Xác định hàm lượng axit shikimic trong hồi Việt Nam

T¹p chÝ Hãa häc, T. 45 (6A), Tr. 199 - 204, 2007<br /> <br /> <br /> <br /> X¸c ®Þnh hµm l îng axit shikimic trong håi viÖt nam<br /> §Õn Tßa so¹n 15-11-2007<br /> §o n ThÞ Mai H ¬ng, NguyÔn QuyÕt ChiÕn, NguyÔn ThÞ Hång H¹nh,<br /> NguyÔn V¨n Hïng<br /> ViÖn Hãa häc, ViÖn Khoa häc v& C«ng nghÖ ViÖt Nam<br /> <br /> SUMMARY<br /> Shikimic acid is an important product in the synthesis of the anti-influenza drug osseltamivir<br /> phosphate. LC-MS method was applied for the determination and quantification of shikimic acid<br /> from Vietnamese star anis (Illicium verum Hook.f.). Using the instrument system LC/MSD Agilent<br /> series 1110, separation was performed on a Zorbax SB-C18 RP (3.0x150 mm) column with water<br /> containing 0.1% formic acid and methanol as mobile phase. Analytes were detected both by DAD<br /> at 210 nm and by MS detectors. Analytical results showed the percentige of shikimic acid in dried<br /> Vietnamese star anis obtains from 5.78 to 8.17%.<br /> <br /> <br /> I - Më ®Çu HO COOH<br /> <br /> Axit shikimic (3,4,5-trihydroxy-1-<br /> cyclohexene-1-carboxylic acid) (1) ®#îc t¸ch ra HO<br /> lÇn ®Çu tiªn tõ qu¶ cña mét lo.i Håi cã ®éc tÝnh, OH<br /> gäi l. Håi NhËt b¶n Illicium anisatum n¨m 1885 1: Axit shikimic<br /> [1] d#íi d¹ng tinh thÓ m.u tr¾ng. Axit shikimic<br /> l. nguyªn liÖu ban ®Çu quan träng ®Ó tæng hîp II - NGUY£N LiÖu v ph ¬ng ph¸p<br /> ra thuèc Tamiflu ch÷a bÖnh cóm gia cÇm [2 - 5]. nghiªn cøu<br /> Trong khu«n khæ ®Ò t.i ®éc lËp cÊp nh. n#íc vÒ<br /> nghiªn cøu thuèc ch÷a bÖnh cóm gia cÇm, ®Ó 1. Nguyªn liÖu<br /> phôc vô cho viÖc nghiªn cøu chiÕt xuÊt axit Qu¶ håi (Illicium verum Hook.f., hä<br /> shikimic tõ qu¶ håi cña ViÖt Nam tr#íc ®©y Illiciaceae), ®#îc PGS. L#u §.m C# - ViÖn Sinh<br /> chóng t«i ®R x©y dùng ph#¬ng ph¸p ®Þnh l#îng th¸i v. T.i nguyªn Sinh vËt, ViÖn Khoa häc v.<br /> axit shikimic b»ng m¸y s¾c ký láng cao ¸p kÕt C«ng nghÖ ViÖt Nam x¸c ®Þnh v. thu h¸i ë c¸c<br /> nèi víi m¸y ®o phæ khèi l#îng (ph#¬ng ph¸p huyÖn V¨n LRng (VL), V©n Méng (VM), B¾c<br /> LC-MS) [6]. TiÕp tôc c¸c nghiªn cøu trong S¬n (BS) v. B×nh Gia (BG), tØnh L¹ng S¬n v.o<br /> khu«n khæ ®Ò t.i, trong b.i b¸o n.y chóng t«i th¸ng 9/2006. MÉu tiªu b¶n ®#îc l#u gi÷ t¹i<br /> tr×nh b.y c¸c kÕt qu¶ kh¶o s¸t chÊt l#îng d#îc ViÖn Sinh th¸i v. T.i nguyªn Sinh vËt.<br /> liÖu v. ph#¬ng ph¸p chiÕt xuÊt axit shikimic tõ Axit shikimic chuÈn cã ®é s¹ch 99% mua<br /> qu¶ håi ë c¸c vïng nguyªn liÖu kh¸c nhau. cña hRng Aldrich.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 199<br />  C¸c dung m«i, hãa chÊt ®¹t tiªu chuÈn dïng Dynode 7,0 kV.<br /> cho HPLC mua cña hRng Merck. C¸c dung dÞch axit shikimic chuÈn cã nång<br /> 1. M¸y mãc thiÕt bÞ ®é 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45<br /> v. 0,5 mg/ml MeOH ®R ®#îc ®o lÆp l¹i 3 lÇn<br /> C¸c mÉu ®#îc ®o trªn hÖ thèng m¸y s¾c ký b»ng LC/MS.<br /> láng cao ¸p kÕt nèi víi m¸y ®o phæ khèi l#îng<br /> LC/MSD Agilent series 1100 cña ViÖn Ho¸ häc, ChuÈn bÞ mÉu chuÈn v. tiÕn h.nh ®o: Axit<br /> ViÖn KH&CN ViÖt Nam. shikimic chuÈn ®#îc c©n chÝnh x¸c 50 mg cho<br /> v.o b×nh ®Þnh møc (50 ml) sau ®ã thªm MeOH<br /> 2. ChuÈn bÞ mÉu v ®iÒu kiÖn ®o LC-MS cho ®Õn v¹ch ta ®#îc dung dÞch gèc. Pha loRng<br /> ChuÈn bÞ mÉu ®Ó kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn chiÕt dung dÞch gèc th.nh c¸c dung dÞch cã nång ®é<br /> 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45 v.<br /> *Ng©m ChiÕt 0,5 mg/ml, sau ®ã ch¹y lÇn l#ît c¸c dung dÞch<br /> - 30 g bét qu¶ håi kh« nghiÒn nhá cña huyÖn cã nång ®é trªn qua hÖ thèng LC/MS víi cét<br /> B×nh Gia ®#îc ng©m chiÕt 4 lÇn x 6h trong b×nh ph©n tÝch: Zorbax SB -C18 RP (3,0 × 150 mm),<br /> nãn 250 ml víi c¸c lo¹i dung m«i kh¸c nhau ë DAD v. MS. Thêi gian ch¹y 35 phót/phÐp ®o.<br /> 50oC. Sau khi läc, dung m«i ®#îc cÊt lo¹i trªn §#êng chuÈn ®#îc x©y dùng b»ng ph#¬ng ph¸p<br /> bé quay cÊt ch©n kh«ng d#íi ¸p suÊt gi¶m thu håi qui tuyÕn tÝnh.<br /> ®#îc c¸c cÆn dÞch chiÕt. ChuÈn bÞ mÉu ph©n tÝch: C¸c dÞch chiÕt<br /> C¸c hÖ dung m«i ®#îc kh¶o s¸t l.: axeton, (chiÕt xuÊt tõ qu¶ håi nh# m« t¶ ë b¶ng 1 v.<br /> EtOAc/EtOH (50/50), EtOH/Axeton (50/50), b¶ng 3) ®#îc pha trong metanol víi nång ®é 0,5<br /> EtOH/H2O (50/50), H2O, MeOH, EtOH. Qu¸ mg cÆn dÞch chiÕt/ml MeOH.<br /> tr×nh chiÕt víi EtOH ®#îc thùc hiÖn ë 50oC v.<br /> nhiÖt ®é phßng (xem chi tiÕt ë b¶ng 1). III - KÕt qu¶ v th¶o luËn<br /> *ChiÕt Soxhlet<br /> KÕt qu¶ x©y dùng ®+êng chuÈn<br /> 80 g bét qu¶ håi kh« ®#îc chiÕt Soxhlet víi<br /> etanol 95% trong 8h . Dung m«i ®#îc cÊt lo¹i D#íi ®©y l. h×nh s¾c ký ®å cña axit shikimic<br /> d#íi ¸p thÊp gi¶m thu ®#îc cÆn dÞch etanol trong dÞch chiÕt soxhlet víi EtOH víi thêi gian<br /> (xem chi tiÕt ë b¶ng 1). l#u l. 2,089 phót v. diÖn tÝch pic l. 3159,27 v.<br /> phæ khèi ESI-MS cña axit shikimic cã pic ion ë<br /> ChuÈn bÞ mÉu ®Ó kh¶o s¸t nguyªn liÖu<br /> m/z 197 [M+Na]+.<br /> 30 g bét qu¶ håi kh« nghiÒn nhá cña huyÖn Sö dông axit shikimic tinh khiÕt mua cña<br /> B×nh Gia, V¨n LRng, V©n Méng, B¾c S¬n ®#îc hRng Aldrich v. chän kho¶ng ®o víi nång ®é<br /> ng©m chiÕt 4 lÇn × 6h trong b×nh nãn 250 ml víi axit shikimic tõ 0,10 ®Õn 0,50 mg/ml ta nhËn<br /> EtOH ë 50oC. Sau khi läc, dung m«i ®#îc cÊt ®#îc ®#êng chuÈn tuyÕn tÝnh nh# thÓ hiÖn trªn<br /> lo¹i trªn bé quay cÊt ch©n kh«ng d#íi ¸p suÊt h×nh vÏ 2 víi hÖ sè t#¬ng quan R2 l. 0,9982 [6].<br /> gi¶m thu ®#îc c¸c cÆn dÞch chiÕt (xem chi tiÕt ë<br /> b¶ng 3). KÕt qu¶ t×m ph+¬ng ph¸p chiÕt<br /> §iÒu kiÖn tiÕn h.nh c¸c phÐp ®o LC-MS: Sau khi tiÕn h.nh chiÕt xuÊt mÉu håi cña<br /> huyÖn B×nh Gia chóng t«i nhËn thÊy r»ng<br /> Th«ng sè cña HPLC: Pha ®éng : Kªnh A :<br /> ph#¬ng ph¸p chiÕt xuÊt Soxhlet víi EtOH cã<br /> H2O + 0,1% axit focmic; Kªnh B : CH3OH.<br /> h.m l#îng dÞch chiÕt cao nhÊt l. 24,5%. C¸c<br /> Tèc ®é dßng 0,4 ml/phót, ch¹y gradient kªnh A<br /> ph#¬ng ph¸p chiÕt xuÊt víi MeOH, EtOH, hçn<br /> tõ 95% - 0%, kªnh B tõ 5% - 100%. DAD: hÊp<br /> hîp EtOH/H2O (50/50) cho kÕt qu¶ kh«ng<br /> thô cùc ®¹i ë b#íc sãng 210 nm.<br /> chªnh lÖch nhau nhiÒu tõ 21,1 ®Õn 22,9%. Riªng<br /> Th«ng sè cña MS: Nguån ion ho¸ ESI - MS; hÖ dung m«i EtOH/Axeton (50/50) v. axeton<br /> nhiÖt ®é l.m kh« 325oC; khÝ l.m kh« 8 lÝt/phót; cho kÕt qu¶ thÊp nhÊt víi h.m l#îng dÞch chiÕt<br /> ¸p suÊt phun mï 30 psi; ch©n kh«ng 2,53.10-5 lÇn l#ît l. 16,4 v. 14,4% (xem b¶ng 1)<br /> mbar; ®iÖn thÕ detect¬ 1188 V; §iÖn thÕ<br /> 200<br />  H×nh 1: S¾c ký ®å v. phæ khèi l#îng cña axit shikimic trong dÞch chiÕt EtOH soxhlet<br /> <br /> 7000<br /> <br /> 6000<br /> <br /> 5000<br /> Dien tich pic<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 4000<br /> <br /> 3000<br /> y = 8163.5x + 1814.7<br /> 2000 R2 = 0.9982<br /> <br /> 1000<br /> 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60<br /> Nong do mg/ml<br /> <br /> <br /> <br /> H×nh 2: §#êng chuÈn axit shikimic<br /> <br /> B¶ng 1: KÕt qu¶ chiÕt håi cña huyÖn B×nh Gia b»ng c¸c ph#¬ng ph¸p kh¸c nhau<br /> H.m l#îng<br /> ST Khèi l#îng qu¶ NhiÖt Khèi l#îng Ký hiÖu<br /> Dung m«i chiÕt dÞch chiÕt,<br /> T håi kh«, g ®é, oC dÞch chiÕt, g dÞch chiÕt<br /> %<br /> 1 30 Axeton 50 4,29 14,3 BG1<br /> EtOAc/EtOH<br /> 2 30 50 6,00 20,0 BG2<br /> (50/50)<br /> EtOH/Axeton<br /> 3 30 50 4,92 16,4 BG3<br /> (50/50)<br /> EtOH/H2O<br /> 4 30 50 6,67 22,2 BG4<br /> (50/50)<br /> 5 30 H2O 50 5,27 17,5 BG5<br /> 6 30 MeOH 50 6,87 22,9 BG6<br /> 7 30 EtOH 50 6,34 21,1 BG7<br /> 8 30 EtOH to phßng 5,72 19,0 BG8<br /> 9 80 EtOH soxhlet 19,60 24,5 BG9<br /> <br /> <br /> <br /> 201<br />  §Ó x¸c ®Þnh h.m l#îng axit shikimic trong khi chiÕt víi c¸c lo¹i dung m«i kh¸c. Khi chiÕt<br /> c¸c mÉu thö cña huyÖn B×nh Gia, chóng t«i tiÕn víi dung m«i EtOH b»ng ph#¬ng ph¸p soxhlet<br /> h.nh ph©n tÝch c¸c dÞch chiÕt kh¸c nhau nh# ®R v. ®un khuÊy ë 50oC cho kÕt qu¶ cao h¬n khi<br /> nªu ë b¶ng 1 víi c¸c ®iÒu kiÖn ®R lùa chän ë chiÕt ë nhiÖt ®é th#êng víi l#îng axit shikimic<br /> trªn. Cïng ë nhiÖt ®é 50oC th× h.m l#îng axit thu ®#îc tõ hoa håi kh« lÇn l#ît l. 8,82%;<br /> shikimic thu ®#îc khi chiÕt víi EtOH cao h¬n 8,18% v. 6,88% (xem b¶ng 2).<br /> <br /> B¶ng 2: KÕt qu¶ ®Þnh l#îng h.m l#îng axit shikimic trong c¸c dÞch chiÕt tõ qu¶ håi trång ë<br /> huyÖn B×nh Gia<br /> Axit shikimic Axit shikimic Axit shikimic<br /> STT Tªn mÉu DiÖn tÝch pic trong mÉu ®o, trong dÞch chiÕt, trong mÉu th«,<br /> mg/ml % %<br /> 1 BG1 2606,81 0,11433 22,865 3,27<br /> <br /> 2 BG2 2909,54 0,14914 29,828 5,96<br /> <br /> 3 BG3 2990,05 0,15840 31,680 5,19<br /> <br /> 4 BG4 3020,40 0,16189 32,378 7,20<br /> <br /> 5 BG5 3361,34 0,20110 40,219 7,06<br /> <br /> 6 BG6 2858,21 0,14324 28,647 6,56<br /> <br /> 7 BG7 3297,45 0,19375 38,750 8,18<br /> <br /> 8 BG8 3182,41 0,18052 36,104 6,88<br /> <br /> 9 BG9 3159,27 0,18001 36,007 8,82<br /> <br /> KÕt qu¶ kh¶o s¸t s¬ bé nguyªn liÖu thu ®#îc cña c¸c mÉu kh«ng qu¸ chªnh lÖch<br /> nhau. MÉu håi cña huyÖn B×nh Gia cã h.m<br /> Sau khi tiÕn h.nh chiÕt xuÊt mÉu håi cña c¸c l#îng dÞch chiÕt thÊp nhÊt (21,15%) v. mÉu håi<br /> huyÖn B×nh Gia, V¨n LRng, V©n Méng v. B¾c cña huyÖn V¨n LRng cã h.m l#îng dÞch chiÕt<br /> S¬n chóng t«i thÊy r»ng h.m l#îng dÞch chiÕt cao nhÊt (23,8%).<br /> <br /> B¶ng 3: C¸c dÞch chiÕt EtOH cña qu¶ håi trång ë 4 huyÖn cña tØnh L¹ng S¬n<br /> Khèi l#îng H.m l#îng<br /> Khèi l#îng hoa §Þa ph#¬ng NhiÖt ®é Ký hiÖu<br /> STT dÞch chiÕt dÞch chiÕt,<br /> håi kh«, g trång håi chiÕt, oC dÞch chiÕt<br /> EtOH, g %<br /> 1 2 3 4 5 6 7<br /> 1 30 B×nh Gia 50 6,34 21,1 BG7.1<br /> <br /> 2 30 B×nh Gia 50 6,37 21,2 BG7.2<br /> <br /> H.m l#îng dÞch chiÕt trung b×nh cña huyÖn B×nh Gia 21,15<br /> <br /> 3 30 V¨n LRng 50 7,27 24,2 VL7.1<br /> <br /> 202<br />  1 2 3 4 5 6 7<br /> 4 30 V¨n LRng 50 7,04 23,4 VL7.2<br /> <br /> H.m l#îng dÞch chiÕt trung b×nh cña huyÖn V¨n LRng 23,80<br /> <br /> 5 30 V©n Méng 50 7,14 23,8 VM7.1<br /> <br /> 6 30 V©n Méng 50 7,08 23,6 VM7.2<br /> <br /> H.m l#îng dÞch chiÕt trung b×nh cña huyÖn V©n Méng 23,70<br /> <br /> 7 30 B¾c S¬n 50 7,12 23,7 BS7.1<br /> <br /> 8 30 B¾c S¬n 50 7,07 23,5 BS7.2<br /> <br /> H.m l#îng dÞch chiÕt trung b×nh cña huyÖn B¾c S¬n 23,60<br /> <br /> B#íc ®Çu nghiªn cøu ®Þnh l#îng s¬ bé h.m l#îng axit shikimic trong qu¶ håi thu h¸i v.o<br /> th¸ng 9 n¨m 2006 cña 4 huyÖn ë tØnh L¹ng S¬n, c¸c nghiªn cøu ®#îc lÆp l¹i 2 lÇn cho thÊy h.m<br /> l#îng dÞch chiÕt trung b×nh trong mÉu qu¶ håi ë huyÖn B×nh Gia cho kÕt qu¶ thÊp h¬n so víi mÉu<br /> cña c¸c huyÖn V¨n LRng, V©n Méng, B¾c S¬n, nh#ng h.m l#îng axit shikimic trong qu¶ håi l¹i cao<br /> nhÊt (8,17%) (xem b¶ng 4).<br /> <br /> B¶ng 4: KÕt qu¶ ®Þnh l#îng h.m l#îng axit shikimic trong c¸c dÞch chiÕt EtOH tõ qu¶ håi trång cña<br /> c¸c huyÖn B×nh Gia, V¨n LRng, V©n Méng, B¾c S¬n<br /> Axit shikimic<br /> Tªn DiÖn tÝch Axit shikimic trong Axit shikimic<br /> STT trong mÉu ®o,<br /> mÉu pic dÞch chiÕt, % trong mÉu th«, %<br /> mg/ml<br /> 1 BG7.1 3297,45 0,19375 38,750 8,18<br /> 2 BG7.2 3296,81 0,19371 38,742 8,16<br /> H.m l#îng shikimic trung b×nh trong mÉu th« B×nh Gia 8,17<br /> 3 VL7.1 2615,91 0,11537 23,075 5,59<br /> 4 VL7.2 2884,44 0,12721 25,443 5,97<br /> H.m l#îng shikimic trung b×nh trong mÉu th« V¨n LRng 5,78<br /> 5 VM7.1 2910,34 0,14923 29,846 7,10<br /> 6 VM7.2 2917,17 0,14958 29,916 7,06<br /> H.m l#îng shikimic trung b×nh trong mÉu th« V©n Méng 7,08<br /> 7 BS7.1 2943,68 0,15307 30,613 7,26<br /> 8 BS7.2 2947,02 0,15324 30,647 7,23<br /> H.m l#îng shikimic trung b×nh trong mÉu th« B¾c S¬n 7,24<br /> <br /> <br /> <br /> 203<br />  IV - KÕt luËn T i liÖu tham kh¶o<br /> <br /> Chóng t«i ®R ¸p dông ph#¬ng ph¸p LC-MS<br /> ®Ó ®Þnh l#îng axit shikimic tõ c¸c dÞch chiÕt cña 1. Eykman J. F., Recl., Tray. Chim. Pays-Bas,<br /> qu¶ håi ViÖt Nam nh»m t×m ra ph#¬ng ph¸p 1885, 5, 32.<br /> chiÕt xuÊt axit shikimic tèt nhÊt tõ qu¶ håi v. 2. C. U. Kim, W. Lew, M. A. Williams, H.<br /> kiÓm tra chÊt l#îng d#îc liÖu ®#îc thu h¸i v.o Wu, L. Zhang, X. Chen, P. A. Escarpe, D.<br /> th¸ng 09 n¨m 2006 cña mét sè vïng trång håi B. Mendel, W. G. Laver, R. C. Stevens. J.<br /> t¹i tØnh L¹ng S¬n. KÕt qu¶ cho thÊy: Med. Chem., 41, 451 (1998).<br /> Ph#¬ng ph¸p chiÕt soxhlex v. ®un khuÊy ë 3. J. C. Rohloff, K. M. Kent, M. J. Postich, M.<br /> 50oC víi dung m«i EtOH l. ph#¬ng ph¸p chiÕt W. Becker, H. H. Chapman, D. E. Kelly, W.<br /> axit shikimic tèt nhÊt, ph#¬ng ph¸p n.y cßn cã<br /> Lew, M. S. Louie, L. R. McGee, E. J.<br /> #u ®iÓm l. cã thÓ dÔ d.ng thu håi l¹i dung m«i<br /> Prisbe, L. M. Schultze, R. H. Yu, and L.<br /> ®Ó t¸i sö dông chóng.<br /> Zhang. J. Org. Chem., 63, 4545 (1998).<br /> MÉu qu¶ håi ë huyÖn B×nh Gia cho kÕt qu¶<br /> tèt h¬n ë 3 huyÖn V¨n LRng, V©n Méng v. B¾c 4. M. Federspiel, R. Ficher, M. Hennig, H.-J.<br /> S¬n víi h.m l#îng trung b×nh lÇn l#ît l. 8,17%, Mair, T. Oberhauser, G. Rimmler, T.<br /> 5,78%, 7,08% v. 7,24% axit shikimic so víi Albiez, J. Bruhin, H. Estermann. Org.<br /> mÉu th«. Process Res. and Development, 3, 266<br /> (1999).<br /> Lêi c¶m ¬n: C¸c t¸c gi¶ xin c¶m ¬n PGS. TS. 5. M. Karpf. Chimia, Vol. 58, 621 - 629<br /> LSu §&m CS ®T cung cÊp mÉu qu¶ håi v& ThS. (2004).<br /> Ng« V¨n Quang ®T gióp ®ì ®o LC-MS. C¸c kÕt<br /> qu¶ nghiªn cøu n&y thu ®Sîc trong khu«n khæ 6. §o.n ThÞ Mai H#¬ng, Ng« V¨n Quang,<br /> thùc hiÖn ®Ò t&i ®éc lËp cÊp nh& nSíc §T§L- NguyÔn ThÞ Hång H¹nh, NguyÔn V¨n<br /> 2006/01G. Hïng, NguyÔn QuyÕt ChiÕn. T¹p chÝ Khoa<br /> häc v. C«ng nghÖ, 45(1B), 42 - 46 (2007)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 204<br />