Xác định, thiết kế mồi nhận biết Candidate gen kháng rầy nâu BPH14 ở một số giống lúa địa phương của Việt Nam và ứng dụng trong lai tạo giống

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

8
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Xác định, thiết kế mồi nhận biết Candidate gen kháng rầy nâu BPH14 ở một số giống lúa địa phương của Việt Nam và ứng dụng trong lai tạo giống trình bày kết quả tầm soát, phân tích thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence) và thành phần amino acid của các candidate gen Bph14; Thiết kế mồi nhận dạng candidate gen Bph14 kháng rầy nâu; Kết quả bước đầu nghiên cứu khả năng kháng rầy của các candidate gen Bph14.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định, thiết kế mồi nhận biết Candidate gen kháng rầy nâu BPH14 ở một số giống lúa địa phương của Việt Nam và ứng dụng trong lai tạo giống

Tạp chí Khoa học và ng nghệ ng nghiệp Việt Nam Số 7(60)/2015 Khuất Hữu Trung1, Nguyễn Thị Phương Đoài1, Nguyễn Trường Khoa 1, Lương Ngọc Hà1, Nguyễn Thị Thùy Liên1, Nguyễn Thúy Điệp1, Đặng Thị Thanh Hà1, Trần Đăng Khánh1 Primer design to determine candidate gene (Bph14) conferring resistance to brown planthopper in Vietnamese local rice varieties and applying for breeding Abstract The brown planthopper (BPH) is one of the major insect pests of many rice growing areas in Vietnam. Based on the sequence data of 36 native rice varieties, a marker namely Bph14add27 was designed to determine candidate gene Bph14 conferring planthopper resistance. The Bph14add27 primer pair was used to amplify the estimate 176bp DNA fragment which was similar with the published resistant rice varieties and 149 bp in others. Based on screening Bph14 resistant candidate gene, two native resistant rice varieties Lua ngoi and OM5629 were used as the donor plants to transfer the resistant gene to commercial rice varieties Bac thom 7 and BC15, respectively. The crossed progenies of backcross generations were tested to determine the presence of Bph14 candidate gene, of which 21 individual plants of BC2F1 population of Lua ngoi ´ Bac thom 7 and 15 plants of BC2F1 population of OM5629 ´ BC15 carrying resistant gene were shown in heterozygote. These lines are ongoing to be used for further investigations. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Key words: Marker design, Bph14, native rice variety, brown planthopper. Rầy nâu hưởng đến hệ sinh thái, sức khỏe của con người. Delphacidae) là một trong những đối tượng dịch hại Sử dụng giống kháng là biện pháp chủ động tích lúa nguy hiểm nhất hiện nay ở hầu hết các vùng cực, có hiệu quả phòng trừ cao và không gây ô trồng lúa ở Việt Nam. Rầy nâu ký chủ trên nhiều nhiễm môi trường. Việc nghiên cứu di truyền tính loại cây như lúa, ngô, lúa mì, kê, cỏ lồng vực, cỏ kháng rầy nâu đã được các nhà khoa học nghiên tranh, cỏ gấu, cỏ bông . Rầy non và rầy trưởng cứu từ rất sớm, tính bền vững về khả năng kháng thành đều chích hút nhựa trên thân cây lúa tạo ra rầy nâu của các giống lúa đang được quan tâm các vết màu nâu đậm, làm cây lúa bị khô héo và nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới chết, nếu gây hại nặng trên diện rộng thì gây ra hiện chọn tạo giống đã xác nhận rằng các giống mang tượng cháy rầy. Ngoài ra, rầy nâu còn tạo vết đa gen kháng và các gen thứ yếu có tính bền vững thương cơ giới cho nấm bệnh xâm nhập làm cho cao hơn các giống chỉ có đơn gen chính (Gallagher cây lúa bị thối nhũn, đổ rạp, bông lúa bị lép một Kết quả nghiên cứu cho thấy những phần hoặc toàn bộ, do đó làm sản lượng lúa bị giảm giống lúa thuộc loài phụ có khả năng kháng rõ rệt. Rầy nâu còn là tác nhân chính truyền các rầy nâu tốt hơn và cho tới nay đã có 29 bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá gây nguy hại cho lúa gen kháng rầy nâu chính được xác định từ giống (Phạm Văn Lầm, 2000). và từ 40 loài lúa hoang dại (Yamazaki và cs, 2010). Trong đó, gen kháng rầy nâu Hiện nay, sử dụng thuốc hóa học và chọn tạo đã được các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện giống kháng là hai biện pháp chủ yếu phòng trừ và lập bản đồ uyền tính trạng số lượng (QTL) rầy nâu ở Việt Nam. Việc dùng nhiều thuốc trừ sâu năm 2001 ( ). Đến năm hóa học đã ảnh hưởng đến thiên địch của rầy nâu, đã được lập bản đồ vật lí có cấu trúc 4 exon Viện Di truyền Nông nghiệp hình thành các chủng rầy nâu kháng thuốc, ảnh và 5 intron, định vị trên cánh dài của nhiễm sắc thể
Tạp chí Khoa học và ông nghệ ông nghiệp Việt Nam Số 7(60)/2015 số 3 mã hóa protein với những domain CC, NB, II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NBS và LRR. Kết quả khai thác 1. Vật liệu nghiên cứu đã tạo ra các dòng giống lúa cao sản chất lượng kháng được rầy nâu ( Cơ sở dữ liệu trình tự genom của 36 giống lúa địa phương của Việt Nam đã được giải mã (Bả Bảng 1. Danh sách 36 giống lúa địa phương đã giải mã TT Tên giống TT Tên giống TT Tên giống 1 Tám xoan Bắc Ninh 13 Nếp lùn 25 Nàng quớt biển 2 Tám xoan Hải Hậu 14 Khấu mặc buộc 26 Tép Thái Bình 3 Tẻ Nương 15 OM6377 27 Khấu điển lư 4 Nàng thơm chợ đào 16 Chấn thơm 28 Nếp mèo nương 5 Thơm Lài 17 Xương gà 29 Tốc lùn 6 Nếp mặn 18 Khấu giáng 30 Hom râu 7 Chiêm đỏ 19 Coi ba đất 31 Nếp ông táo 8 Lúa Ngoi 20 OM5629 32 OM3536 9 Một bụi đỏ 21 Nếp bồ hóng Hải Dương 33 Khẩu Liến 10 Nàng cờ đỏ 2 22 Tan ngần 34 Lúa gốc đỏ 11 Ble te lo 23 Ba cho K’te 35 Chiêm đá 12 Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 24 Blào sinh sái 36 IS1.2 Các giống lúa trong tập đoàn được xác định là mồi đặc hiệu được thiết kế bằng phần mềm được sử dụng làm vật liệu và phần mềm xây dựng cây phả hệ MEGA6.0 Hai giống lúa thương mại được sử dụng làm cho hệ điều hành Windows giống nền nhận gen: Bắc thơm số 7 và BC15. 2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng Bố trí thí nghiệm đồng ruộng theo phương pháp Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu dựa trên trình tự genom của Nguyễn Thị Lan (2005). Cấy một dảnh với mật độ 40 45 dảnh Trình tự các nucleotide được so sánh và phân tích sử dụng phần mềm Phương pháp lai giống Cặp được thực hiện theo sơ đồ sau: Giống nền nhận gen kháng (Mẹ) Giống bản địa (Bố) (Bắc thơm số 7, BC15) X1 (Lúa ngoi, OM5629) Vụ Xuân 2014 F1 X Bắc thơm số 7; BC15 Vụ Mùa 2014 BC1F1 X1 Bắc thơm số 7; BC15 MAS Vụ Xuân 2015 X Bắc thơm số 7; BC15 BC2F1 MAS Vụ Mùa 2015 BC3F1 Hình 1. Sơ đồ lai tạo giống mang candidate gen kháng Bph14
Tạp chí Khoa học và ng nghệ ng nghiệp Việt Nam Số 7(60)/2015 + Chuẩn bị cây mẹ: Chọn cây tốt đeo thẻ ghi Phương pháp xử lý số liệu tên, chọn 2 3 bông/tổ hợp lai. Chọn bông đã thoát Số liệu thu thập được phân tích và xử lí thống khỏi bẹ 50 Loại bỏ những hoa trên (chóp kê bằng các phần mềm chuyên dụng trên nền bông) và hoa dưới (gần cổ bông); chỉ giữ lại 15 các phần mềm tin sinh học ( hoa có chiều cao bao phấn ở khoảng 1/2 2/3 vỏ III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN trấu. Cắt xiên vỏ trấu, bỏ từ 1/3 2/3 vỏ trấu để lộ ra những túi phấn. Loại bỏ cả 6 túi phấn. Sau khi khử đực, bao cách ly bông lúa bằng giấy bóng mờ. 1. Kết quả tầm soát, phân tích thành phần + Chọn cây bố: Chọn bông từ những cây đại nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence) diện, có nhiều hoa sẽ nở, vài hoa ở chóp bông đã và thành phần amino acid của các candidate tung phấn. gen Bph14 + Thụ phấn: Khi túi phấn vươn ra khỏi vỏ trấu Locus gen kháng rầy nâu đã được của cây bố (khi hoa nở) tiến hành thụ phấn ngay. khoa học xây dựng mô hình gen với mã hiệu là Bao bông cây mẹ lại sau khi thụ phấn, gấp kín miệng bao. + Thu hoạch hạt lai: Khi hạt mất màu xanh (hạt với chín), thường 25 ngày sau khi thụ phấn. Kết quả tầm - Phương pháp kiểm tra candidate gen kháng soát trình tự vùng CDS (Coding DNA Sequence) và Bph14 ở các thế hệ con lai thành phần amino acid của các candidate gen + Mẫu lá của từng con lai được thu thập và tách và so sánh với locus gen kháng gen kháng rầy nâu chiết ADN tổng số theo phươn ủ LOC_Os03g63150 đã công bố đã thu nhận 7 giống ả ế nucleotide vùng CDS tương đồng với + Phản ứng PCR được tiến hành trên máy rầy nâu LOC_Os03g63150. Trong đó, 3 giống (Lúa Veriti 96 well Thermal cycler. Tổng thể tích phản ngoi, Tẻ nương và OM5629) có số lượng nucleotide ứng là 15 µl, bao gồm: 5 l ADN; 0,15µM mồi; 0,2 và số lượng amino acid đúng bằng với số lượng và số lượng amino acid của gen kháng 0,25 đơn vị Taq polymerase rầy nâu LOC_Os03g63150 đã công bố. Đặc biệt, Sản phẩm PCR được điện di trên gel giống Lúa ngoi có số lượng và thành phần polyacrylamide 6,0% và được phát hiện dưới tia cực số lượng và thành phần tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide giống hệt gen kháng rầy nâu LOC_Os03g63150 đã công bố (Bảng 2 và 3). Bảng 2. Thống kê nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence gen/candidate gen Bph14 TT Gen/candidate gen Bph14 T(U) (%) C (%) A (%) G (%) Tổng 1 LOC Os03g63150.1 (BPH14) 25,7 21,6 28,9 23,8 3981 2 IS1.2 25,3 21,1 29,5 24,0 3954 3 Tốc lùn 25,6 20,8 29,5 24,1 3948 4 Chiêm đỏ 25,6 20,9 29,4 24,1 3948 5 Nếp mặn 25,4 21,0 29,6 24,1 3954 6 Lúaa ngoi 25,7 21,6 28,9 23,8 3981 7 Tẻ Nương 25,6 21,6 29,1 23,7 3981 8 OM5629 25,6 21,6 29,1 23,7 3981 Bảng 3. Thống kê thành phần amino acid của gen/candidate gen Bph14
Tạp chí Khoa học và ông nghệ ông nghiệp Việt Nam Số 7(60)/2015 Gen Bph14/giống LOC Tốc Chiêm Nếp Lúa Tẻ OM Os03g IS1.2 lùn đỏ mặn ngoi Nương 5629 Amino acid 63150.1 (BPH14) Ala 5,89 5,64 5,89 5,81 5,64 5,89 5,81 5,81 Cys 3,17 2,90 3,06 3,13 2,90 3,17 3,09 3,09 Asp 4,98 4,88 4,97 4,66 4,80 4,98 4,91 4,91 Glu 7,77 8,38 8,10 8,03 8,38 7,77 7,92 7,92 Phe 2,94 3,28 3,21 3,13 3,28 2,94 3,09 3,09 Gly 4,68 4,50 4,74 4,82 4,50 4,68 4,53 4,53 His 2,19 2,52 2,60 2,68 2,52 2,19 2,11 2,11 Ile 5,58 5,34 5,20 5,20 5,34 5,58 5,58 5,58 Lys 7,70 7,77 8,10 7,95 7,85 7,70 7,92 7,92 Leu 14,34 13,64 13,53 13,53 13,49 14,34 14,26 14,26 Met 2,34 2,44 2,52 2,60 2,52 2,34 2,42 2,42 Asn 3,70 3,81 3,75 3,75 3,81 3,70 3,55 3,55 Pro 4,75 4,42 4,51 4,36 4,42 4,75 4,68 4,68 Gln 3,92 4,19 3,82 4,05 4,19 3,92 3,92 3,92 Arg 4,60 4,65 4,28 4,51 4,65 4,60 4,60 4,60 Ser 8,45 8,92 8,87 8,64 8,92 8,45 8,53 8,53 Thr 4,38 4,50 4,28 4,36 4,50 4,38 4,53 4,53 Val 4,68 4,57 4,59 4,89 4,65 4,68 4,68 4,68 Trp 1,36 1,45 1,61 1,53 1,45 1,36 1,36 1,36 Tyr 2,57 2,21 2,37 2,37 2,21 2,57 2,49 2,49 Tổng số 1325 1312 1308 1308 1312 1325 1325 1325 2. Thiết kế mồi nhận dạng candidate gen Bph14 đơn nucleotide (SNP) và các đoạn thêm, bớt kháng rầy nâu (InDels) giữa các giống khá cao. Đặc biệt, có một Kết quả tầm soát và so sánh trình tự locus đoạn trình tự với 27 cặp nucleotide chèn thêm đã của 36 giống lúa địa phương với gen kháng được tìm thấy tại một số giống địa phương của Việt rầy nâu LOC_Os03g63150 bằng các phần mềm Nam giống như gen kháng rầy đã được công chuyên dụng cho thấy: tần số xuất hiện các đa hình bố (Hình 2). Hình 2. Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen kháng rầy nâu Bph14 của một số giống lúa địa phương Dựa vào sự sai khác về trình tự đoạn gen kháng rầy nâu giữa các giống lúa, sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer 3.0 chúng tôi đã thiết kế được cặp thể khuếch đại đoạn gen với kích thước tính toán mồi đặt tên là Bph14add27 có trình tự: 176bp ở các giống có gen ứng viên kháng
Tạp chí Khoa học và ng nghệ ng nghiệp Việt Nam Số 7(60)/2015 (candidate gen) giống với công bố của thế giới Sử dụng cặp mồi thiết kế Bph14add27 để kiểm và 149bp ở các giống có trình tự sai khác với tra sự đa hình của locus gen kháng với các đoạn trình tự gen kháng rầy nâu đã công bố trên giống lúa trong tập đoàn lúa địa phương, kết quả thế giới điện di sản phẩm PCR chỉ ra ở hình 3. 2. Kết quả kiểm tra sự đa hình candidate gen kháng Bph14 bằng cặp mồi Bph14add27 với các giống địa phương Hình 3. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 36 giống lúa địa phương với mồi Bph14add27 Dựa vào sự xuất hiện của các băng có kích 4. Kết quả bước đầu nghiên cứu khả năng thước 176bp và 149bp cho thấy: Có 6 giống xuất kháng rầy của các candidate gen Bph14 hiện candidate gen ở trạng thái đồng hợp (có kích * Kết quả lai tạo giống lúa mang candidate gen thước 176bp) gồm: Tám xoan Bắc Ninh, Tám xoan Bph14 Hải Hậu, Tẻ Nương, Coi ba đất, Hom râu và Kháu điển lư; 18 giống lúa dị hợp gồm: Để nghiên cứu, đánh giá khả năng kháng rầy lo, Kháu mặc buộc, OM6377, Chấn thơm, Xương nâu của các candidate gen , 2 giống lúa địa gà, Khâu giáng, OM5629, Nếp bồ hóng Hải phương là Lúa ngoi (có số lượng, thành phần Dương, Tan ngần, Ba chơ K’te, Blao sinh sái, giống hệt gen kháng rầy Nàng quớt biển, Nếp mèo nương, Nàng thơm chợ âu LOC_Os03g63150) và giống OM5629 (giống đào, Thơm lài, Nếp ông táo, Xương gà; 12 giống lúa kháng rầy nâu) được sử dụng trong các phép lai nhằm chuyển các candidate gen lúa xuất hiện candidate gen ở trạng thái đồng hợp (có kích thước 149bp) gồm: IS 1.2, Chiêm đá, Lúa giống lúa đang trồng phổ biến hiện nay là Bắc thơm số 7 và BC15. Kết quả lai tạo con lai F1 ở vụ Xuân gốc đỏ, Khâu liến, Tốc lùn, Tép thái bình, Nếp lùn, BC1F1 ở vụ Mùa 2014 chỉ ra ở Chiêm nhỡ BN2, Nàng cờ đỏ 2, Một bụi đỏ, Chiêm bảng 4. đỏ và Nếp mặn. Bảng 4. Kết quả lai tạo con lai F1 và BC1F1 của 2 cặp lai (BC15 ´ OM5629) và (Bắc thơm số 7 ´ Lúa ngoi) Giống nền Giống địa phương Số hạt lai F1 Số hạt lai BC1F1 nhận gen kháng (Mẹ) cho gen (Bố) (vụ Xuân 2014) (vụ Mùa 2014) Bắc thơm số 7 Lúa ngoi 61 76 BC15 OM5629 40 70 * Kiểm tra candidate gen kháng Bph14 của BC1F1của cặp lai Lúa ngoi ´ Bắc thơm số 7 thu được 36 con lai dị hợp tử với kích thước băng Hạt lai BC1F1 của từng cặp lai được trồng vào giống bố là 176bp và kích thước băng giống mẹ vụ Xuân 2015. Sau khi cấy 20 ngày, lá non của tương đương 149bp (hình 4). Kết quả điện di sản từng con lai được thu và tách chiết ADN để kiểm phẩm PCR các con lai BC1F1của cặp lai OM5629 với cặp mồi Bph14add27. ´ BC15 thu được 25 cá thể mang gen dị hợp giống Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai
Tạp chí Khoa học và ông nghệ ông nghiệp Việt Nam Số 7(60)/2015 với bố mẹ (hình 5). Các con lai này được chọn để tiếp tục lai tạo BC2F1 ở vụ xuân 2015. Hình 4: Ảnh điện di sản phẩm PCR của mồi Bph14add27 đối với các con lai BC1F1 (Lúa ngoi ´ Bắc thơm số 7); Thang marker 20bp; U8: Lúa ngoi; M16: Bắc thơm số 7, 1357-1486: số thứ tự đánh dấu con lai Hình 5: Ảnh điện di sản phẩm PCR của mồi Bph14add27 đối với các con lai BC1F1 (OM5629 ´ BC15); Thang marker 20bp;U20: OM5629; M13: BC15, 25-3052: số thứ tự đánh dấu con lai * Kiểm tra candidate gen kháng Bph14 của hợp (hình 6). Ở cặp lai OM5629 ´ lai BC1F1 số 3009 và 3020 được chọn để tiếp tục Hai con lai BC1F1 số 1359 và 1480 của tổ hợp lai tạo BC2F1 ở vụ xuân 2015. Kết quả kiểm tra ´ Bắc thơm số 7 được chọn để tiếp tục của 33 con lai BC2F1 thu lai tạo BC2F1 ở vụ xuân 2015. Hạt lai thu được từ được 15 con lai mang candiadate gen dị hợp hai cá thể này được trồng vào vụ mùa 2015. Kết quả kiểm tra candidate gen với cặp mồi tiếp tục được backcross để tạo BC3F1 ở vụ Bph14add27 của 46 con lai BC2F1 ở giai đoạn sớm cho thấy có 21 con lai mang candidate gen dị Hình 6: Ảnh điện di sản phẩm PCR của mồi Bph14add27 đối với các con lai BC2F1 (Lúa ngoi ´ Bắc thơm số 7); Thang marker 50bp; U8: Lúa ngoi; M16: Bắc thơm số 7; 1162-1185 con lai của cá thể BC2F1 1359; 1186-1205 con lai của cá thể BC2F1 1480
Tạp chí Khoa học và ng nghệ ng nghiệp Việt Nam Số 7(60)/2015 Hình 7: Ảnh điện di sản phẩm PCR với mồi Bph14add27 đối với các con lai BC2F1 (OM5629 ´ BC15); Thang marker 20bp; U20: OM5629; M13: BC15, 2137-2156: Con lai của cá thể BC2F1 3009; 2157-2169: Con IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO lai của cá thể BC2F1 3020 1. Kết luận Nguyễn Thị Lan, Phạm Tiến Dũng, 2005. phương pháp thí nghiệm Nông nghiệp 2005. Đã tầm soát, xác định được 3 candidate gen Phạm Văn Lầm (2000). Rầy nâu hại lúa và biện của 3 giống (Lúa ngoi, Tẻ nương và pháp phòng trừ Nông nghiệp Hà Nội. OM5629) có số lượng Nucleotid và số lượng amino acid bằng với số lượng Nucleotid và số lượng amino của gen kháng rầy nâu LOC_Os đã công bố trên thế giới. Trong đó, ở giống Lúa ngoi có số lượng và thành phần giống hệt gen kháng rầy Đã thiết kế được cặp mồi Bph14add27 đặc hiệu để nhận biết candidate gen kháng rầy nâu thuộc locus ở một số giống lúa địa phương của Việt Nam. Kết quả lai tạo đã thu được 21 con lai BC2F1 của cặp lai Lúa ngoi Bắc thơm số 7 và 15 con lai BC2F1 của căp lai OM5629 ở trạng thái dị hợp. 2. Đề nghị Tiếp tục sử dụng các con lai BC2F1 cho các nghiên cứu tiếp theo để đánh giá khả năng kháng Ngày nhận bài: 11/9/2015 rầy nâu của các candidate gen Người phản biện: GS.TS. Nguyễn Văn Tuất giống lúa địa phương của Việt Nam và ứng dụng Ngày phản biện: 12/10/2015 trong chọn tạo giống Ngày duyệt đăng: 16/10/2015 Nguyễn Thúy Điệp1, Nguyễn Trường Khoa1, Khuất Hữu Trung1 Design of functional markers to determine bacterial blight resistance genes in Vietnamese local rice varieties Abstract Bacterial blight is one of the most serious threats to many rice production regions, including Vietnam. In this study, based on the sequence data of 36 local rice varieties, candidate gene xa13 was identified in eight Vietnamese local rice varieties. The nucleotide numbers of Coding DNA Sequence of this candidate gene were similar with the published sequences in Genbank. Especially, Hom rau and Chan Thom varieties have nucleotide and amino acid ingredient similar with the published xa13 LOC Os08g42350 gene. Xa13add4 marker was designed to determine xa13 candidate genes in 36 sequenced rice varieties. The xa13add4R/xa13add4F Viện Di truyền Nông nghiệp