Xây dựng quy trình PCR điện di phát hiện virut gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp trung đông

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐIỆN DI PHÁT HIỆN VIRUT<br /> GÂY HỘI CHỨNG VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TRUNG ĐÔNG<br /> Ngô Tất Trung*; Trần Thị Thu Hiền*; Phan Quốc Hoàn*; Lê Hữu Song*<br /> TÓM TẮT<br /> Đặc điểm lâm sàng của chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông (Middle East respiratory<br /> syndrome gây ra bởi Middle East respiratory syndrome coronavirus MERS-CoV) dễ nhầm với<br /> hội chứng viêm đường hô hấp cấp (Severe acute respiratory syndrome - SARS). Tại thời điểm<br /> hiện tại, chúng ta chưa có công cụ chẩn đoán phát hiện tác nhân gây bệnh nguy hiểm này.<br /> Thiết lập quy trình PCR điện di phát hiện virut gây hội chứng MERS-CoV. Phần mềm Invitrogene<br /> vector NTI-11.2 và các bệnh phẩm chuẩn âm được thu thập tại Bệnh viện TWQĐ 108. Tổng hợp<br /> cADN phiên mã ngược và PCR điện di một vòng. Kết quả cho thấy bộ mồi SHPT108@MERSCoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S hoàn toàn có khả năng phát hiện sự có mặt các đoạn ARN<br /> coronavirus ở mật độ 1 copy ARN virut/1.000 copy ARN đối chứng, đồng thời không tạo ra<br /> băng PCR phụ và không bắt cặp chéo vào các khu vực có tính tương đồng thấp của hệ gen<br /> người. Kết luận: kỹ thuật PCR điện di phát hiện ARN coronavirus đã được thiết kế thành công.<br /> * Từ khóa: Hội chứng viêm đường hô hấp cấp Trung Đông; Betacoronarivus.<br /> <br /> ESTABLISH A PCR ASSAY FOR DIAGNOSING MIDDLE EAST<br /> RESPIRATORY SYNDROME BETA-CORONAVIRUS<br /> SUMMARY<br /> Middle East respiratory syndrome is clinically similiar to severe acute respiratory syndrome<br /> (SARS) hence, but the tool to differentiate the two diseases is unavailable at the moment. The<br /> aim of this study is to build up a simple screening procedure for beta-coronavirus (MERS-CoV).<br /> The reverse transcriptase followed by polymerase chain reaction (PCR): Results shown that the<br /> two primer set SHPT108@MERS-CoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S were optimized that allow<br /> to detect presence of one betacoronavirus RNA copy out of 1,000 ABL RNA copies without any<br /> mis-amplification from MERS-CoV free samples.<br /> * Key words: Middle East respiratory syndrome; Betacoronavirus.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hội chứng viêm đường hô hấp cấp Trung<br /> Đông (gây ra bởi Middle East respiratory<br /> syndrome coronavirus [MERS-CoV]). Đây<br /> là một ARN betaconarvirus có đặc điểm di<br /> truyền học rất gần với virut gây hội chứng<br /> <br /> viêm đường hô hấp cấp (SARS). Virut này<br /> được bác sĩ Ali Moh Zaki - một nhà virut<br /> học người Ai Cập phân lập lần đầu tiên từ<br /> 1 bệnh nhân (BN) 60 tuổi suy thận kèm<br /> viêm phổi cấp, BN này sau đó tử vong [1].<br /> <br /> * Bệnh viện TWQĐ 108<br /> Người phản hồi (Corresponding): Ngô Tất Trung (ntattrung@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 23/05/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 03/07/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 23/09/2014<br /> <br /> 50<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> Cho đến nay, bộ gen của MERS-CoV<br /> (còn được gọi với tên khác là HCoVEMC/2012) đã được giải trình tự hoàn<br /> toàn, nó bao gồm 30.119 nucleotide và chứa<br /> khoảng 10 khung đọc mở (open reading<br /> frames). Phân tích phả hệ dựa trên gen<br /> coronaviruses replicase cho thấy MERSCoV có đặc điểm di truyền học rất gần với<br /> Tylonycteris bat coronavirus HKU4 (BtCoVHKU4) và Pipistrellus bat coronavirus HKU5<br /> (BtCoV-HKU5) khu trú trên dơi.<br /> Trước kia, người ta cho rằng coronavirus<br /> có khả năng xâm nhiễm vào cả người và<br /> động vật, gây ra các biến chứng không<br /> quá trầm trọng. Tuy nhiên, sự bùng phát<br /> của virut gây hội chứng viêm đường hô<br /> hấp cấp SARS-CoV vào năm 2002 - 2003<br /> và HCoV-EMC/2012 vào năm 2012 cho<br /> thấy coronavirus thật sự có khả năng gây<br /> bệnh nặng, thậm chí gây tử vong cho người<br /> [2]. Theo Cơ quan Kiểm soát bệnh Hoa Kỳ<br /> (Center For Disease Control - CDC), tính<br /> đến tháng 4 năm 2014) đã có 618 BN<br /> dương tính và 192 BN tử vong do MERSCoV, đa số được phát hiện tại các nước<br /> châu Âu và Ả Rập [3]. Đặc biệt, một số<br /> nước châu Á nằm gần Việt Nam như<br /> Malaysia hay Philippines đã ghi nhận<br /> những trường hợp dương tính và tử vong<br /> đầu tiên [7].<br /> Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp<br /> nào nhiễm MERS-CoV, tuy nhiên, đây là<br /> chủng virut có độc lực mạnh, có khả năng<br /> lây nhiễm từ người sang người, vì thế,<br /> việc chẩn đoán sớm và chính xác tác nhân<br /> này là điều cần làm. Hơn nữa, chưa có<br /> cơ sở y tế nào công bố thiết lập phương<br /> pháp chẩn đoán chủng virut này.<br /> <br /> 51<br /> <br /> Mục tiêu của nghiên cứu nhằm: Thiết lập<br /> phương pháp PCR phiên mã ngược phát<br /> hiện virut gây hội chứng viêm đường hô<br /> hấp cấp Trung Đông (MERS-CoV).<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Vật liệu nghiên cứu.<br /> - Các đoạn ARN mã hóa cho một phần<br /> bộ gen (MERS-CoV), phân lập từ dịch phế<br /> quản BN và được lưu trữ tại Trung tâm Lưu<br /> trữ virut châu Âu (European Virus Archive EVA), do Tiến sỹ Tobias Bleicker tặng Khoa<br /> Sinh học phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108.<br /> - Máy Thermocycler Eppendorff (Hamburg,<br /> CHLB Đức).<br /> - Máy chụp hình gel (EC3 imaging<br /> system Mỹ).<br /> - Phần mềm Invitrogene vector NTI-11.2.<br /> - Hóa chất: Tris-base, taq-polymerase,<br /> Trizol (Sigma, Mỹ).<br /> - Các bệnh phẩm huyết thanh dương<br /> tính với HBV, HCV, mẫu cADN bạch cầu<br /> tủy mạn được thu thập tại Bệnh viện TWQĐ<br /> 108 và các sinh phẩm chuẩn cho thí nghiệm<br /> sinh học phân tử.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Mẫu ARN chuẩn dương và ARN bệnh<br /> phẩm được dùng làm khuôn cho phản<br /> ứng phiên mã ngược tổng hợp cADN bổ<br /> sung. cADN này lại được dùng cho phản<br /> ứng PCR điện di, với 2 cặp mồi đặc hiệu<br /> cho khu vực mã hóa đầu nguồn (upstream<br /> coding region) của HCoV-EMC/2012. Để<br /> tiện cho thảo luận sau này, chúng tôi gọi<br /> đó là bộ mồi SHPT108@MERS-CoV-L và<br /> SHPT108@MERS-CoV-S) với trình tự sau:<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> SHPT108@MERS-CoV-L<br /> UpE-Fwd2<br /> <br /> GTGCCTGCAACGCGCGATTCAGTT<br /> <br /> UpE-Rev2<br /> <br /> GATTAGCCTCTACACGGGACCCATAG<br /> SHPT108@MERS-CoV-S<br /> <br /> ORF1b-Fwd<br /> <br /> TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT<br /> <br /> ORF1b-Rev<br /> <br /> TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> <br /> 1. Khả năng phát hiện của bộ mồi SHPT108@MERS-CoV-L và SHPT108@MERSCoV-S.<br /> Theo hướng dẫn chẩn đoán cúm mới nhất do Tổ chức Y tế Thế giới ban hành, để khẳng<br /> định sự tồn tại của một chủng virut cúm trong mẫu bệnh phẩm, cần thực hiện 2 phản<br /> ứng PCR với 2 mồi khác biệt. Vì thế, chúng tôi thiết kế và thử nghiệm hai cặp mồi khác<br /> nhau SHPT108@MERS-CoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S bắt vào 2 khu vực của HCoVEMC/2012. Kết quả điện di cADN không xuất hiện các băng phụ (sản phẩm cADN)<br /> không đặc hiệu. Điều này khẳng định tính đặc hiệu của bộ mồi do chúng tôi sử dụng.<br /> <br /> Hình 1: Khả năng phát hiện của bộ mồi dùng trong chẩn đoán HCoV-EMC/2012.<br /> 2. Tính chất đặc hiệu của trình tự gen do bộ mồi chẩn đoán khuếch đại.<br /> <br /> Hình 2: Tính chất đặc hiệu của trình tự gen do bộ mồi chẩn đoán khuếch đại.<br /> <br /> 52<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> Để khẳng định bộ mồi do chúng tôi sử<br /> <br /> Phản ứng PCR điện di sử dụng bộ mồi<br /> <br /> dụng (SHPT108@MERS-CoV-L) không<br /> <br /> SHPT108@MERS-CoV-L hoàn toàn có khả<br /> <br /> những cho kích thước đúng với thiết kế<br /> <br /> năng phát hiện vật liệu di truyền ARN<br /> <br /> mà trình tự cũng tương đồng với thông tin<br /> <br /> coronavirus ở mức 1 copy ARN virut/1.000<br /> <br /> về coronavirus được lưu trữ trên Ngân hàng<br /> <br /> ARN người khỏe mạnh.<br /> <br /> Gen, chúng tôi tiến hành giải trình tự đoạn<br /> amplicon do bộ mồi SHPT108@MERS-CoV-L<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> <br /> khuếch đại. Kết quả cho thấy, phổ sắc ký<br /> <br /> Việc chẩn đoán các virut cúm như H5N1,<br /> <br /> giải trình tự rõ ràng (hình 2, panel trên) và<br /> <br /> H7N9, H8N10 đòi hỏi xét nghiệm định danh ở<br /> <br /> trình tự thu được có tính tương đồng gần<br /> <br /> mức độ phân tử. Riêng betacoronavirus là<br /> <br /> như tuyệt đối so với trình tự gen coronavirus<br /> <br /> một chủng virut đặc biệt nguy hiểm lây từ<br /> <br /> lưu trữ trên Ngân hàng NCBI (hình 2, panel<br /> <br /> lạc đà hoặc dơi sang người [4], chủng virut<br /> <br /> giữa và panel dưới).<br /> <br /> này gây các triệu chứng lâm sàng rất giống<br /> <br /> 3. Ngƣỡng phát hiện của PCR.<br /> Để xác định mật độ tối thiểu số bản copy<br /> ARN coronavirus mà tại đó xét nghiệm của<br /> chúng tôi có khả năng phát hiện được, tiến<br /> hành pha loãng đoạn ARN mã hóa cho gen<br /> Upstream coding region vào ARN tổng số tách<br /> được từ người khỏe mạnh ở những nồng độ<br /> khác nhau, sau đó tiến hành tách ARN tổng<br /> số dùng làm khuôn cho phản ứng phát hiện<br /> coronavirus. Kỹ thuật này nhằm tạo sản<br /> phẩm chứa ARN virut có nồng độ gần<br /> tương đồng khi BN nhiễm virut trên thực tế<br /> lâm sàng.<br /> <br /> hội chứng SARS. Tuy nhiên, ở nước ta chưa<br /> có cơ sở y tế nào công bố các công cụ chẩn<br /> đoán chủng virut nguy hiểm này [5].<br /> Thông thường, để phát hiện khẳng định<br /> một tác nhân gây bệnh mới, người ta phải<br /> khuếch đại đoạn gen đặc hiệu, sau đó tiến<br /> hành giải trình tự và so sánh với trình tự đã<br /> biết trên ngân hàng gen. Cách làm này chỉ<br /> phù hợp với những nghiên cứu khám phá<br /> chứ không phù hợp với quy trình chẩn đoán<br /> bệnh thường quy, do hội chứng viêm đường<br /> hô hấp do virut cúm bao gồm cả virut SARS<br /> và betacoronavirus thường có diễn biến cấp,<br /> BN được can thiệp và cách ly sớm, hạn chế<br /> nguy cơ lan rộng dịch ra cộng đồng. Vì vậy,<br /> để đạt được mục tiêu đó, việc chẩn đoán<br /> nhanh và chính xác betacoronavirus rất<br /> cần thiết. Cho đến nay, các quy trình<br /> chẩn đoán virut cúm nói chung như<br /> H1N1, H5N1, H7N9 đều hướng đến việc<br /> khuếch đại và phát hiện ít nhất 2 gen đích,<br /> việc chẩn đoán betacoronavirus cũng không<br /> nằm ngoại lệ. Trung tâm Lưu trữ virut châu<br /> <br /> Hình 3: Khả năng phát hiện ARN virut hòa<br /> loãng trong ARN người.<br /> <br /> 53<br /> <br /> Âu là tổ chức đầu tiên chuẩn hóa phương<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014<br /> <br /> pháp RT-PCR sử dụng đồng thời 2 gen<br /> <br /> thể nhiễm MERS-CoV nào, vì thế, để kiểm<br /> <br /> đích upE và open read-ing frame (ORF) 1b<br /> <br /> chứng phương pháp, chúng tôi cần nhiều<br /> <br /> gen làm đích phân tử [6]. Hơn nữa, do MERS-<br /> <br /> hơn nữa sự hợp tác với các trung tâm ngoại<br /> <br /> CoV là một chủng virut mới bùng phát, nên<br /> <br /> kiểm có uy tín của thế giới.<br /> <br /> ngoài phương pháp do Trung tâm Lưu trữ<br /> virut châu Âu đề xuất, các cơ quan kiểm<br /> dịch quan trọng khác trên thế giới như Tổ<br /> chức Y tế Thế giới, Cơ quan Kiểm soát<br /> bệnh Hoa Kỳ (CDC) chưa có khuyến cáo chi<br /> tiết về một phương pháp xét nghiệm cụ thể<br /> ở mức độ phân tử cho chủng virut độc này.<br /> Vì thế, Khoa Sinh học Phân tử, Bệnh viện<br /> TWQĐ 108 đã tiến hành hợp tác với EVA.<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Kỹ thuật RT-PCR với bộ mồi SHPT108<br /> @MERS-CoV-L, SHPT108@MERS-CoV-S<br /> có khả năng phát hiện được ARN coronavirrus ở<br /> mật độ 1 copy virut/1.000 copy ARN tổng số<br /> người khỏe mạnh. Kết quả thực nghiệm<br /> không tạo ra sản phẩm cADN phụ và không<br /> bắt cặp chéo vào các khu vực có tính tương<br /> đồng thấp của hệ gen người.<br /> <br /> Thông qua sự hợp tác này, 2 đoạn ARN mã<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> <br /> hóa 2 gen đích upE và open reading frame<br /> <br /> 1. Zaki AM et al. Isolation of a novel<br /> coronavirus from a man with pneumonia in Saudi<br /> Arabia. N Engl J Med. 2012, 367 (19), pp.18141820.<br /> <br /> (ORF) 1b gen đã được chuyển về Việt Nam<br /> an toàn, từ đây chúng tôi đã thiết lập được<br /> quy trình chẩn đoán betacoronavirus với độ<br /> nhạy kỹ thuật 1 copy ARN virut/1.000 copy<br /> ARN người khỏe mạnh (chúng tôi đã lặp lại<br /> ngưỡng này 91/95 lần thử nghiệm). Đặc<br /> biệt, ngay cả khi mẫu bệnh phẩm có nồng<br /> độ ARN MERS-CoV hoặc thậm chí không<br /> có<br /> <br /> MERS-CoV<br /> <br /> SHPT108@MERS-CoV<br /> <br /> ARN<br /> <br /> bộ<br /> cũng<br /> <br /> mồi<br /> không<br /> <br /> khuyếch đại bất đặc hiệu các đoạn gen<br /> người (từ 30 mẫu bệnh phẩm bạch cầu tủy<br /> mạn) hoặc đoạn gen ARN virut khác như<br /> HCV (50 mẫu), H1N1 (15 mẫu). Điều này<br /> thể hiện tính đặc hiệu cao của bộ mồi<br /> SHPT108@MERS-CoV. Tuy nhiên, đến<br /> nay Việt Nam chưa gặp trường hợp BN có<br /> <br /> 54<br /> <br /> 2. Van Boheemen S et al. Genomic<br /> characterization of a newly discovered<br /> coronavirus associated with acute respiratory<br /> distress syndrome in humans. MBio. 2012, 3<br /> (6).<br /> 3. Assiri A et al. Hospital outbreak of Middle<br /> East respiratory syndrome coronavirus. N Engl J<br /> Med. 2013.<br /> 4. Azhar EI et al. Evidence for camel-tohuman transmission of MERS coronavirus.<br /> N Engl J Med. 2014.<br /> 5. Hui DS, ZA Memish, A Zumla. Severe<br /> acute respiratory syndrome vs. the Middle<br /> East respiratory syndrome. Curr Opin Pulm<br /> Med. 2014.<br /> 6. Palm D et al. Laboratory capability for<br /> molecular detection and confirmation of novel<br /> coronavirus in Europe. November 2012. Euro<br /> Surveill. 2012, 17 (49).<br /> <br />