Xác định MIC và đột biến kháng Levofloxacin của Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng tại Tiền Giang

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

8
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Xác định MIC và đột biến kháng Levofloxacin của Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng tại Tiền Giang được nghiên cứu nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu và các dạng đột biến xuất hiện ở H. pylori trên bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng tại Tiền Giang. Đồng thời tìm hiểu về mối liên quan giữa nồng độ ức chế tối thiểu với các dạng đột biến GyrA kháng levofloxacin của H. pylori.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định MIC và đột biến kháng Levofloxacin của Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng tại Tiền Giang

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH MIC VÀ ĐỘT BIẾN KHÁNG LEVOFLOXACIN CỦA HELICOBACTER PYLORI Ở BỆNH NHÂN VIÊM LOÉT DẠ DÀY TÁ TRÀNG TẠI TIỀN GIANG Trần Thị Như Lê1,2,*, Trần Ngọc Ánh2, Nguyễn Vũ Trung2,3 1 Trường Đại Học Y Dược cần Thơ 2 Trường Đại học Y Hà Nội 3 Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh Tình trạng kháng kháng sinh ở Helicobacter pylori đang gia tăng và có thể dẫn đến thất bại điều trị. Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật Etest và kỹ thuật giải trình tự sanger nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu và các dạng đột biến xuất hiện ở Helicobacter pylori trên bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng tại Tiền Giang. Đồng thời tìm hiểu về mối liên quan giữa nồng độ ức chế tối thiểu với các dạng đột biến GyrA kháng levofloxacin của Helicobacter pylori. Kết quả nghiên cứu ghi nhận: Đột biến GyrA chiếm 60% trong tổng số 65 mẫu nghiên cứu. Trong đó 23,1% (9/39) mẫu nhạy với LEV có nồng độ ức chế tối thiểu của LEV ≤ 1 µg/ml ghi nhận được đột biến làm thay đổi nucleotid ở các vị trí codon P188L, R190Q, M191I, Y81C, P187S, D91T, D108E, R95K, G111A, S185Y. Và 30/39 (66,9%) mẫu có nồng độ ức chế tối thiểu > 1 µg/ml gặp ở các đột biến vị trí N87K, D91N/G, A55S, M191I, Y28F/I, V107F, A27L, V199G, S29F, M30L, G111L, R42K, V65S, A66L, S101L, M102A, N112I, R95G/K, D108V/E, A94G. Kết luận: Đột biến trên GyrA ở vị trí codon N87K, D91N/G/T, A55S của Helicobacter pylori liên quan đến việc tăng nồng độ MIC của levofloxacin. Chưa xác định được đột biến M191I, Y28F/I, V107F, A27L, V199G, S29F, M30L, G111L, R42K, V65S, A66L, S101L, M102A, N112I, R95G/K, D108V/E, A94G trên GyrA có liên quan đến tình trạng kháng LEV của Helicobacter pylori ở Tiền Giang, cần nghiên cứu thêm. Từ khóa: Nồng độ ức chế tối thiểu, GyrA, levofloxacin, Helicobacter pylori. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Helicobacter pylori (H. pylori ) là tác nhân với sự thành công của một phác đồ điều trị tiệt gây viêm loét dạ dày tá tràng chiếm khoảng trừ. Theo khuyến cáo của Maastricht V, phác hơn 50% dân số của thế giới.1 Ở Việt Nam, tỉ đồ bộ ba có levofloxacin là phác đồ thứ hai sau lệ nhiễm H. pylori là 75,2%, ở trẻ nhỏ thấp hơn khi thất bại với phác đồ đầu tay.4 Các nghiên người lớn, có thể gặp cả ở trẻ 1 - 2 tuổi và khác cứu gần đây ghi nhận tỉ lệ đột biến kháng nhau giữa các địa phương.2 Tiệt trừ H. pylori là levofloxacin ngày càng tăng như nghiên cứu một trong những mục tiêu hàng đầu trong điều của tác giả Trần Thiện Trung (2016, Việt Nam) trị các bệnh loét dạ dày - tá tràng, viêm dạ dày 54,8%, Tuan VP (2019, Campuchia) 65,4% type B, u lympho MALT và cũng là một chỉ định và đột biến trong GyrA và hoặc GyrB chiếm trong điều trị ung thư dạ dày.3 Tính nhạy cảm khoảng 83%.5,6 Đột biến GyrA thường nằm tại với kháng sinh của H. pylori rất quan trọng đối vị trí codon 86, 87, 88, và 91. Nghiên cứu mối liên quan giữa nồng độ ức chế tối thiểu với các Tác giả liên hệ: Trần Thị Như Lê dạng đột biến GyrA phần nào giúp bác sĩ giải Trường Đại học Y Hà Nội thích được cơ chế kháng LEV của H. pylori. Để Email: ttnle@ctump.edu.vn hiểu biết thêm mức độ kháng LEV, nhất là mức Ngày nhận: 25/10/2022 độ kháng liên quan đến GyrA chúng tôi thực Ngày được chấp nhận: 26/11/2022 hiện nghiên cứu: “Xác định MIC và đột biến TCNCYH 162 (1) - 2023 129
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC kháng levofloxacin của Helicobacter pylori ở Cỡ mẫu bệnh nhân viêm loét dạ dày - tá tràng tại Tiền Cỡ mẫu được lấy theo phương pháp cỡ Giang” nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu mẫu thuận tiện. và các dạng đột biến xuất hiện ở H. pylori trên Nghiên cứu thu được 65 mẫu H. pylori phân bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng tại Tiền lập từ niêm mạc dạ dày tá tràng của bệnh nhân Giang. Đồng thời tìm hiểu về mối liên quan giữa viêm loét dạ dày tá tràng bằng kỹ thuật giải trình nồng độ ức chế tối thiểu với các dạng đột biến tự trực tiếp. GyrA kháng levofloxacin của H. pylori. Bệnh nhân được lấy 3 mẫu niêm mạc ở rìa II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP các góc tổn thương loét, hang vị, thân vị hoặc trong trường hợp có viêm dạ dày tá tràng và 1. Đối tượng lấy 6 mẫu gồm 3 mẫu ở thân vị và 3 mẫu ở 65 bệnh nhân được chẩn đoán viêm loét dạ hang vị của các bệnh nhân được chẩn đoán dày - tá tràng do H. pylori đến khám và điều trị viêm loét dạ dày - tá tràng. Mẫu bệnh phẩm tại Bệnh Viện Đa Khoa Trung Tâm Tiền Giang, được cho vào môi trường nước muối sinh lý Đa Khoa Khu vực Cai Lậy, Đa Khoa Khu vực NaCl 0,9% vô trùng hoặc môi trường vận Gò Công từ tháng 1/2022 đến tháng 9/2022. chuyển Portagerm. Bệnh phẩm được chuyển Tiêu chuẩn chọn lựa đến phòng xét nghiệm vi sinh của Bệnh viện Bệnh nhân > 16 tuổi được chẩn đoán viêm Đa khoa Trung tâm Tiền Giang để thực hiện xét loét dạ dày-tá tràng dựa vào lâm sàng: đau nghiệm theo đúng quy trình. Bệnh phẩm được thượng vị, nóng rát, đầy bụng, ợ hơi và xác nghiền nát và cấy trên đĩa thạch pylori agar, ủ định tổn thương viêm loét dạ dày tá tràng qua bằng túi ủ Genbag (tỷ lệ O2: 5%, CO2: 10%, N2: nội soi dạ dày tá tràng. 85%, Biomeurieux, Pháp) theo quy trình ở nhiệt Chẩn đoán nhiễm H. pylori khi bệnh nhân có ít độ 37°C/48 - 72h. Xác định H.pylori khi nhuộm nhất hai xét nghiệm dương tính: CLO test dương Gram phát hiện trực khuẩn âm hình cung hoặc tính, nhuộm Gram mẫu mô sinh thiết niêm mạc cánh chim hải âu, chữ S, thử nghiệm urease hang vị hoặc thân vị phát hiện vi khuẩn Gram (+), oxidase (+), catalase (+). Vi khuẩn được âm ở dạng xoắn khuẩn cong, mảnh, dấu ngã, làm kháng sinh đồ bằng kỹ thuật Etest trên môi chữ S. Hoặc một xét nghiệm nuôi cấy định danh trường Muller hinton agar có 5% máu ngựa, túi vi khuẩn bằng phương pháp thông thường phát ủ Genbag (tỷ lệ O2: 5%, CO2: 10%, N2: 85%, hiện sự hiện diện của vi khuẩn H. pylori. Biomeurieux, Pháp) và kháng sinh của hãng Tiêu chuẩn loại trừ Biomeurieux, Pháp ở mật độ huyền dịch vi khuẩn 3 McFarland. Mẫu H. pylori đề kháng với Bệnh nhân dùng kháng sinh hoặc bismuth levofloxacin khi MIC > 1 μg/ml, nhạy ≤ 1 μg/ trong vòng 4 tuần; dùng thuốc kháng thụ thể ml.7 Những mẫu H. pylori sẽ được tiến hành H2 hoặc PPI trong vòng 2 tuần trước đó. Bệnh giải trình tự gen trực tiếp theo trình tự sau: (1) nhân có chống chỉ định nội soi thực quản - dạ Tách chiết DNA; (2) Chạy PCR theo quy trình dày - tá tràng. Bệnh nhân không đồng ý tham cài đặt giai đoạn biến tính tạm thời 950C trong gia nghiên cứu. 10 phút 1 chu kỳ, giai đoạn biến tính 950C trong 2. Phương pháp vòng 30 giây 35 chu kỳ, giai đoạn bắt cặp của Thiết kế nghiên cứu mồi 580C trong 45 giây 35 chu kỳ, giai đoạn kéo Mô tả cắt ngang. dài 720C trong 30 giây 35 chu kỳ và giai đoạn 130 TCNCYH 162 (1) - 2023
Nghiên cứu thu được 65 mẫu H. pylori phân lập từ niêm mạc dạ dày tá tràng của bệnh nhân viêm loét d dày tá tràng bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp. Bệnh nhân được lấy 3 mẫu niêm mạc ở rìa các góc tổn thương loét, hang vị, thân vị hoặc trong trường hợ có viêm dạ dày tá tràng và lấy 6 mẫu gồm 3 mẫu ở thân vị và 3 mẫu ở hang vị của các bệnh nhân được chẩ đoán viêm loét dạ dày - tá tràng. Mẫu bệnh phẩm được cho vào TẠP môiCHÍ trường NGHIÊNnướcCỨU muốiYsinh HỌClý NaCl 0,9% v trùng hoặc môi trường vận chuyển Portagerm. Bệnh phẩm được chuyển đến phòng xét nghiệm vi sinh củ kết Bệnh thúc 72 viện 0 Đa khoa C trong 5 phútTrung1 chutâmkỳ.TiềnVớiGiang GyrA để thực4. Đạo hiệnđứcxétnghiên nghiệmcứu theo đúng quy trình. Bệnh phẩm đượ nghiền nát và cấy trên đĩa thạch pylori agar, ủ bằng túi ủ Genbag (tỷ lệ O2: 5%, CO2: 10%, N2: 85%, Biomeurieux (DNA từ vị trí 121 - 588, dựa trên chủng chuẩn Đề H.pylori cương nghiên cứuGramđã được Hội trực đồngkhuẩn âm hìn Pháp) theo quy trình ở nhiệt độ 37°C/48 - 72h. Xác định khi nhuộm phát hiện 26695(CP003904) cung hoặc cánhtừ ngân chim hảihàng gen S, âu, chữ GenBank, thử nghiệm urease y đức (+), Đạioxidase học Y (+), Dược catalase Cần Thơ (+). Vi khuẩn thông quađược làm khán GyrAsinh đồ bằng forward kỹ thuật primer Etest trên (5’-AGC TTA môi TTCtrường CAT Muller và cho phép tiến hành theo quyết định số 11/ (tỷ lệ O2: 5% hinton agar có 5% máu ngựa, túi ủ Genbag CO 2: 10%, N2: 85%, Biomeurieux, Pháp) và kháng sinh của hãng Biomeurieux, Pháp ở mật độ huyền dịch v GAG CGT GA-3’), GyrA reverse primer (5’- khuẩn 3 McFarland. Mẫu H. pylori đề kháng với HĐĐĐ-PCT levofloxacin mã khi số MICđề>tài1 19.11a-ĐHYDCT μg/ml, nhạy ≤ 1 μg/ml. ngày 7 Những mẫ TCAH.GGC CCT TTG ACA AAT TC-3’). Và theo 15/2/2019. Các sinh phẩm sử dụng pylori sẽ được tiến hành giải trình tự gen trực tiếp theo trình tự sau: (1) Tách chiết DNA; (2) Chạy PCR the trong nghiên quy trình protocol (Takara cài đặt TaqgiaiDNA đoạn biến tínhHot polymerase thời 950Ccứu tạmStart trong đều10 phútdanh thuộc 1 chumụckỳ,ban giaihành đoạncủa biếnBộtính Y tế.950C trong vòn 30 giây 35 chu kỳ, giai đoạn 0,1μl, Taq DNA polymerase buffer 2,5μl, dNTP bắt cặp của mồi 58 0 C trong 45 giây 35 chu kỳ, giai đoạn kéo dài 720C trong 3 giây 35 chu kỳ và giai đoạn kết thúc 720C trong III. 5 phút 1 KẾT QUẢchu kỳ. Với GyrA (DNA từ vị trí 121 - 588, dựa trê 0,5μl, GyrAchuẩn chủng Reverse primer 0,5μl/GyrA 26695(CP003904) Forward từ ngân hàng gen GenBank, GyrA forward primer (5’-AGC TTA TTC CAT GAG primer CGT0,5μl, GA-3’), DNA GyrA mẫu 0,5μl,primer reverse H2O dùng(5’-TCA choGGC CCT1. NồngTTG độ ACAức AAT chếTC-3’). Và theo tối thiểu theoprotocol các dạng (Takara Taq DN polymerase Hot Start 0,1μl, PCR 20,4μl); (3) Tinh sạch DNA (ExoZAP PCR Taq DNA polymerase buffer 2,5μl, dNTP 0,5μl, GyrA đột biến GyrA của H. pylori trên bệnh nhân Reverse primer 0,5μl/Gyr Forward primer 0,5μl, DNA mẫu 0,5μl, H2O dùng cho PCR 20,4μl); (3) Tinh sạch DNA (ExoZAP PCR CleanU CleanUp kit); (4) Giải trình tự DNA bằng kỹ kit); (4) Giải trình tự DNA bằng kỹ thuật giải trình viêm tự trựcloéttiếpdạ dày trên hệtáthống tràngmáy ABI 3500 Genetic Analyzer; (5 thuật giải trình tự trực tiếp trên hệ thống Mỗi trình tự được so sánh với chủng tham chiếu H. pylori máy Trong 26695 thời gian (CP003904) trên ngânchúng từ 1/2022-9/2022 hàng tôiGenbank.8 3. Xử lý số liệu ABI 3500 Genetic Analyzer; (5) Mỗi trình tự giải trình tự 65 chủng H. pylori phân lập được từ Số liệu được nhập vào chương trình Excel và được phân tích bằng phần mềm SPSS 20,0 để xác định các t được so sánh với chủng tham chiếu H. pylori lệ phần trăm, kiểm định sự khác biệt bằng phépbệnh kiểm nhân chique.viêmCácloét độtdạ dàyđiểm biến tá tràng kháng nhiễm thuốcH.chúng tôi tham 26695 khảo (CP003904) cấu trúc gen trên của ngân chủnghàng H. Genbank. 8 pylori 26695 (CP003904) pylori. Độtrên tuổi ngân trunghàng Genbank. bình của nhóm Sau nghiênđó cứu chúng tôi sử dụn phần mềm 3. Xử lý số liệu MegaX để kiểm tra các đột biến điểm trên các chủng nghiên cứu. là 48 ± 15,96, nam 52,3%, nữ 47,7%. Trong đó, 4. Đạo đức nghiên cứu Số Đềliệucương được nhập nghiên vào cứu chương đã được trình HộiExcel đồng y đức 41,5% bệnh Đại học nhân có Y Dược Cầntiền Thơsửthông đã điều quatrịvà tiệt chotrừphép tiến hàn theo quyết định số 11/HĐĐĐ-PCT và được phân tích bằng phần mềm SPSS 20,0 mã số đề tài 19.11a-ĐHYDCT H. pylori và 58,5% bệnh nhân chưa từng điều trị sử dụng tron ngày 15/2/2019. Các sinh phẩm nghiên cứu đều thuộc danh mục ban hành của Bộ tiệtYtrừ tế. H. pylori. Tỉ lệ bệnh nhân kháng với LEV để xác định các tỷ lệ phần trăm, kiểm định sự III. KẾT QUẢ khác1.biệt Nồng bằngđộ ứcphépchếkiểm chique. tối thiểu theo Các cácđột biến dạng là GyrA đột biến 69,2%của (45/65) và đột H. pylori trênbiến nhânchiếm bệnhGyrA viêm loét60%dạ dày tá tràn điểm khángTrong thời gian thuốc chúng từ 1/2022-9/2022 tôi tham khảo cấu trúcchúng(39/65).tôi giải Trong trình tựnhóm65 chủng đột biến GyrA phân H. pylori có 76,9%lập được từ bện nhân viêm loét dạ dày gen của chủng H. pylori 26695 (CP003904) tá tràng nhiễm H. pylori. Độ tuổi trung bình của nhóm nghiên (30/39) kháng với LEV và có 23,1% (9/39) nhạy cứu là 48 ± 15,96, nam 52,3%, nữ 47,7%. Trong đó, 41,5% bệnh nhân có tiền sử đã điều trị tiệt trừ H. pylori và 58,5% bệnh nhân chư trêntừng ngânđiều hàng trị Genbank. tiệt trừ H. Sau đó Tỉ pylori. chúng tôi sử lệ bệnh với LEV. nhân kháng với Nồng LEV làđộ69,2%ức chế tối thiểu (45/65) và của đột LEV biến ≤GyrA 1 chiếm 60% dụng(39/65). phần Trong mềm MegaXnhóm đột đểbiến kiểmGyrA có 76,9% tra các µg/mlkháng đột (30/39) và > 1với µg/ml LEVcóvàcác có dạng 23,1%đột biếnnhạy (9/39) GyrAvới LEV. Nồn độ ức chế tối thiểu của biến điểm trên các chủng nghiên cứu. LEV ≤ 1 µg/ml và > 1 µg/ml có các dạng của H. pylori sau: đột biến GyrA của H. pylori sau: S185Y, M191I 0,75 D108E 0,5 D91T, M191I 0,5 R95K, G111A 0,5 P187S, M191I 0,25 M191I 0,12 Y81C 0,06 P188L, R190Q, M191I 0,03 Biểu đồ 1. Phân bố MIC (LEV) ≤1 µg/ml theo các dạng đột biến GyrA của H. pylori Biểu đồ 1. Phân bố MIC (LEV) ≤1 µg/ml theo các dạng đột biến GyrA của H. pylori TCNCYH 162 (1) - 2023 2 131
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 9/39 mẫu có nồng độ ức chế tối thiểu của R190Q + M191I; Y81C; M191I; P187S + M191I; 9/39 mẫu LEV ≤ 1 µg/ml có nồng có xuất hiện độ độtức chếGyrA biến tối thiểu làm của LEV D91T≤+ 1 M191I; µg/ml cóD108E; xuất hiện đột +biến R95K G111A; làm thay đổi GyrAS185Y nucleotid ở các vị trí codon P188L + R190Q + M191I; Y81C; M191I; P187S + M191I; D91T + M191I; D108E; thay đổi nucleotid ở các vị trí codon P188L + + M191I. R95K + G111A; S185Y + M191I. Phân bố MIC theo các dạng đột biến GyrA của H. pylori A55S, 32N87K, D91N,… N87K32 S29F, M30L, G111V A55S, N87K, D91N R42K, V65S, A66L,… 32 D108V, N87K, D91N,… R95G 32 N87K N112I D91N N87K A55S, N87K, D91N,… 16 D91N, N87K, A55S 16 222 1.50 A55S, N87K, D91N 22 N87K 16 44 A55S, N87K, D91N,… 16 8 444 A55S, N87K, D91N 88 44 A27L, Y28I, V199G 8 8 4444 N87K, D91N, A55S N87K, M191I D91G, M191I A55S, N87K, D91N N87K V107F, N87K M191I A55S, N87K, D91N Y28F, M191I N112I M191I N87K Biểu đồ 2. Phân bố MIC (LEV)>1µg/ml theo các dạng đột biến GyrA của H. pylori Biểu đồ 2. Phân bố MIC (LEV)>1µg/ml theo các dạng đột biến GyrA của H. pylori 30/3930/39 mẫumẫuđột đột biếnbiến kháng khánglevofloxacin levofloxacincủa + A55S của H.pylori ghivới nhậnMIC 16 17 được µg/ml dạng(1đột mẫu), biến 8trong µg/ml đó(2 đột biến đơn có: N87K 6 mẫu với giá trị MIC H.pylori ghi nhận được 17 dạng đột biến tronglần lượt là 32 µg/ml (2 mẫu), 4 µg/ml (3 mẫu), 2 µg/ml (1 mẫu), 4 µg/ml (3 mẫu), 2 µg/ml (1 mẫu); S29F mẫu), D91N với MIC 16 µg/ml, N112I với MIC 4 µg/ml (1 mẫu), 2 µg/ml (1 mẫu); R95G với MIC 2 µg/ml; M191 với MIC là 4 đóµg/ml đột (2 biến đơn mẫu). Độtcó: N87K biến kép: 6D91Gmẫu+ với M191Igiávới trịMIC 4+µg/ml M30L(1+ mẫu); G111VN87Kvới MIC 32 µg/ml + V107F (1 mẫu). với MIC Đột 8 µg/ml (1 mẫu); N87K + M191I với MIC 8 µg/ml (1 mẫu); MIC lần lượt là 32 µg/ml (2 mẫu), 4 µg/ml (3 Y28F + M191Ibiến bộ tứ gồm N87K + D91N + A55S + V94GN87K + với MIC 4 µg/ml (1 mẫu). Đột biến bộ ba gồm D91N + A55S với MIC 16 µg/ml (1 mẫu), 8 µg/ml (2 mẫu), 4 µg/ml (3 mẫu), 2 µg/ml (1 mẫu); S29F + M30L + mẫu), 2 µg/ml (1 mẫu), D91N với MIC 16 µg/ với MIC 16 µg/ml (1 mẫu); N87K + D91N + G111V với MIC 32 µg/ml (1 mẫu). Đột biến bộ tứ gồm N87K + D91N + A55S + V94G với MIC 16 µg/ml (1 mẫu); ml, N112I N87K với MIC + D91N 4 µg/ml + A55S (1 mẫu), + A92V với MIC 2 µg/ml 16 µg/ml(1 (1 mẫu); A55S + A92V N87K với MIC + D91N 16 +µg/ml + A55S D108V (1 với mẫu);MICN87K 32 µg/ml (1 mẫu). Đột biến bộ năm gồm N87K mẫu); R95G với MIC 2 µg/ml; M191 với MIC là + D91N + A55S + D91N + A55S + D108V với MIC 32 µg/ml (1S101L, + V94G với MIC 1,5 µg/ml; R42K, V65S, A66L, M102A với MIC là 2 µg/ml. 4 2. µg/ml Mối (2 liênmẫu). quanĐộtgiữabiến nồngkép: độD91G ức chế+ tối M191I thiểu vớimẫu). ĐộtGyrA đột biến biến của bộ năm gồm N87K + D91N + H. pylori với MICBảng1. 4 µg/mlMối(1liên mẫu); quanN87K + V107F giữa nồng độ ứcvới A55Scủa chế tối thiểu + V94G LEV với vớicác MIC 1,5đột dạng µg/ml; biến R42K, GyrA củaV65S, H. pylori Đột biến GyrA MIC 8 µg/ml (1 mẫu); N87K + M191I với MIC MIC (LEV) 95%CI A66L, S101L, M102A với MIC là 2 µg/ml. p ≤ 1µg/ml > 1µg/ml 8 µg/ml (1 mẫu); Y28F Có + M191I với MIC04(0%) µg/ 2. Mối liên quan giữa nồng độ ức chế tối 19 (100%) N87K ml (1 mẫu). Đột biến bộ ba gồm N87K + D91N thiểu với đột biến GyrA của 1,37H.- 2,28 pylori < 0,05 Không 20 (43,5%) 26 (56,5%) Có Bảng1. Mối liên quan 1giữa (7,1%)nồng độ ức13 chế tối thiểu của LEV (92,9%) D91N/G/T với các dạng đột biến GyrA của H. pylori 0,01 - 1,07 < 0,05 Không 19 (37,3%) 32 (62,7%) Đột biếnCó GyrA MIC (LEV) 95%CI p 0 (0%) 11(100%) A55S ≤ 1µg/ml > 1µg/ml 1,29 - 1,94 < 0,05 Không Có 20 (37%) 0 (0%) 34 (63%) 19 (100%) N87K Có 1,37 - 2,28 < 0,05 Không 6 20 (43,5%) (54,5%) 265(56,5%) (45,5%) M191I 0,90 - 13,01 > 0,05 Không 14 (25,9%) 40 (74,1%) 132N87K + Có TCNCYH 162 (1) - 2023 0 (0%) 11 (100%) 1,29 - 1,94 < 0,05 D91N/G/T
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Có 1 (7,1%) 13 (92,9%) D91N/G/T 0,01 - 1,07 < 0,05 Không 19 (37,3%) 32 (62,7%) Có 0 (0%) 11(100%) A55S 1,29 - 1,94 < 0,05 Không 20 (37%) 34 (63%) Có 6 (54,5%) 5 (45,5%) M191I 0,90 - 13,01 > 0,05 Không 14 (25,9%) 40 (74,1%) Có 0 (0%) 11 (100%) N87K + D91N/G/T 1,29 - 1,94 < 0,05 Không 20 (37%) 34 (63%) Có 0 (0%) 11 (100%) N87K + D91N/G/T+A55s 1,29 - 1,94 < 0,05 Không 20 (37%) 34 (63%) Có 1 (50%) 1 (50%) A94G 0,13 - 38,99 > 0,05 Không 19 (30,2%) 44 (69,8%) Có 1 (33,3%) 2 (66,7%) D108V/E 0,09 - 13,25 > 0,05 Không 19 (30,6%) 43 (69,4%) Có 1 (50%) 1 (50%) R95G/K 0,13 - 38,99 > 0,05 Không 19 (30,2%) 44 (69,8%) Có 1 (50%) 1 (50%) N112I 0,13 - 38,99 > 0,05 Không 19 (30,2%) 44 (69,8%) R42K+ V65S+A66L, Có 0 (0%) 1 (100%) 1,23 - 1,71 > 0,05 S101L+ M102A Không 20 (31,3%) 44 (68,8%) Có 0 (0%) 1 (100%) S29F+M30L+G111V 1,23 - 1,71 > 0,05 Không 20 (31,3%) 44 (68,8%) Có 0 (0%) 1 (100%) A27L, Y28I, V199G 1,23 - 1,71 > 0,05 Không 20 (31,3%) 44 (68,8%) Có 0 (0%) 1 (100%) V107F 1,23 - 1,71 > 0,05 Không 20 (31,3%) 44 (68,8%) Có 1 (100%) 0 (100%) Y28F 2,31 - 4,9 > 0,05 Không 19 (29,7%) 45 (70,3%) Bệnh nhân viêm loét dạ dà-tá tràng do H. và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < pylori có đột biến GyrA ở các vị trí codon N87K, 0,05). Còn các đột biến ở vị trí codon M191I, D91N/G/T, A55S riêng lẻ hoặc phối hợp đều có Y28F/I, V107F, A27L, V199G, S29F, M30L, nồng độ ức chế tối thiểu của LEV > 1 µg/ml G111L, R42K, V65S, A66L, S101L, M102A, TCNCYH 162 (1) - 2023 133
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC N112I, R95G/K, D108V/E, A94G thì khác biệt Kết quả này cũng giống với nghiên cứu của tác không có ý nghĩa thống kê giữa nhóm nồng độ giả Maria Teresa Mascellino (2020) ở Ý, nồng ức chế tối thiểu > 1µg/ml với nhóm có nồng độ độ ức chế tối thiểu dao động 4 - 32 µg/ml khi ức chế tối thiểu ≤ 1 µg/ml (p > 0,05). có đột biến N87K và 1 - 4 µg/ml với đột biến D91G.12 Ngoài vị trí codon đột biến, chúng ta IV. BÀN LUẬN cũng nên theo sát sự thay đổi nucleotid ở từng Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận đối với vị trí codon. Vì có những codon đã được xác bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng do H. pylori nhận có liên quan đến kháng LEV của H. pylori mà có nồng độ ức chế tối thiểu LEV ≤ 1 µg/ml như vị trí codon 87, 91 vẫn có thể xuất hiện ở thì vẫn xuất hiện đột biến thay đổi nucleotid ở những bệnh nhân nhạy cảm với LEV như kết một số vị trí codon như sau: P188L, R190Q, quả nghiên cứu của You-hua Wang (2020) tại M191I, Y81C, P187S, D91T, D108E, R95K, Trung Quốc ghi nhận đột biến N87N + D91G G111A, S185Y. Các đột biến này xuất hiện riêng xuất hiện ở mẫu có nồng độ ức chế tối thiểu lẻ hoặc phối hợp nhiều đột biến trên cùng một của LEV 0,5 µg/ml.13 Và đột biến ở một số vị chủng vi khuẩn. Điều này khác xa so với nghiên trí codon chưa được xác nhận rõ có liên quan cứu của Chong-Hou Lok (2020) tại Trung Quốc đến kháng LEV ở H. pylori hay không vì chúng là không ghi nhận được đột biến GyrA ở nhóm vẫn xuất hiện ở cả nhóm có nồng độ ức chế tối bệnh nhân viêm loét dạ dà tá tràng có nồng độ thiểu ≤ 1 µg/ml và > 1 µg/ml như đột biến trong ức chế tối thiểu của LEV ≤1 µg/ml.9 Đến nghiên nghiên cứu của Nastaran Farzi (2019) Tehran cứu của Margarita Camorlinga-Ponce (2020) M191I, V199A, G208E, V150A, D143E, I212S, tại Mexico thì tìm thấy được một đột biến ở E214K, D86N, D86G, A183V, A207T, S63P, vị trí codon T62I.10 Tương tự, thì nghiên cứu A97V, xuất hiện ở nhóm có nồng độ ức chế tối của Tal Domanovich-Asor (2021) ở Israel phát thiểu ≤ 1 µg/ml. Đột biến D86N, R140K, M191I, hiện được ba đột biến ở codon A97V, A88V, G208E, V199A, D86G, M191I, V199A, G208E V199A.11 Như vậy, một số đột biến GyrA không cũng xuất hiện ở nhóm có nồng độ ức chế tối liên quan đến kháng LEV của H.pylori. Cho thiểu của LEV > 1 µg/ml.14 nên chúng ta cần hiểu rõ ý nghĩa của từng vị trí Tóm lại, không phải tất cả các trường hợp đột biến để giải thích đầy đủ nguyên nhân gây đột biến trên GyrA đều liên quan đến kháng kháng kháng sinh LEV của vi khuẩn H. pylori. LEV mà chỉ một số đột biến trọng điểm. Một Có những đột biến không làm gia tăng tình số đột biến làm giảm nồng độ ức chế tối thiểu trạng kháng LEV của H. pylori mà còn làm giảm khi cùng xuất hiện với các đột biến điểm có liên nồng độc ức chế tối thiểu khi xuất hiện cùng quan đến kháng LEV của H. pylori đã được xác với các đột biến khác có liên quan đến kháng nhận. Nhưng cũng có những vị trí codon đã LEV giống như nghiên cứu của Vo Phuoc Tuan xác nhận có liên quan đến kháng thuốc nhưng (2019) ở Campuchia ghi nhận đột biến phối sự thay đổi nucleotid cũng giữ vị trí quan trọng hợp giữa N87K + D91G thì làm cho nồng độ ức trong việc thay đổi nồng độ ức chế tối thiểu. chế tối thiểu dao động trong khoảng 0,125 - 4 Đây là một chỉ số quan trong hỗ trợ cho bác sĩ µg/ml.6 Còn đột biến đơn ở vị trí codon D91G lâm sàng trong việc quyết định liều điều trị cho thì nồng độ ức chế tối thiểu dao động 2 - 8 µg/ từng bệnh nhân cụ thể nên chúng ta cần tìm ml, đột biến D91N thì nồng độ ức chế tối thiểu hiểu sâu hơn về mối liên quan giữa nồng độ ức dao động 2 - 4 µg/ml, đột biến N87K thì nồng chế tối thiểu của LEV ở từng vị trí đột biến cũng độ ức chế tối thiểu do động từ 2 - 32 µg/ml. như sự thay đổi nucleotid ở tựng vị trí đó. 134 TCNCYH 162 (1) - 2023
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Đột biến GyrA trong vùng kháng quinilon V. KẾT LUẬN (QRDR) đã được xác nhận có liên quan đến Đột biến trên GyrA ở vị trí codon N87K, kháng LEV của H. pylori. Điều thú vị là trong D91N/G/T, A55S của H. pylori làm gia tăng nghiên cứu của chúng tôi, việc giải trình tự gen nồng độ ức chế tối thiểu của levofloxacin. Chưa GyrA cho thấy đột biến A55S cũng liên quan xác định được đột biến M191I, Y28F/I, V107F, đến kháng LEV khi nồng độ ức chế tối thiểu A27L, V199G, S29F, M30L, G111L, R42K, > 1 µg/ml (p < 0,05). Đột biến này đã được so V65S, A66L, S101L, M102A, N112I, R95G/K, sánh với chủng tham chiếu H. pylori 26695 D108V/E, A94G trên GyrA có liên quan đến tình có trong cơ sở dữ liệu của GenBank và giống trạng kháng LEV của H. pylori ở Tiền Giang, với kết quả nghiên cứu của tác giả Arslan và cần nghiên cứu thêm. cộng sự.15 Ngoài ra nghiên cứu của chúng tôi cũng đã ghi nhận thêm được một số đột biến Lời cảm ơn điểm ở các vị trí khác nằm ở nhóm có nồng Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn độ ức chế tối thiểu > 1 µg/ml bao gồm M191I, Ban Giám Đốc, quý đồng nghiệp tại Bệnh viện Y28F/I, V107F, A27L, V199G, S29F, M30L, Đa Khoa Trung Tâm Tiền Giang, Đa khoa Khu G111L, R42K, V65S, A66L, S101L, M102A, vực Cai Lậy, Đa Khoa khu vực thị xã Gò Công N112I, R95G/K, D108V/E, A94G. Tuy nhiên các đã hỗ trợ. đột biến này chưa chứng minh được tình trạng kháng LEV của H. pylori vì sự khác biệt chưa TÀI LIỆU THAM KHẢO có ý nghĩa thống kê ở nhóm nồng độ ức chế tối 1. Tonolini M, Ierardi AM, Bracchi E, thiểu > 1 µg/ml với nhóm có nồng độ ức chế Magistrelli P, Vella A, Carrafiello GJIii. Non- tối thiểu ≤ 1 µg/ml (p > 0,05). Tương tự, như perforated peptic ulcer disease: multidetector nghiên cứu của tác giả Evariste Tshibangu- CT findings, complications, and differential Kabamba (2020) cũng phát hiện thêm đột biến diagnosis. 2017; 8(5): 455-469. điểm mới liên quan đến kháng LVX bao gồm 2. Hương VTT, Chính VQ, Châu NTH, Cư A92T (10,4%), R130K (11,9%), nghiên cứu của LVJTcKhvCnTl. Kết quả nghiên cứu thực trạng Yan Zhou (2022) đã ghi nhận thêm đột biến tại và các giải pháp quản lý môi trường trong chăn vị trí codon A88V, T239M, V172I là những đột nuôi hộ gia đình và trang trại nhỏ ở một số tỉnh biến chưa ghi nhận trước đây.16,17 Nghiên cứu Miền Bắc. 2013; 8. của Ying Li (2022) cho thấy rằng đột biến GyrA không chỉ ở vị trí codon 87, 91, 86, 88 mà còn ở 3. Hoàng Trọng Thảng, Hoàng Thị Tú Anh. nhiều vị trí khác như H57Y, S63P, V65I, V77A, Đánh giá hiệu quả của phác đồ Rabeprazole- S83A, A129T, R103H, D155N, D161N, P188S, Levofloxacin- Tinidazole trên bệnh nhân viêm V741I.17 Và cũng có nghiên cứu Nastaran Farzi dạ dày mạn nhiễm Helicobacter pylori. Tạp (2019) không phát hiện được đột biến điểm nào chí Khoa học tiêu hóa Việt Nam. 2015; IX(41): kháng LVX trên codon thứ 87 và 91 mà lại phát tr.115-120. hiện được đột biến liên quan đến codon 86, 191, 4. Miftahussurur M, Yamaoka YJM. 199, 208, 140 ở người dân vùng Tehran.14 Như Appropriate first-line regimens to combat vậy, câu hỏi đặt ra là chủng tộc có liên quan gì Helicobacter pylori antibiotic resistance: an đến vị trí đột biến kháng LVX của H. pylori gây Asian perspective. 2015; 20(4): 6068-6092. kháng thuốc hay không thì cần tìm hiểu thêm. 5. Trần Thiện Trung, Trần Anh Minh, Nguyễn TCNCYH 162 (1) - 2023 135
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Tuấn Anh. Nghiên cứu tỷ lệ đột biến kháng Helicobacter pylori. 2020; 9(1): 2. thuốc clarithromycin và levofloxacin của H. 12. Mascellino MT, Oliva A, Miele MC, De Pylori bằng giải trình tự gen. Tạp chí khoa học Angelis M, Bruno G, Severi CJA. Secondary tiêu hóa Việt Nam. 2017; IX(49): 3074-3082. antibiotic resistance, correlation between 6. Tuan VP, Narith D, Tshibangu-Kabamba genotypic and phenotypic methods and E, et al. A next-generation sequencing-based treatment in Helicobacter pylori infected approach to identify genetic determinants of patients: A retrospective study. 2020; 9(9): 549. antibiotic resistance in Cambodian Helicobacter 13. Wang Y-h, Gong X-l, Liu D-w, et pylori clinical isolates. 2019; 8(6): 858. al. Characteristics of Helicobacter pylori 7. Alarcon T, Urruzuno P, Martinez MJ, et heteroresistance in gastric biopsies and its al. Antimicrobial susceptibility of 6 antimicrobial clinical relevance. 2022: 1409. agents in Helicobacter pylori clinical isolates 14. Farzi N, Yadegar A, Sadeghi A, et al. High by using EUCAST breakpoints compared with prevalence of antibiotic resistance in Iranian previously used breakpoints. Enfermedades Helicobacter pylori isolates: importance of infecciosas y microbiologia clinica. May 2017; functional and mutational analysis of resistance 35(5): 278-282. doi: 10.1016/j.eimc.2016.02.010. genes and virulence genotyping. 2019; 8(11): 8. Bińkowska A, Biernat MM, Łaczmański 2004. Ł, Gościniak GJFim. Molecular patterns of 15. Arslan N, Yılmaz Ö, Demiray-Gürbüz resistance among Helicobacter pylori strains in EJWJoG. Importance of antimicrobial south-western Poland. 2018; 9: 3154. susceptibility testing for the management of 9. Lok C-H, Zhu D, Wang J, et al. Phenotype eradication in Helicobacter pylori infection. and Molecular Detection of Clarithromycin and 2017; 23(16): 2854. Levofloxacin Resistance in Helicobacter pylori 16. Tshibangu-Kabamba E, Ngoma-Kisoko Clinical Isolates in Beijing. 2020; 13: 2145. PdJ, Tuan VP, et al. Next-generation sequencing 10. Camorlinga-Ponce M, Gómez-Delgado of the whole bacterial genome for tracking A, Aguilar-Zamora E, et al. Phenotypic and molecular insight into the broad-spectrum genotypic antibiotic resistance patterns in antimicrobial resistance of Helicobacter pylori Helicobacter pylori strains from ethnically clinical isolates from the Democratic Republic diverse population in Mexico. 2021; 10: 539115. of Congo. 2020; 8(6): 887. 11. Domanovich-Asor T, Motro Y, Khalfin 17. Zhou Y, Zhong Z, Hu S, et al. A Survey B, Craddock HA, Peretz A, Moran-Gilad JJM. of Helicobacter pylori Antibiotic-Resistant Genomic analysis of antimicrobial resistance Genotypes and Strain Lineages by Whole- genotype-to-phenotype agreement in Genome Sequencing in China. 2022: e02188-21. 136 TCNCYH 162 (1) - 2023
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary DETERMINATION OF MIC AND LEVOFLOXACIN RESISTANCE MUTATION OF HELICOBACTER PYLORI IN PATIENTS WITH GASTRITIS AND PEPTIC ULCER DISEASE IN TIEN GIANG Antibiotic resistance in Helicobacter pylori is increasingly more common and can lead to treatment failure. This study used the Etest and Sanger sequencing techniques to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and mutant forms of Helicobacter pylori in patients with gastritis and peptic ulcer disease in Tien Giang province, Vietnam. The relationship between the MIC and levofloxacin-resistant mutant forms of H. pylori was also explored. Results showed that GyrA mutations accounted for 60% of the total 65 samples studied. Among these mutations, 23.1% (9/39) of LEV-sensitive samples with a MIC of LEV ≤ 1 µg/ml had mutations at codon positions P188L, R190Q, M191I, Y81C, P187S, D91T, D108E, R95K, G111A, and S185Y; and 30/39 (66.9%) samples with MIC > 1 µg/ml were found to have mutations at positions N87K, D91N/G, A55S, M191I, Y28F/I, V107F, A27L, V199G, S29F, M30L, G111L, R42K, V65S, A66L, S101L, M102A, N112I, R95G/K, D108V/E, and A94G. This study suggested that mutations in GyrA at codon positions N87K, D91N/ G/T, and A55S of H. pylori were associated with increased MIC concentration of levofloxacin. The related mutations M191I, Y28F/I, V107F, A27L, V199G, S29F, M30L, G111L, R42K, V65S, A66L, S101L, M102A, N112I, R95G/K, D108V/E, and A94G on GyrA were not identified. Further research on the LEV resistance of H. pylori in Tien Giang is needed. Keywords: Helicobacter pylori, levofloxacin, GyrA. TCNCYH 162 (1) - 2023 137