and double mutation 1762T /<br /> 1764A in BCP region are common in patients with HCC. However, we need to look for mutations on a larger<br /> sample size to determine if these mutations could be used as prognostic markers of susceptibility to HCC in<br /> patients with hepatitis B and exposure aflatoxine B.<br /> Key work: Genotype, HCC, PCR-RFLP, sequencing, mutation.<br /> tại vùng này có khả năng làm gia tăng nguy cơ<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan. Vì<br /> Ung thư biểu mô tế bào gan nguyên phát<br /> vậy, các đột biến này được coi là các dấu ấn sinh<br /> (Hepatocellular Carcinoma- HCC) là một bệnh<br /> học giúp theo dõi và phát hiện sớm các bệnh<br /> lý ác tính của tế bào gan. Ở Việt Nam, số bệnh<br /> nhân có nguy cơ bị ưng thư gan. Ngoài ra, việc<br /> nhân ung thư gan đứng hàng thứ ba sau ung thư<br /> xác định genotype của HBV cũng liên quan đến<br /> phổi, ung thư dạ dày ở nam và sau ung thư vú,<br /> khả năng phát triển HCC(11), vì tại Việt Nam có 2<br /> ung thư cổ tử cung ở nữ giới. Tại châu Á, có tới<br /> loại HBV genotype phổ biến là B và C, trong đó<br /> 75% trường hợp HCC do nhiễm virus viêm gan<br /> nhiễm HBV genotype C là một yếu tố thuận lợi<br /> B (HBV) và virus viêm gan C (HVC) mạn tính,<br /> dễ tiến triển thành viêm gan mạn, xơ gan và ung<br /> xơ gan(5,6). Theo WHO, Việt Nam được xếp vào<br /> thư gan. Bên cạnh nguyên gây HCC trên, người<br /> vùng lưu hành cao của nhiễm vi rút viêm gan B,<br /> ta còn đặc biệt chú ý tới độc tố aflatoxin được<br /> tỉ lệ nhiễm HBV ở Việt Nam trung bình vào<br /> sinh ra từ nấm mốc aspergillus flavus, aspergillus<br /> khoảng 15%, như vậy tính ra có khoảng 10-12<br /> parasiticus(9,6). Có trên 17 loại aflatoxin khác nhau,<br /> triệu người đang mang mầm bệnh. Theo Hội<br /> trong đó aflatoxin B1 (AFB1) có độc tính mạnh<br /> gan mật Việt Nam năm 2013, Việt Nam là một<br /> nhất. Ước tính có khoảng 4,5 tỉ người trên thế<br /> trong vài nước có tỉ lệ nhiễm bị HBV cao vào bậc<br /> giới có nguy cơ phơi nhiễm với aflatoxin trong<br /> nhất thế giới. Theo một số nghiên cứu về HCC<br /> thực phẩm(3,10). Các báo cáo dịch tễ cho thấy<br /> tại Trung Quốc và các nước châu Phi, có sự xuất<br /> AFB1 đóng vai trò quan trọng nhất trong tỉ lệ<br /> hiện đột biến đôi trong vùng BCP (Basic Core<br /> người bị HCC. Gen p53 là gen ức chế khối u ở<br /> Promoter) gồm A thành T tại nucleotid 1762 và<br /> người và thường có tần suất đột biến cao ở bệnh<br /> G thành A tai nucleotid 1764 của HBV. Đột biến<br /> nhân ung thư (hơn 50% trường hợp ung thư ở<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> 333<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015<br /> <br /> người có đột biến ở gen này). Do vậy, gen p53<br /> được xem là một trong các dấu ấn cho các xét<br /> nghiệm ung thư. Hơn 50% bệnh nhân HCC phơi<br /> nhiễm AFB1 có mang đột biến tại codon 249<br /> (R249S) trên exon 7 của gen p53 gây sự biến đổi<br /> amino acid Arg thành Ser(9,11). Đột biến hotspot<br /> R249S được coi là một dấu ấn phản ánh ung thư<br /> biểu mô tế bào gan do nhiễm AFB1. Việc tìm<br /> hiểu về đột biến hotspot R249S của gen p53 ở<br /> bệnh nhân HCC Việt Nam là cần thiết(8, 7).<br /> Chính vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát<br /> genotype, đột biến đôi vùng BCP của HBV, và<br /> đồng thời phát hiện đột biến tại codon 249 của<br /> gen p53 ở người trong huyết thanh của bệnh nhân<br /> HCC bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như<br /> PCR, giải trình tự gen để tìm hiểu về tỉ lệ của các<br /> đột biến này cũng như kiểu gen HBV trong các<br /> mẫu mô gan được chẩn đoán CT là HCC.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> Thiết kế nghiên cứu<br /> Mô tả cắt ngang. Lấy mẫu thuận lợi.<br /> <br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Bệnh nhân được chẩn đoán HCC có HbsAg<br /> (+) từ tháng 1-2013 đến tháng 9-2014 tại bệnh<br /> viện Đại học Y Dược.<br /> <br /> Đối tượng loại trừ<br /> Bệnh nhân được chẩn đoán HCC có<br /> HbsAg (+) nhưng HBV ADN âm tính.<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Định lượng ADN của HBV<br /> Để xác định mẫu HBV (+) bằng kỹ thuật real<br /> time PCR. Các mẫu được chọn khi có tải lượng<br /> HBV > 1.000 UI/ml.<br /> Kỹ thuật ly trích DNA từ huyết tương<br /> ADN của HBV được tách chiết bằng bộ kit<br /> BOOM theo nguyên lý là sử dụng Guanidine<br /> thiocyanate (GuSCN) để ly giải hoạt tính của<br /> nuclease, và các ADN từ HBV được phóng<br /> thích sẽ bám vào các hạt silica, nhờ đó ADN từ<br /> mẫu bệnh phẩm sẽ được tách chiết một cách<br /> tinh khiết.<br /> <br /> 334<br /> <br /> Mồi cho phản ứng<br /> Mồi sử dụng để xác định kiểu gen B và C của<br /> HBV được liệt kê tại bảng 1(4).<br /> PCR xác định kiểu gen HBV<br /> Sử dụng bộ kít Hot Start Taq Polymerase<br /> của Takara. Tiến hành phản ứng PCR với các<br /> mồi BGB2, BB1R và BC1R và chu kì nhiệt PCR:<br /> 98oC/3 phút; 45 chu kì với mỗi chu kì gồm 2<br /> bước: 98oC/10 giây, 58oC/20 giây; 1 chu kì<br /> 72oC/5 phút. Tiến hành điện di sản phẩm với<br /> gel 3% ở 70V trong 40 phút có chứa ethidium<br /> bromide. Sau đó đọc kết quả điện di nhằm xác<br /> định kiểu gen.<br /> PCR khuếch đại vùng BCP HBV<br /> Các mẫu bệnh phẩm đã xác định được<br /> genotype của HBV thì sẽ tiếp tục được khuếch<br /> đại vùng BCP để xác định đột biến đôi tại A1762T<br /> và G1764A. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi<br /> BCF2 và BCR2 để khuếch đại vùng gen cần giải<br /> trình tự với chương trình PCR như sau: 1 chu kì<br /> 98oC/3 phút; 40 chu kì gồm 3 bước: 98oC/10 giây,<br /> 60oC/30 giây, 72oC/1 phút; 1 chu kì 72oC/3 phút.<br /> Tiến hành điện di sản phẩm với gel 2% ở 100V<br /> trong 30 phút có chứa ethidium bromide.<br /> Giải trình tự vùng BCP HBV<br /> Sản phẩm PCR vùng BCP trên được tinh<br /> sạch với bộ kit Illustra GFX PCR DNA and Gel<br /> Band Purification Kit (GE healthcare), bảo quản<br /> sản phẩm tinh sạch tại nhiệt độ 4oC. Sau đó giải<br /> trình tự đoạn gen bằng mồi BCF2 (bảng 2) bằng<br /> hệ thống điện di mao quản 3130 xl với thuốc thử<br /> ABI PRISM Big Dye Terminator V3.1 Cycle<br /> Sequencing Ready reaction (AB, USA).<br /> PCR khuếch đại Exon 7 của gen p53<br /> Sử dụng bộ kít Hot Start Taq Polymerase của<br /> Takara. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi<br /> p53-7F và p53-7R để khuếch đại vùng exon 7 của<br /> gen P53 ở người cần giải trình tự. Các mồi thực<br /> hiện PCR được liệt kê trong bảng 3. Chu trình<br /> nhiệt PCR như sau: 1 chu kì 98oC/3 phút; 40 chu<br /> kì gồm 3 bước: 98oC/10 giây, 58oC/20 giây,<br /> 72oC/20 giây; 1 chu kì 72oC/3 phút. Tiến hành<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> điện di sản phẩm với gel 3% ở 100V trong 30<br /> phút có chứa ethidium bromide.<br /> <br /> kiểu đột biến tại vị trí hotspot R249S của gen<br /> p53 ở người.<br /> <br /> Bảng 1: Mồi xác định kiểu gen của virus HBV<br /> <br /> Bảng 4: Kiểu gen, kiểu đột biến đôi tại A1762C và<br /> G1764T của HBV và kiểu đột biến tại vị trí hotspot<br /> R249S của gen p53.<br /> <br /> Mồi<br /> Trình tự (5’-3’)<br /> Mồi chung BGB2 GGC TCM AGT TCM GGA ACA GT<br /> Genotype B BB1R CAG GTT GGT GAG TGA CTG GAG A<br /> Genotype C BC1R GGT CCT AGG AAT CCT GAT GTT G<br /> <br /> Bảng 2: Mồi sử dụng PCR và giải trình tự vùng<br /> BCP HBV<br /> Mồi<br /> BCF2<br /> BCR2<br /> <br /> Trình tự (5’-3’)<br /> AGC AAT GTC AAC GAC CGA CC<br /> AGT AAC TCC ACA GTA GCT CC<br /> <br /> Bảng 3: mồi sử dụng cho PCR và giải trình tự vùng<br /> Exon 7 của gen p53(7).<br /> Mồi<br /> Trình tự (5’-3’)<br /> p53-7F GTT GGC TCT GAC TGT ACC AC<br /> PCR-RFLP<br /> p53-7R CTG GAG TCT TCC AGT GTG AT<br /> p53-seq7F GGC CTC CCC TGC TTG CCA CA<br /> PCRsequencing p53-vu7R TGC AGG GTG GCA AGT GGC<br /> TC<br /> <br /> Cắt enzyme xác định đột biến tại codon 249<br /> của gen p53<br /> Sử dụng bộ cắt enzyme BsuRI (HaeIII) của<br /> Thermo Scientific. Thực hiện phản ứng cắt theo<br /> hướng dẫn của nhà sản xuất. Ủ sản phẩm cắt ở<br /> 37oC trong 1 giờ. Điện di sản phẩm cắt với gen<br /> 4% ở 70V trong 40 phút có chứa ethidium<br /> bromide. Ngoài việc xác định đột biến tại vị trí<br /> hotspot R249S của gen p53 bằng phương pháp<br /> PCR-RFLP<br /> (restriction<br /> fragment<br /> length<br /> polymorphysim – Đa hình chiều dài các đoạn cắt<br /> hạn chế), chúng tôi khẳng định kết đột biến bằng<br /> phương pháp giải trình gen vùng exon 7 của gen<br /> p53 ở người.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Trong 22 bệnh nhân của nhóm nghiên cứu,<br /> bệnh nhân nhỏ tuổi nhất là 32 tuổi và bệnh nhân<br /> lớn tuổi nhất là 69 tuổi. Số bệnh nhân nam lớn<br /> gấp 2,1 lần so với số bệnh nhân nữ (15/7). Tất cả<br /> các bệnh nhân đã được chẩn đoán lâm sàng mắc<br /> ung thư biểu mô tế bào gan dựa trên kết quả CT<br /> scan và tăng AFP máu.<br /> Bảng 4 trình bày kết quả vầ kiểu gen, kiểu<br /> đột biến đôi tại A1762T và G1764A của HBV và<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Bệnh<br /> nhân<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> 11<br /> 12<br /> 13<br /> 14<br /> 15<br /> 16<br /> 17<br /> 18<br /> 19<br /> 20<br /> 21<br /> 22<br /> <br /> Giới Tuổi<br /> Đột biến<br /> Đột biến<br /> Genotype<br /> tính<br /> 1762/1764 (codon 249)<br /> Nam 69<br /> B<br /> WT<br /> WT<br /> 49<br /> Nữ<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> Nam 41<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> Nam 35<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> 41<br /> Nam<br /> B<br /> WT<br /> MT<br /> Nam 53<br /> B<br /> WT<br /> MT<br /> 55<br /> Nữ<br /> B<br /> WT<br /> MT<br /> 32<br /> Nữ<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> 43<br /> Nữ<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> Nam 52<br /> B<br /> WT<br /> WT<br /> Nam 57<br /> B<br /> WT<br /> WT<br /> Nam 55<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> Nam 55<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> Nữ<br /> 53<br /> C<br /> WT<br /> WT<br /> Nam 50<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> Nữ<br /> 35<br /> B<br /> WT<br /> WT<br /> 50<br /> Nam<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> Nam 53<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> Nam 39<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> Nam 48<br /> B<br /> WT<br /> WT<br /> 58<br /> Nữ<br /> C<br /> WT<br /> MT<br /> Nam 39<br /> B<br /> WT<br /> MT<br /> <br /> MT: mutation-đột biến WT: Wild type: thể hoang dại<br /> <br /> Kiểu gen của HBV<br /> Xác định kiểu gen của HBV bằng cách sử<br /> dụng các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho<br /> từng kiểu gen của virus. Xác định kiểu gen<br /> chủ yếu dựa trên trình tự gen ở vùng gen S.<br /> Đến nay đã có 10 loại genotype HBV được xác<br /> định trên thế giới và được đặt tên từ A đến J,<br /> dựa vào sự khác biệt của bộ gen từ 8% trở lên.<br /> Trong đó, các genotype B, C và A phổ biến ở<br /> các nước châu Á, còn ở Việt Nam, chỉ có 2 loại<br /> genotype là B và C, trong đó genotype B gấp<br /> ba lần so với genotype C(4).<br /> Trong 22 mẫu HCC này, có 9 trường hợp<br /> mang kiểu gen B (41%) và 13 trường hợp mang<br /> kiểu gen C (59%). Như vậy ở các bệnh nhân<br /> HCC, genotype C tương đối nhiều hơn so với<br /> <br /> 335<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015<br /> <br /> genotype B. Trong khi đó, theo một nghiên cứu<br /> khảo sát của Cao Minh Nga và cộng sự ở bệnh<br /> nhân nhiễm HBV thì tỉ lệ genotype B là 69,6% và<br /> genotype C là 7,6%(1). Điều đó cho thấy những<br /> bệnh nhân nhiễm HBV genotype C có khả năng<br /> cao mắc HCC.<br /> <br /> Đột biến đôi vùng BCP<br /> <br /> trong một nghiên cứu trước đó ở trẻ em mắc<br /> HCC, làm tăng hoạt động của core promotor<br /> khoảng 2-8 lần. Đột biến này được cho là hình<br /> thành một vị trí giả định gắn yếu tố 3 trong sao<br /> chép tại nhân tế bào gan (transcription factor<br /> hepatocyte nuclear factor 3 – HNF3)(2). Đột biến<br /> A1762C chưa thấy có báo cáo ghi nhận.<br /> <br /> Giải trình tự một vùng gen HbX có chứa<br /> vùng BCP. Kết quả hiển thị trên CLC Main<br /> Workbench cho thấy tín hiệu của từng<br /> nucleotide thể hiện qua từng đỉnh sóng đều, tín<br /> hiệu nền hầu như không bị nhiễu. Điều này<br /> chứng tỏ sản phẩm của phản ứng PCR và giải<br /> trình tự có độ tinh sạch cao, không bị tạp nhiễm,<br /> kết quả phân tích là chính xác, khách quan và có<br /> độ tin cậy cao. Kết quả giải trình tự vùng BCP<br /> cho thấy có 15 trường hợp mang đột biến đôi<br /> A1762T, G1764A (68,2%); 1 trường hợp mang đột<br /> biến A1762C, G1764T (4,5%) và 6 trường hợp không<br /> mang đột biến (27,3%). Tần suất đột biến của<br /> nghiên cứu tương đương với nghiên cứu của<br /> Shuang-Yuan Kuang và cộng sự(11). Một trường<br /> hợp đột biến mới được tìm thấy đó là A1762C và<br /> G1764T. Đột biến G1764T đã từng được biết đến<br /> <br /> Đột biến tại vùng core promotor có thể ảnh<br /> hưởng tới sự biểu hiện gen và sao chép của virus<br /> HBV. Đột biến đôi A1762T và G1764A được mô tả ở<br /> nhiều trạng thái nhiễm của HBV. Ý nghĩa sinh<br /> học của đột biến đôi này vẫn đang được nghiên<br /> cứu, đặc biệt có liên quan tới đột biến codon stop<br /> tại vùng precore. Đột biến đôi tại BCP cho thấy ở<br /> một số trường hợp nghiên cứu có HbeAg âm<br /> tính, sự hiện diện của đột biến đôi này cho thấy<br /> có sự ức chế điều hòa sản xuất của HBeAg. Đột<br /> biến đôi làm giảm mức độ mRNA precore vì vậy<br /> dẫn tới giảm sự hình thành HBeAg. Đột biến này<br /> gây gia tăng tần số bệnh lý do HBV như viêm<br /> gan kịch phát, viêm gan mạn tính có HBeAg và<br /> anti-HBeAg dương tính, ung thư biểu mô tế bào<br /> gan. Tuy nhiên vẫn còn nhiều tranh cãi về các<br /> đột biến ở nhưng vùng địa lí khác nhau.<br /> <br /> 1762<br /> <br /> 17<br /> <br /> 1764<br /> <br /> Sóng bình thường<br /> <br /> Sóng đột biến<br /> <br /> Sóng đột biến mới<br /> <br /> Hình 1: Đột biến tại vị trí 1762 và 1764.<br /> <br /> Xác định đột biến codon 249 của gen p53 ở<br /> người bằng phương pháp PCR-RFLP và<br /> giải trình gen<br /> Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại exon 7<br /> của gen p53 là 110 bp(7). Trong trường hợp có đột<br /> biến của codon 249 làm cho mất vị trí cắt của<br /> enzym BsuRI. Do đó sản phẩm điện di sau phản<br /> <br /> 336<br /> <br /> ứng cắt bằng enzym cắt hạn chế RE, dạng wt<br /> đồng hợp tử có 2 băng sáng tại vị trí 74bp và<br /> 36bp, dạng đột biến dị hợp tử sẽ có 3 băng tại<br /> 110, 74 và 36 bp, còn dạng đột biến đồng hợp tử<br /> sẽ chỉ có một băng sáng tại 110 bp.<br /> Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại exon<br /> 7 của 22 trường hợp bệnh nhân. Tiến hành xác<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br />