Xây dựng ngân hàng vi khuẩn với các dữ liệu về nguồn gốc chủng, tính chất vi thể, sinh hóa học, trình tự 16SrDNA, và tính chất đề kháng kháng sinh

XÂY DỰNG NGÂN HÀNG VI KHUẨN VỚI CÁC DỮ LIỆU VỀ NGUỒN GỐC<br /> CHỦNG, TÍNH CHẤT VI THỂ, SINH HÓA HỌC, TRÌNH TỰ 16SrDNA, VÀ<br /> TÍNH CHẤT ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH<br /> <br /> Phạm Thái Bình(1,2), Lưu Ly Bích Ngân(2),Ngô Thị Hồng Thủy(2), Phạm Hùng Vân(1,2)<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn ñề: Ngân hàng các chủng vi khuẩn thuộc nhiều giống, loài khác nhau là phương<br /> tiện rất hữu dụng dùng ñể huấn luyện và ñào tạo về vi sinh, ñể kiểm tra chất lượng của các phòng<br /> thí nghiệm, và ñể hổ trợ nhiều nghiên cứu khác.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng ngân hàng vi khuẩn ñã ñược ñịnh danh rõ ràng cùng với<br /> các dữ liệu về nguồn gốc chủng, tính chất vi thể, tính chất sinh hoá, kiểu ñề kháng kháng sinh và<br /> trình tự của gene 16SrDNA.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Thu nhận các chủng vi khuẩn từ những nguồn gốc<br /> khác nhau, ñịnh danh chính xác ñến loài dựa vào tính chất về vi thể, ñặc ñiểm khúm khuẩn, tính<br /> chất sinh hóa cơ bản, trình tự gene 16rSDNA và tính chất ñề kháng kháng sinh. Các chủng vi khuẩn<br /> sau khi ñã xác ñịnh ñầy ñủ các tính chất ñã nêu sẽ ñược lưu giữ với bản ñồ vị trí lưu trữ trong hộp<br /> lưu trữ và vị trí ñể hộp lưu trữ. Tạo một phần mềm quản lý hồ sơ lưu trữ.<br /> Kết quả nghiên cứu: Bước ñầu xây dựng ñược ngân hàng vi khuẩn với 155 chủng vi khuẩn<br /> thuộc152 loài khác nhau. Các chủng vi khuẩn này bao gồm Bacillus (14 chủng); Corynebacterium<br /> (5 chủng); Listeria (03 chủng); Lactobacillus (07 chủng); Enterobacteriaceae (30 chủng); trực<br /> khuẩn Gram âm khác (30 chủng); Staphylococcus (07 chủng); Streptococcus (09 chủng);<br /> Enterococcus (04 chủng); cầu khuẩn Gram dương khác (02 chủng); Morexella (02 chủng);<br /> Neisseria (04 chủng); vi khuẩn kỵ khí (11 chủng) và các dòng vi khuẩn khác (27 chủng). Các chủng<br /> vi khuẩn này có nguồn gốc phân lập từ môi trường (74 chủng), từ chế phẩm men vi sinh (11 chủng),<br /> từ thực phẩm (07 chủng) và từ các nhiễm trùng trên người (65 chủng). Riêng những vi khuẩn phân<br /> lập từ nhiễm trùng ñược xác ñịnh thêm tính chất ñề kháng kháng sinh. Mỗi chủng có một hồ sơ lưu<br /> trên giấy và trong hồ sơ cơ sở dữ liệu. Đã lưu trữ các chủng ở hai ñiều kiện là -70oC và ñông khô<br /> ñóng nút dưới áp lực 0.03-0.04 asmosphere, và các chủng lưu ñược cho vào các hộp giữ chủng có<br /> bản ñồ xác ñịnh vị trí dễ dàng tìm thấy khi truy cập cơ sở dữ liệu trong hồ sơ và trong phần mềm.<br /> Một kết quả ñáng nói trong công trình này là ñã xây dựng ñược một phần mềm quản lý cơ sở dữ<br /> liệu của ngân hàng chủng.<br /> Kết luận: Đây là ngân hàng vi khuẩn sống ñông khô giữ ở 4oC và ñông lạnh giữ ở -70oC<br /> ñược quản lý ñầy ñủ các chi tiết có liên quan về nguồn gốc và tính chất vi sinh học. Ngân hàng vi<br /> khuẩn này sẽ ñược bổ sung liên tục ñể ngày càng phong phú và ña dạng giúp cho việc giảng dạy và<br /> nghiên cứu vi sinh học tại Việt Nam.<br /> Từ khóa: ngân hàng vi khuẩn, ngân hàng vi khuẩn ở Việt Nam.<br /> ESTABLISH THE BACTERIAL BANK WITH THE DATA RELATED TO<br /> SOURCE, 16SRDNA SEQUENCE, BIOCHEMICAL CHARACTERS AND ANTIBIOTIC<br /> RESISTANT PATTERNS<br /> Phạm Thái Bình(2,2), Lưu Ly Bích Ngân(2),Ngô Thị Hồng Thủy(2), Phạm Hùng Vân(1,2)*<br /> ABTRACT<br /> Background: A bacterial bank with various genus and species is very useful for training,<br /> quality control of the clinical laboratory of microbiology, and also supports various<br /> microbiological researches.<br /> Objectives: Establish the bacterial bank containing the well identification strain, with<br /> source, 16SrDNA sequence, biochemical characters and antibiotic resistant patterns.<br /> 1<br /> <br /> Đại Học Y Dược TP. HCM, 2Phòng thí nghiệm NK-Biotek<br /> Đại Học Y Dược TP. HCM, 2Phòng thí nghiệm NK-Biotek<br /> Liên Hệ: Phạm Thái Bình – ĐT : 0903866915 – Email: xetnghiemvisinh@gmail.com<br /> 2<br /> <br /> Materials and method: Collect the bacterial strains from various sources, identify to<br /> species based on the bacterial characters including microscopic/colony appearance, biochemical<br /> characters, 16SrDNA sequence, and the antibiotic resistant pattern. The collected strains will be<br /> stored and kept in suitable boxes with located schema. The data related to the collected strains are<br /> kept in the stored files either hard copies and digital copies managed by a created specific software.<br /> Result: Until now, the bacterial bank of 155 strains of 152 species are built. These strains<br /> include Bacillus (14 strains); Corynebacterium (5 strains); Listeria (03 strains); Lactobacillus (07<br /> strains); Enterobacteriaceae (30 strains); others Gram negative rods (30 strains); Staphylococcus<br /> (07 strains); Streptococcus (09 strains); Enterococcus (04 strains); others Gram positive cocci (02<br /> strains); Morexella (02 strains); Neisseria (04 strains); anaerobic bacteria (11 strains) và others<br /> bacteria (27 strains). These strains are isolated from the environments (74), probiotic products<br /> (11), foods (7) and clinical specimens (65). The strains isolated from the clinical specimens were<br /> particularly determined antibiotic resistanct patterns. Each collected strain in the bacterial bank<br /> had one form in harcopy format and in digital copy format. All of the strains of the bacterial bank<br /> are stored in liophylized vials caped under 0.03-0.04 atmosphere kept at 4oC and also in frozen<br /> vials kept at -70oC. The stored strains were kept in suirable box with located schema that were<br /> easily tracked by manage software and by hard copies file. Another interesting result in this study is<br /> the specific software was created to manage the bacterial bank.<br /> Conclusion: This is the bacterial bank included the bacterial strains stored in the<br /> lyophilized vials kept at 4oC and frozen vials kept at -70oC with hard copy files and digital copy<br /> files that were managed by a created specific softtware. This bacterial bank will be supplemented<br /> continuously and will become a helpful tool for training and for bacteriological researches.<br /> Key words: VBB, Bacterial bank, Vietnamese Bacterial Bank<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Ngân hàng vi khuẩn là một tập hợp gồm nhiều chủng vi khuẩn thuộc các loài khác nhau hoặc các<br /> chủng vi khuẩn cùng loài nhưng có sự khác nhau về tính chất sinh hóa, biotype, serotype, ñề kháng<br /> kháng sinh....Ngân hàng này sẽ ñóng một vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu và giảng dạy về vi<br /> sinh và vi sinh y học vì ñây là phương tiện dùng ñể huấn luyện và ñào tạo về xét nghiệm vi sinh, là<br /> công cụ dùng ñể nội kiểm và ngoại kiểm chất lượng của các phòng thí nghiệm18, và là ñối tượng ñể<br /> thực hiện những nghiên cứu về vi sinh.<br /> Trên thế giới hiện nay, có nhiều bộ ngân hàng vi khuẩn ñược gôi là các sưu tập vi khuẩn như<br /> ATCC (American Type Culture Colection); NCTC (National Collection of Type Cultures)1,12.<br /> Tại Việt Nam, từ năm 1995 Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học thuộc Đại Học Quốc Gia Hà<br /> Nội ñã xây dựng bộ sưu tập vi khuẩn VTCC (Vietnam Type Culture Collection)19. Tuy nhiên, bộ<br /> sưu tập VTCC hiện nay chỉ có 145 chủng vi khuẩn nhưng lại có nhiều chủng vi khuẩn chỉ ñược xác<br /> ñịnh ñến giống, hoặc có nhiều vi khuẩn có cùng giống chẳng hạn như giống Lactobacillus có ñến<br /> 25 chủng vi khuẩn nên số lượng loài vi khuẩn không ñược phong phú. Ngoài ra, các chủng vi khuẩn<br /> từ VTCC ña số là những chủng vi khuẩn phân lập từ tự nhiên (ñất, nước, môi trường...) nên không<br /> thể<br /> ứng<br /> dụng<br /> trong<br /> lĩnh<br /> vực<br /> vi<br /> sinh<br /> y<br /> học,<br /> vi<br /> sinh<br /> thực phẩm.<br /> Một số nơi khác như Bộ môn Xét nghiệm, Khoa ĐD&KTYH, ĐH Y Dược TP. HCM cũng có bộ<br /> sưu tập vi khuẩn dùng trong giảng dạy về xét nghiệm vi sinh lâm sàng như số lượng rất hạn chế, chỉ<br /> khoảng 20 chủng và ña phần các chủng vi khuẩn này không có nguồn gốc rõ ràng và ñược ñịnh<br /> danh dựa trên một vài tính chất sinh hóa học nên kết quả không thể chuẩn xác.<br /> Chính vì thế, chúng tôi xây dựng bộ sưu tập vi khuẩn và ñược ñặt tên là VBB (Vietnamese<br /> Bacterial Bank). Những chủng vi khuẩn trong VBB sẽ rất phong phú về giống loài và sẽ ñược ñịnh<br /> danh ñến loài nhờ giải trình tự 16SrDNA và sẽ có ñầy ñủ các dữ liệu về nguồn gốc phân lập, trình<br /> tự 16SsDNA, tính chất vi sinh, sinh hóa học và ñề kháng kháng sinh.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn ñược phân lập từ nhiều nguồn gốc khác nhau như từ<br /> các nhiễm trùng trên người, từ môi trường, từ các chế phẩm probiotic...v.v... Tiêu chuẩn loại trừ là<br /> nếu các chủng vi khuẩn có kết quả ñịnh danh trùng khớp nhau và các dữ liệu khác hoàn toàn giống<br /> hệt nhau thì sẽ chỉ lấy một chủng.<br /> Các chủng vi khuẩn ñược khảo sát các tính chất về vi thể thông qua các phết nhuộm (Gram,<br /> Methylen Blue Alkaline, Ziehl Neelsen)8,9,15. Tính chất khúm khuẩn sẽ ñược xác ñịnh trên một số<br /> môi trường phân lập thông dụng2,5,6,8,11,13,18. Thực hiện các thử nghiệm sinh hóa ñể xác ñịnh tính<br /> chất sinh hóa học2,4,5,6,8,9,11,13,18. Những dữ liệu về tính chất vi thể, khúm khuẩn, sinh hóa học ñược<br /> ghi nhận bằng hình ảnh.<br /> Các chủng vi khuẩn ñược ly trích DNA tổng số của vi khuẩn và khuếch ñại trình tự gen<br /> 16SrDNA bằng kỹ thuật PCR rồi giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR bằng hệ thống ABI 3130XL.<br /> Trình tự giải ñược sẽ ñược so chuỗi trên ngân hàng dữ liệu của NCBI nhờ ñó vi khuẩn sẽ ñược ñịnh<br /> danh ñến loài16.<br /> Tính chất ñề kháng kháng sinh bằng các phương pháp như ñĩa kháng sinh4,8,11,14,15, xác ñịnh giá<br /> trị nồng ñộ ức chế tối thiểu (MIC) bằng Etest hoặc vi pha loãng11,14,15. Ngoài ra, tùy vào từng loại vi<br /> khuẩn sẽ thực hiện một số kháng sinh ñồ ñặc biệt như phát hiện β-lactamase bằng nitrocefin3,14,15,<br /> phát hiện ESBL3,7,10,14,15, MRS14,15, D-test14,15.<br /> Các vi khuẩn sau khi ñịnh danh và xác ñịnh các tính chất sẽ ñược lưu giữ ở hai ñiều kiện: ñông<br /> khô sau ñó ñóng nắp ở áp lực 0.03-0.04 asmosphere rồi giữ ở 4oC và ñông lạnh giữ ở -70oC. Các<br /> chủng ñông khô và ñông lạnh sẽ ñược giữ trong các hộp chuyên dụng có sơ ñồ chỉ vị trí. Mỗi chủng<br /> sẽ có một hồ sơ gi nhận tất cả các tính chất xác ñịnh ñược cùng hình ảnh ñi kèm và vị trí giữ trong<br /> các hộp giữ chủng. Hồ sơ chủng sẽ có hai: một trong giấy và một nhập vào máy tính.<br /> Để quản lý hồ sơ, xây dựng một phần mềm chuyên dũng ñể nhập hồ sơ và truy cập.<br /> KẾT QUẢ<br /> Bước ñầu VBB ñã thu nhận ñược 155 chủng vi khuẩn thuộc 152 loài vi khuẩn khác nhau. Trong<br /> ñó, 74 chủng có nguồn gốc từ môi trường (ñất, nước, cây trồng, thường trú trên da người...); 65<br /> chủng ñược phân lập từ các nhiễm trùng trên người; 11 chủng có nguồn gốc từ các chế phẩm men vi<br /> sinh cho người, gia cầm và thủy sản; 07 chủng vi khuẩn ñược phân lập từ thực phẩm.<br /> Giống Bacillus gồm có 14 chủng vi khuẩn, trong ñó 08 chủng có nguồn gốc từ môi trường (B.<br /> amyloliquefaciens,<br /> B.<br /> firmus,<br /> B.<br /> flexus,<br /> B.<br /> halodurans,<br /> B.<br /> megaterium,<br /> B. mycoides, B. polyfermenticus, B. pumilus); 05 chủng ñược phân lập từ probiotic trên người và<br /> thủy<br /> sản<br /> (B.<br /> clausii,<br /> B.<br /> licheniformis,<br /> B.<br /> sphaericus,<br /> B.<br /> subtilis,<br /> B. thuringiensis) và 01 chủng có nguồn gốc từ thực phẩm (B. cereus).<br /> Giống Corynebacterium gồm có 05 chủng vi khuẩn với 01 chủng ñược phân lập từ nhiễm trùng<br /> trên người (C. diphtheriae) và 04 chủng có nguồn gốc từ môi trường<br /> (C.<br /> aurimucosum,<br /> C.<br /> striatum,<br /> C. urealyticum, C. ureicellerivorans).<br /> Giống Listeria với 03 chủng vi khuẩn ñược phân lập từ thực phẩm (L. monocytogenes,<br /> L. innocua, L. welshimeri).<br /> Giống Lactobacillus với 07 chủng vi khuẩn gồm 02 chủng từ men vi sinh<br /> (L. acidophilus, L. casei); 04 chủng từ môi trường (L. farciminis, L. fermentum,<br /> L. platarum, L. suntoryens) và 01 chủng phân lập từ thực phẩm (L. lactis).<br /> Họ Enterobacteriaceae thu nhận 30 chủng thuộc 12 giống, trong ñó 7 chủng có nguồn gốc từ<br /> môi trường và 23 chủng ñược phân lập từ các nhiễm trùng trên người. Những chủng vi khuẩn này<br /> gồm có Citrobacter (C. brakii, C. diversus, C. freundii, C. koseri); Edwarsiella (E. tarda);<br /> Enterobacter<br /> (E.<br /> aerogenes,<br /> E.<br /> agglomerans,<br /> <br /> E. cancerogenus, E. cloacae, E. hormaechei, E. sakazakii); Escherichia (E. coli, E. coli inactive);<br /> Hafnia<br /> (H.<br /> alvei);<br /> Klebsiella<br /> (K. oxytoca, K. ozaenae, K. pneumoniae); Morganella (M. morganii); Proteus<br /> (P.<br /> mirabilis,<br /> P.<br /> vulgaris);<br /> Providencia<br /> |(P.<br /> rettgeri,<br /> P.<br /> stuartii);<br /> Salmonella<br /> (S.<br /> arizonae,<br /> S.<br /> cholerasuis,<br /> S.<br /> enterica,<br /> S. enteritilis, S. paratyphi A, S. typhi); Serratia (S. marcescens); Shigella (S. sonnei).<br /> Nhóm trực khuẩn Gram (-) không lên men với 11 chủng phân lập từ môi trường và 07 chủng có<br /> nguồn<br /> gốc<br /> từ<br /> nhiễm<br /> trùng<br /> trên<br /> người.<br /> Bao<br /> gồm<br /> giống<br /> Acinetobacter<br /> (A. baumanii, A. johnsonii, A. haemoliticus, A. junii, A. calcoaceticus); Burkholderia<br /> (B. cenocepacia, B. pseudomallei, B. tropica, B. cepacia); Pseudomonas (P. aeruginosa,<br /> P.<br /> stutzeri,<br /> P.<br /> nitroreducens,<br /> P.<br /> pseudoalcaligenes);<br /> Chryseobacterium<br /> (C. gleum, C. jejuense, C. taiwanense); Stenotrophomonas maltophilia và Achromobacterium<br /> xylosoxidans.<br /> Trực khuẩn Gram (-) khác gồm có 03 chủng ñược phân lập từ môi trường và 09 chủng phân lập<br /> từ nhiễm trùng trên người. Haemophilus (H. influenzae có tiết và không tiết β-lactamase, H.<br /> haemoliticus,<br /> H. parainfluenzae); Campylobacter (C. jejuni, C. fetus, C. coli); Vibrio (V. cholerae O1 biotype cổ<br /> ñiển, serotype Ogawa, V. harveyi, V. parahaemolyticus); Helicobacter pylori và Aeromonas veronii.<br /> Giống Staphylococcus gồm có 07 chủng thuộc 05 loài. Với 06 chủng ñược phân lập từ nhiễm<br /> trùng trên người là S. aureus (MSSA, MRSA D-test [-], MRSA D-test [+]),<br /> S.<br /> epidermidis,<br /> S.<br /> haemolyticus,<br /> S. saprophyliticus và 01 chủng phân lập từ môi trường (S. sciuri).<br /> Giống Streptococcus thu nhận ñược 06 chủng có nguồn gốc từ nhiễm trùng ở người (S.<br /> pyogenes,<br /> S.<br /> agalactidae,<br /> S.<br /> dysagalactidae,<br /> S.<br /> mitis,<br /> S.<br /> suis,<br /> S. pneumoniae) và 03 chủng phân lập từ môi trường (S. arlettae, S. salivarius,<br /> S. thermophilus).<br /> Giống<br /> Enterococcus<br /> gồm<br /> có<br /> các<br /> loài<br /> E.<br /> faecalis,<br /> E.<br /> faecium<br /> (từ<br /> nhiễm<br /> trùng),<br /> E. durans, E. hirae (từ môi trường).<br /> Cầu khuẩn Gram (+) khác có ñược 02 loài vi khuẩn là Micrococcus luteus (từ môi trường) và<br /> Pediococcus<br /> acidilactici<br /> (từ thực phẩm).<br /> Nhóm cầu khuẩn Gram (-) gồm có 06 chủng thuộc 02 giống là Moraxella<br /> (M. catarrhalis, M. osloensis) và Neisseria (N. meningitidis, N. gonorrhoeae,<br /> N. lactamica, N. sicca).<br /> Vi khuẩn kỵ khí có ñược 11 chủng với 07 chủng từ nhiễm trùng, 03 chủng phân lập từ men vi<br /> sinh và 01 chủng từ môi trường. Các vi khuẩn này gồm có Clostridium<br /> (C. butyricum, C. cochlearium, C. hastiforme, C. ramnosum); Streptococcus (S. anginosus, S.<br /> constellatus, S. gordonii); Bacteroides fragilis, Propionibacterium acnes, Peptostreptococcus<br /> anaerobius, Prevotella buccae.<br /> <br /> Hình 1:<br /> Một hồ sơ chủng trong ngân hàng vi khuẩn. Đây là chủng V. cholera O1 có mã<br /> số VBB0012 ñược phân lập từ phân bệnh nhân bị tiêu chảy. Hồ sơ ghi nhân tính chất vi thể là<br /> phất nhuộm Gram ñược chụp hình qua kính hiển vi, tính chất khúm trên các môi trường phân<br /> lập cũng ñược chụp hình, tính chất sinh vật hoá học cũng ñược hụp hình, và kết quả trình tự<br /> 16SrDNA giúp ñịnh danh vi khuẩn nhờ NCBI blast search<br /> <br /> Các vi khuẩn khác chưa ñược thực hiện phân loại với 27 chủng, trong ñó có 01 chủng từ thực<br /> phẩm (Acetobacter tropicalis), 01 chủng phân lập từ men vi sinh (Sporosarcina seromensis), còn<br /> lại là các chủng có nguồn gốc từ môi trường. Các vi khuẩn này bao gồm: Agrobacterium<br /> tumefaciens, Alpha proteobacterium, Pantoea stewartii, Anoxybacillus beppuensis, Gordonia<br /> terrae, Brevibacillus borstelensis, Brevibacillus brevis, Caldimonas manganoxidans, Xanthomonas<br /> sacchari, Glomerella angulata, Microbacterium marinilacus, Firmicuter bacterium, Geobacillus<br /> thermoglucosidasius, Issatchenkia occidentalis, Meiothermus ruber, Microbacterium oleivorans,<br /> Oerskovia xanthineolytica, Pseudacidovorax intermedius, Pseudoxanthomonas taiwanensis,<br /> Ralstonia picktii, Shewanella algae, Streptomyces cellulose, Tepidimonas ignava, Tepidimonas<br /> taiwanensis, Weissella parasenteroides.<br /> Tất cả các chủng vi khuẩn ñều ñược giữ ỡ hai dạng: ñông khô và ñóng nắp áp lực thấp giữ ở 4oC<br /> <br /> Hình 2:<br /> Một hồ sơ chủng trong ngân hàng vi khuẩn. Đây là chủng C. diphtheria có mã<br /> số VBB0032 ñược phân lập từ quệt họng. Hồ sơ ghi nhân tính chất vi thể là phất nhuộm Gram<br /> ñược chụp hình qua kính hiển vi, tính chất khúm trên các môi trường phân lập cũng ñược<br /> chụp hình, tính chất sinh vật hoá học cũng ñược hụp hình, và kết quả trình tự 16SrDNA giúp<br /> ñịnh danh vi khuẩn nhờ NCBI blast search<br /> và ñông<br /> lạnh giữ ở<br /> o<br /> -70 C. Các giữ chũng ñược giữ trong hộp thích hợp có vị trí.<br /> Mỗi chủng ñều có hồ sơ ghi ñầy ñủ các dữ liệu và hình ảnh. Hình 1 và 2 là minh họa cho các hồ<br /> sơ chủng trong ngân hàng. Hồ sơ chủng ñược lưu ở hai loại: lưu giấy và lưu trong máy tính.<br /> Hồ sơ ñược lưu trong máy tính cũng như trình bày hồ sơ lưu trong giấy nhưng ñược quản lý bằng<br /> một phần mềm chuyên dụng ñược chúng tôi tạo ra ñể nhập dữ liệu và truy cập. Hình 3 là một minh<br /> họa hiển thị của phần mềm này.<br /> BÀN LUẬN<br /> <br />