Xây dựng quy trình mulitplex real-time RT-PCR định lượng đồng thời mRNA PCA3 và PSA trong nước tiểu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX REAL-TIME PCR<br /> ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI mRNA PCA3 VÀ PSA TRONG NƯỚC TIỂU<br /> Huỳnh Nhã Vân*, Lê Phúc Liên**, Trần Lê Linh Phương**, Hồ Huỳnh Thùy Dương***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Tổng quan: PCA3 (Prostate Cancer Antigen 3) là gene mã hóa mRNA đặc hiệu cho tiền liệt tuyến và được<br /> biểu hiện cao trong ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT). Tỉ lệ giữa nồng độ mRNA PCA3 và PSA (Prostate-<br /> Specific Antigen) trong nước tiểu, chỉ số PCA3, đã được chứng minh là có độ đặc hiệu với UTTLT cao hơn so<br /> với xét nghiệm PSA trong huyết thanh.<br /> Mục tiêu: Xây dựng quy trình mulitplex real-time RT-PCR định lượng đồng thời mRNA PCA3 và PSA<br /> trong nước tiểu.<br /> Phương pháp: Quy trình multiplex được xây dựng dựa trên monoplex PCA3 và PSA đã tối ưu hóa các<br /> thông số nhiệt độ lai và nồng độ mồi. Sau đó, quy trình multiplex được thử nghiệm trên 6 mẫu nước tiểu bệnh<br /> nhân và chỉ số PCA3 được tính dựa theo công thức đã công bố.<br /> Kết quả: Quy trình multiplex real-time RT-PCR có hiệu quả nhân bản đạt 90-105% với hệ số xác định<br /> (R2) của đường chuẩn đạt > 0,980. PCA3 và PSA được phát hiện và định lượng trên 100% các mẫu bệnh nhân.<br /> Kết luận: Quy trình có thể được sử dụng để định lượng mRNA PCA3 và PSA. Cần tiến hành thử nghiệm<br /> trên nhiều mẫu bệnh để xác định giá trị ngưỡng của chỉ số PCA3 nhằm ứng dụng trong tầm soát UTTLT.<br /> Từ khóa: PCA3, PSA, mRNA, chỉ số PCA3, ung thư tiền liệt tuyến .<br /> ABSTRACT<br /> ESTABLISHMENT OF A MULTIPLEX REAL-TIME PCR FOR SIMULTANEOUS QUANTITATION<br /> OF URINE PCA3 AND PSA mRNA<br /> Huynh Nha Van, Le Phuc Lien, Tran Le Linh Phuong, Ho Huynh Thuy Duong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 2 - 2016: 83 - 87<br /> <br /> Introduction: PCA3 (Prostate Cancer Antigen 3) encodes a prostate-specific mRNA that has been shown<br /> to be up-regulated in prostate cancer (PCa). PCA3 score, the ratio of PCA3 mRNA copies to PSA (Prostate-<br /> Specific Antigen) mRNA copies in urine, has been shown to have higher PCa specificity compared to serum<br /> PSA test.<br /> Objectives: The present study aimed to establish a multiplex real-time RT-PCR for quantification of PCA3<br /> and PSA mRNA.<br /> Methods: Multiplex real-time RT-PCR was constructed based on PCA3 and PSA singleplex with<br /> optimized annealing temperature and primer concentrations. The multiplex assay was then tested on patients’<br /> urine samples and PCA3 score was calculated.<br /> Results: Multiplex amplification efficiencies were between 90-105% with coefficient of determination (R2)<br /> of more than 0.980. PCA3 and PSA mRNA were detected and quantified in 100% urine samples.<br /> Conclusions: Further study on larger population is necessary to determine PCA3 score cut-off value for<br /> <br /> <br /> Công ty TNHH Công nghệ sinh học Khoa Thương<br />  <br /> Bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM<br /> Tác giả liên lạc: ThS. Huỳnh Nhã Vân. ĐT: 0932140123. Email: huynhnhavan@gmail.com<br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 2016 83<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016<br /> <br /> PCa screening.<br /> Key words: PCA3, PSA, mRNA, PCA3 score, prostate cancer.<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ gene được xem là có biểu hiện tương đối ổn<br /> định trong tế bào TLT(2). Các thử nghiệm đề<br /> Ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) là dạng xuất hiện nay để đo hàm lượng mRNA PCA3<br /> ung thư phổ biến thứ hai và là nguyên nhân và PSA sử dụng các phương pháp nhân bản<br /> tử vong do ung thư đứng hàng thứ sáu ở nam mRNA luân nhiệt hay đẳng nhiệt như real-time<br /> giới trên thế giới. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc UTTLT RT-PCR, TMA (Transcription Mediated<br /> thay đổi theo khu vực địa lý, với tỉ lệ rất cao ở Amplification), NASBA (Nucleic Acid<br /> các nước phát triển gồm Châu Úc, Bắc Mỹ, Sequence-Based Amplification) và tiến hành<br /> Châu Âu; tỉ lệ thấp nhất thuộc về các nước trên nước tiểu. Kit PROGENSA® PCA3 (Gen-<br /> Bắc Phi, Đông và Nam Á. Mặc dù vậy, tỉ lệ<br /> Probe) dựa trên nguyên lý phương pháp TMA<br /> mắc phải ở đang có khuynh hướng gia tăng ở<br /> đã được FDA cấp phép dùng trong xét nghiệm<br /> phần lớn các quốc gia(1). Tại Việt Nam, tỉ lệ UTTLT ở Mỹ.<br /> mắc phải tăng từ 2,47 lên 4,7/100.000 người từ<br /> Nhằm ứng dụng trong sàng lọc UTTLT ở<br /> năm 2000 đến 2010(3).<br /> Việt Nam, chúng tôi tiến hành xây dựng quy<br /> Việc tầm soát UTTLT chủ yếu dựa vào kết trình định lượng mRNA PCA3 và PSA bằng<br /> quả thăm khám trực tràng (DRE - Digital<br /> phương pháp real-time RT-PCR với mẫu dò<br /> Rectal Examination) và xét nghiệm đo nồng Taqman.<br /> độ PSA (Prostate-Specific Antigen) trong<br /> máu. Tuy nhiên, nhược điểm lớn của xét VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP<br /> nghiệm này là PSA chỉ đặc hiệu cho TLT, Mồi và mẫu dò<br /> không đặc hiệu cho UTTLT. Một số chỉ thị Trình tự mồi và mẫu dò sử dụng cho phản<br /> sinh học được đề xuất gần đây cho chẩn đoán ứng PCA3: mồi xuôi 5’-<br /> sớm UTTLT như AMACR (Alpha- GGTGGGAAGGACCTGATGATAC-3’, mồi<br /> Methylacyl-CoA Racemase), EPCA (Early ngược 5’-GGGCGAGGCTCATCGAT-3’ và mẫu<br /> Prostate Cancer Antigen), EPCA2 (Early dò 5’-(FAM)-AGAAATGCCCGGCCGCCATC-<br /> Prostate Cancer Antigen-2), GSTP1 (3IABkFQ)-3’ [5]. Trình tự mồi và mẫu dò sử<br /> (glutathione S-transferase pi 1), APC dụng cho phản ứng PSA: mồi xuôi 5’-<br /> (adenomatous polyposis coli), PCA3 (Prostate GCCCACTGCATCAGGAACAA-3’, mồi ngược<br /> cancer antigen 3), thể nối gene TMPRSS2:ERG 5’-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3’, mẫu<br /> (Transmembrane protease, serine 2 và v-ets dò 5’-(Cy5)-<br /> avian erythroblastosis virus E26 oncogene AGGCTGTGCCGACCCAGCAAGATC-<br /> homolog)...(4) được cho là có giá trị chẩn đoán (3IAbRQSp)-3’ [8]. Mồi và mẫu dò được tổng<br /> cao hơn PSA. Trong đó, thử nghiệm đo chỉ số hợp và cung cấp bởi công ty IDT (Integrated<br /> PCA3 trong nước tiểu đã được đưa vào chẩn DNA Technologies, Mỹ).<br /> đoán lâm sàng với giá trị chẩn đoán dương từ<br /> 59,4 – 97,4% và giá trị chẩn đoán âm từ 87,8 – Khảo sát các điều kiện PCR<br /> 98%(6). Phản ứng monoplex ban đầu gồm: 250 nM<br /> Do gene PCA3 không có protein tương ứng, mồi các loại, 200 nM mẫu dò, 5 µl DNA chuẩn,<br /> sự tăng biểu hiện PCA3 chỉ được xác định và 5 µl Apta Taq DNA Master (Roche) và nước<br /> thông qua hàm lượng mRNA PCA3. Hàm cất cho đủ 25 µl phản ứng. Chương trình nhiệt<br /> lượng mRNA PCA3 được đồng quy hóa PCR gồm 40 chu kỳ với nhiệt độ 950C trong 30<br /> (normalized) với hàm lượng mRNA PSA, một giây và nhiệt độ bắt cặp trong 1 phút sử dụng<br /> <br /> <br /> <br /> 84 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 2016<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> máy Stratagene Mx3000P (Agilent 0,85; 33,56 ± 0,47; 32,82 ± 0,90; 32,63 ± 0,70; 31,98<br /> Technologies, Mỹ). ± 0,51. Kết quả trên cho thấy ở nhiệt độ 58-590C,<br /> Mẫu chuẩn sử dụng cho thí nghiệm này là cả 2 phản ứng đều cho giá trị Ct thấp nhất nên<br /> oligonucleotide có trình tự là sản phẩm nhân chọn nhiệt độ tương đối là 580C cho các thí<br /> bản của mỗi phản ứng được tổng hợp nhân tạo nghiệm tiếp theo.<br /> và cung cấp bởi IDT (Integrated DNA Phản ứng monoplex PSA có giá trị Ct thấp<br /> Technologies, Mỹ). nhất ở nồng độ 150 nM. Trong khi đó, ở phản<br /> Quy trình xử lý mẫu – tách chiết RNA – ứng monoplex PCA3, giá trị Ct được cải thiện từ<br /> nồng độ 350-750 nM (Bảng 1). Để giảm thiểu sự<br /> phiên mã ngược RT<br /> tương tác giữa 2 phản ứng trong multiplex<br /> Mẫu được cung cấp từ Phòng khám Tiết<br /> chúng tôi chọn nồng độ mồi thấp nhất có giá trị<br /> niệu - Bệnh viện Đại học Y dược Tp.HCM.<br /> Ct được cải thiện là 350 nM.<br /> Nước tiểu sau khi thu được bảo quản 40C và<br /> được xử lý trong ngày. Bảng 1. Giá trị Ct trung bình ở các nồng độ mồi<br /> khảo sát<br /> 30 ml nước tiểu được ly tâm ở 5000<br /> vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Cặn sau ly tâm Nồng độ mồi (nM) PSA (Ct) PCA3 (Ct)<br /> được rửa 2 lần với 10 ml PBS 1X pH 7 và ly tâm 150 27,41 ± 0,12 32,58 ± 0,57<br /> 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 40C. Cặn sau đó 250 28,51 ± 0,16 32,88 ± 0,54<br /> được tách chiết RNA sử dụng Kit tách chiết 350 28,59 ± 0,61 31,79 ± 0,42<br /> RNA tủa (AccuRive pRNA Prep Kit, EX- 450 28,60 ± 0,35 31,94 ± 0,64<br /> 550 28,03 ± 0,35 31,80 ± 0,46<br /> RNA01.1A, công ty TNHH CNSH Khoa<br /> 650 28,25 ± 0,34 31,57 ± 0,44<br /> Thương). Mẫu RNA sau đó được phiên mã<br /> 750 28,10 ± 0,38 31,61 ± 0,61<br /> ngược (RT – reverse transcription) thành cDNA Chứng âm (-) (-)<br /> sử dụng AffinityScript QPCR cDNA Synthesis<br /> Xây dựng phản ứng multiplex<br /> Kit (Agilent Technologies, Mỹ). Quy trình tách<br /> chiết RNA và phản ứng RT theo như quy trình Sau khi đã chọn nhiệt độ bắt cặp và nồng độ<br /> hướng dẫn của nhà sản xuất. mồi cho mulitplex, tiến hành so sánh giá trị Ct<br /> giữa phản ứng multiplex với monoplex. Chúng<br /> KẾT QUẢ - BÀN LUẬN<br /> tôi sử dụng 2 hỗn hợp mẫu chuẩn có nồng độ là<br /> Điều kiện PCR của phản ứng monoplex 103 và 105 bản sao/phản ứng gồm mẫu chuẩn<br /> Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ bắt PSA và PCA3 theo tỉ lệ 1:1 làm mẫu khảo sát<br /> cặp và nồng độ mồi tối ưu của từng phản ứng trong thí nghiệm này. Mỗi thí nghiệm được lặp<br /> (monoplex) để từ đó chọn điều kiện tốt nhất để lại 3 lần. Kết quả (bảng 2) cho thấy giá trị Ct của<br /> sử dụng trong phản ứng mulitplex. Chỉ tiêu để phản ứng monoplex real-time PCR và multiplex<br /> đánh giá là giá trị Ct được thể hiện bằng trị số real-time PCR không có sự khác biệt đáng kể.<br /> trung bình ± độ chênh lệch (standard deviation). Do đó, chúng tôi không tiến hành các thí<br /> Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Mẫu sử dụng nghiệm tối ưu hóa phản ứng multiplex real-<br /> cho thí nghiệm này là mẫu chuẩn được pha time PCR PSA, PCA3 mà sử dụng các điều kiện<br /> loãng ở nồng độ 1000 bản sao/phản ứng. Kết của phản ứng monoplex.<br /> quả giá trị Ct của phản ứng PSA ở các nhiệt độ Bảng 2. Giá trị Ct của phản ứng monoplex và phản<br /> bắt cặp 55, 58, 60, 62 và 650C lần lượt là 27,69 ± ứng multiplex<br /> 0,49; 26,98 ± 0,64; 31,00 ± 2,09; 29,69 ± 2,93; 31,76 Monoplex Multiplex<br /> ± 2,53. Ở phản ứng PCA3, giá trị Ct ở các nhiệt 3<br /> 10 25,50 ± 0,39 26,26 ± 0,37<br /> độ bắt cặp 55, 57, 59, 61, 630C lần lượt là 32,05 ± PSA 5<br /> 10 19,00 ± 0,29 19,39 ± 0,27<br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 2016 85<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016<br /> <br /> Monoplex Multiplex ứng PCA3 và PSA trong multiplex nằm trong<br /> 10<br /> 3<br /> 33,36 ± 0,53 33,47 ± 0,36 khoảng 90-105% và hệ số xác định của đường<br /> PCA3 5 chuẩn R2 > 0,980. Kết quả ở hình 1 cho thấy hiệu<br /> 10 26,10 ± 0,48 26,20 ± 0,80<br /> quả của cả 2 phản ứng PSA và PCA3 trong<br /> Tiếp theo, chúng tôi khảo sát hiệu quả của<br /> multiplex lần lượt là 102,0% và 96,3% với hệ số<br /> từng phản ứng trong multiplex với đường<br /> xác định của đường chuẩn là 0,999 và 0,998. Các<br /> chuẩn thiết lập từ 4 hỗn hợp mẫu chuẩn có<br /> giá trị này phù hợp với yêu cầu của đường<br /> nồng độ từ 102 đến 105 bản sao/phản ứng. Tiêu<br /> chuẩn trong real-time RT-PCR.<br /> chí đánh giá quy trình đạt là hiệu quả của phản<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Đường chuẩn của phản ứng PCA3 (FAM) và PSA (Cy5) trong multiplex<br /> Thử nghiệm quy trình trên mẫu bệnh mRNA của “gene giữ nhà” PSA được sử dụng<br /> nhân để đồng quy hóa (normalize) quy trình về<br /> lượng tế bào TLT thu nhận được sau DRE(2).<br /> Quy trình multiplex được thử nghiệm trên 3<br /> mẫu nước tiểu của bệnh nhân phì đại tiền liệt Số lượng bản sao mRNA PCA3 và PSA<br /> tuyến và 3 mẫu ung thư tiền liệt tuyến thu nhận trong phản ứng được xác định bằng phương<br /> ngay sau khi thăm khám trực tràng (DRE – pháp hồi quy tuyến tính dựa trên đường chuẩn<br /> Digital rectal exam). được chạy song song với mẫu bệnh nhân. Mỗi<br /> mẫu được lặp lại 2 lần. Các giá trị được thể hiện<br /> Hai marker PCA3 và PSA biểu hiện bên<br /> bằng trị số trung bình ± độ chênh lệch. Chỉ số<br /> trong tế bào TLT và chỉ xuất hiện ở nồng độ<br /> PCA3 được tính theo công thức nồng độ<br /> thấp trong nước tiểu. Khi có tác động lên TLT<br /> PCA3×1000/nồng độ PSA(7).<br /> (ví dụ như thao tác thăm khám DRE), các tế bào<br /> TLT bong ra sẽ được vận chuyển vào trong niệu Giá trị Ct và số lượng bản sao mRNA PCA3<br /> đạo, nhờ vậy phần nước tiểu đầu tiên sau DRE và PSA trong phản ứng được thể hiện ở bảng 3.<br /> sẽ chứa các marker TLT ở nồng độ cao. Tuy mRNA PCA3 và PSA được phát hiện trên 6/6<br /> nhiên, do lượng mRNA PCA3 trong nước tiểu mẫu nước tiểu. Chỉ số PCA3 trung bình ở nhóm<br /> rất biến thiên nên việc định lượng PCA3 riêng không ung thư (phì đại tiền liệt tuyến) và nhóm<br /> lẻ sẽ không có ý nghĩa về mặt chẩn đoán. Do đó, UTTLT lần lượt là 68,2 và 158,0.<br /> <br /> <br /> 86 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 2016<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bảng 3. Số lượng bản sao mRNA PCA3 và PSA trong phản ứng và chỉ số PCA3<br /> PCA3 PSA<br /> Chỉ số Kết quả giải<br /> STT Số bản sao mRNA/ Số bản sao mRNA/<br /> Ct Ct PCA3 phẫu bệnh<br /> phản ứng phản ứng<br /> 1 32,73 ± 0,05 124 ± 4 26,70 ± 0,17 2237 ± 258 55,4 BPH<br /> 2 34,28 ± 0,37 44 ± 11 27,79 ± 0,22 1043 ± 161 42,3 BPH<br /> 3 32,05 ± 0,06 197 ± 9 26,97 ± 0,07 1840 ± 89 107,0 BPH<br /> 4 29,42 ± 0,23 1159 ± 176 24,77 ± 0,06 8680 ± 346 133,5 PCa<br /> 5 33,78 ± 0,28 62 ± 11 26,94 ± 0,06 1888 ± 88 32,6 PCa<br /> 6 29,55 ± 0,16 1062 ± 111 26,08 ± 0,05 3452 ± 120 307,8 PCa<br /> BPH: Phì đại tiền liệt tuyến PCa: Ung thư tiền liệt tuyến<br /> 3. Hoang VD, Lee AH., Nguyen HN., Nguyen Q., Vu LC.,<br /> Như vậy, quy trình real-time RT-PCR trong<br /> Binns CW. (2014). Epidemiology and prevention of prostate<br /> đề tài đã phát hiện và định lượng thành công cancer in Vietnam. Asian Pac J Cancer Prev, 15(22): 9747-<br /> mRNA PCA3 và PSA. Chỉ số PCA3 cũng cho 9751.<br /> 4. Madu CO., Lu Y (2010). Novel diagnostic biomarkers for<br /> thấy có sự khác nhau tương đối giữa bệnh nhân prostate cancer. J Cancer, 1: 150–177.<br /> UTTLT và không ung thư. Tuy nhiên, cần thử 5. Mearini E., Antognelli C., Del Buono C., Cochetti G.,<br /> Giannantoni A., Nardelli E., Talesa VN (2009). The<br /> nghiệm thêm trên quần thể mẫu lớn hơn để tìm<br /> combination of urine DD3PCA3 mRNA and PSA mRNA as<br /> giá trị ngưỡng thích hợp cho quy trình real-time molecular markers of prostate cancer. Biomarkers,14(4): 235-<br /> RT-PCR này. 243.<br /> 6. Ruiz-Aragon J., Marquez-Pelaez S (2010). Assessment of the<br /> KẾT LUẬN PCA3 test for prostate cancer diagnosis: a systematic review<br /> and meta-analysis. Actas urologicas espanolas, 34: 346-355.<br /> Quy trình có thể được sử dụng để định 7. Shappell SB., Fulmer J., Arguello D., Wright BS.,<br /> lượng mRNA PCA3 và PSA và từ đó tính toán Oppenheimer JR., and Putzi MJ (2009). PCA3 Urine mRNA<br /> Testing for Prostate Carcinoma: Patterns of Use by<br /> chỉ số PCA3 ứng dụng trong sàng lọc UTTLT. Community Urologists and Assay Performance in Reference<br /> Quy trình cần được thử nghiệm thêm trên số Laboratory Setting. Urology, 73: 363-368.<br /> lượng mẫu lớn hơn. 8. Shen M., Chen W., Yu K., Chen Z., Zhou W., Lin X., Weng Z.,<br /> Li C., Wu X., Tao Z (2011). The diagnostic value of PCA3<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO gene-based analysis of urine sediments after digital rectal<br /> examination for prostate cancer in a Chinese population.<br /> 1. Center MM., Jemal A., Lortet-Tieulent J., Ward E., Ferlay J.,<br /> Experimental and Molecular Pathology, 90: 97-100.<br /> Brawley O., Bray F (2012). International Variation in Prostate<br /> Cancer Incidence and Mortality Rates. European Urology, 61:<br /> 1079-1092. Ngày nhận bài báo: 10/03/2016<br /> 2. Hessels D., Klein Gunnewiek JMT., van Oort I., Karthaus<br /> HFM., van Leenders GJL., van Balken B., Kiemeney LA., Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/03/2016<br /> Witjes JA., Schalken JA (2003). DD3PCA3-based Molecular Ngày bài báo được đăng: 25/03/2016<br /> UrineAnalysis for the Diagnosis of Prostate Cancer.<br /> European Urology, 44: 8-16.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh 2016 87<br />