Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng selen huyết tương bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Định lượng selen huyết tương là xét nghiệm giúp đánh giá tình trạng selen của cơ thể. Đề tài được thực hiện nhằm xây dựng và thẩm định kỹ thuật định lượng trực tiếp selen huyết tương bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng selen huyết tương bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử

vietnam medical journal n02 - AUGUST - 2020 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SELEN HUYẾT TƯƠNG BẰNG QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ Nguyễn Đình Tuấn1, Trần Thị Chi Mai2 TÓM TẮT criteria. Conclusions: Method of determination of plasma selenium by atomic absorption 18 Định lượng selen huyết tương là xét nghiệm giúp spectrophotometry ensures reliability, can be applied đánh giá tình trạng selen của cơ thể. Mục tiêu: Đề in clinical practice. tài được thực hiện nhằm xây dựng và thẩm định kỹ Key words: Selenium, plasma, graphite furnace thuật định lượng trực tiếp selen huyết tương bằng atomic absorption spectrophotometry (GFAAS). phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện (GFAAS). Kết quả: Quy trình được xây dựng I. ĐẶT VẤN ĐỀ sử dụng phương pháp thêm chuẩn, dung dịch pha loãng mẫu gồm Trion X-100 0,05%, HNO3 2,5%; chất Selen (Se) là một trong những nguyên tố vi cải biến nền mẫu là palladi 0,1%. Giới hạn phát hiện lượng thiết yếu cho cơ thể, tình trạng Se thấp có và giới hạn định lượng của phương pháp tương ứng là liên quan đến việc tăng nguy cơ mắc các bệnh như 0,035µmol/L và 0,107µmol/L. Khoảng tuyến tính của ung thư và bệnh tim [1]. Nhiễm độc Se có thể xảy phương pháp là 0,1- 7,0mol/L. Độ lặp lại ở 2 mức ra khi nuốt phải cấp tính hoặc mãn tính lượng nồng độ 0,707 và 1,42(mol/L) lần lượt là 7,83 và Selen dư thừa. Các triệu chứng ngộ độc Selen bao 9,02 (%). Độ tái lặp ở 2 mức nồng độ trên lần lượt là 7,10 và 7,70 (%). Độ thu hồi của mẫu QC nằm trong gồm mất sắc tố da, rụng tóc, đổi màu móng hoặc giới hạn cho phép. Độ thu hồi mẫu thật thêm chuẩn là giòn, triệu chứng đường tiêu hóa, mệt mỏi, khó 93,3% và 99,7%, nằm trong khoảng 80- 110%; đạt chịu và bệnh lý thần kinh ngoại biên[2]. tiêu chuẩn AOAC 2012. Kết luận: Phương pháp định Mối quan hệ có thể giữa nồng độ Selen huyết lượng selen huyết tương bằng quang phổ hấp thụ tương và tần suất một số bệnh đã được công bố nguyên tử đảm bảo độ tin cậy, có thể áp dụng trong thực hành lâm sàng. [3]. Một số kỹ thuật đã được đề xuất để phân Từ khoá: selen, huyết tương, quang phổ hấp thụ tích Se, đặc biệt là trong các dịch sinh học[4]. nguyên tử sử dụng lò điện. Mặc dù phương pháp quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần kết nối khối phổ (ICP-MS) được SUMMARY xem như là kỹ thuật tin cậy, tuy nhiên nó không DEVELOPMENT AND VALIDATION OF phổ biến trong các phòng xét nghiệm y khoa do PLASMA SELENIUM MEASUREMENT BY chi phí thiết bị và vận hành cao. Hiện nay GRAPHITE FURNACE ATOMIC phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử ABSORPTION SPECTROPHOTOMETRY dụng lò điện (Graphite furnace atomic Quantification of plasma selenium is used to absorption spectrometry- GFAAS) là phương assess body selenium status. Aims: The study was aimed to develop and validate direct quantitative pháp được chấp nhận rộng rãi để định lượng plasma selenium technique by graphite furnace atomic selen huyết tương vì cho phép định lượng trực absorption spectrophotometry (GFAAS). Results: tiếp và chỉ cần lượng mẫu nhỏ. Tuy nhiên, có Sample preparation was performed as guiding by the nhiều khó khăn đã được công bố trong phương standard addition method and using the diluent with pháp đo lường trực tiếp do các trạng thái hóa trị Triton X-100 0.05% and HNO3 2,5%. The sample matrix modifier was 0.1% palladium. The LOD and khác nhau và đặc tính dễ bay hơi của selen [4,5]. LOQ the method were 0.035 µmol L and 0.110µmol/L Hơn nữa, các điều kiện thực nghiệm và các kết respectively. The linear range was 0.1-7 µmol/L. The quả thậm chí là đối ngược nhau khi thực hiện repeatability at concentrations of 0.707 and 1.42 định lượng Selen huyết tương bằng GFAAS do các (µmol/L) were 7.83 and 9.02 (%) respectively. The yếu tố nhiễu hóa học và nhiễu phổ [6]. Việc phát reproducibility at the two concentrations above were triển một phương pháp thường quy để định lượng respectively 7.10 and 7.70 (%). The recovery of QC samples was acceptable. The recovery of spiked trực tiếp selen huyết tương giúp đánh giá tình samples were 93.3% and 99.7%, fell in the range of trạng chất dinh dưỡng vi lượng- vấn đề còn chưa 80-110%; acceptable following the AOAC 2012 được quan tâm nhiều ở Việt Nam- là một việc làm cần thiết. Do đó đề tài này được thực hiện với 1Bệnh viện Nhi trung ương, mục tiêu: Xây dựng và thẩm định phương pháp 2Trường Đại học Y Hà Nội định lượng Selen huyết tương bằng phương pháp Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Đình Tuấn quang phổ hấp thụ nguyên tử. Email: tuannd@nhp.org.vn Ngày nhận bài: 2.7.2020 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Ngày phản biện khoa học: 4.8.2020 Nghiên cứu được tiến hành tại Khoa Sinh Ngày duyệt bài: 12.8.2020 hóa- Bệnh viện Nhi Trung Ương, từ tháng 78
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 493 - THÁNG 8 - SỐ 2 - 2020 8/2019 - 04/2020. các thông số mật độ quang (Abs), tín hiệu nền 2.1. Trang thiết bị và hóa chất. Máy (BG). Sau khi tìm ra chất cải biến tốt nhất, tiến quang phổ hấp thụ nguyên tử AA-7000 với lò hành đánh giá ảnh hưởng của lượng chất cải điện GFA-7000 và bộ hút mẫu tự động ASC-7000 biến nền mẫu và tìm ra lượng chất cải biến tối ưu. của Shimadzu. Chuẩn bị dung dịch pha loãng mẫu: Dung Dung dịch chuẩn selen 1g/L, axit nitric đặc dịch pha loãng mẫu bao gồm Triton X-100 và 65% của Merck, Triton X-100 của Sigma-Aldrich. HNO3. Nồng độ tối ưu của Triton X-100 và HNO3 Pd(NO3)2, Mg(NO3)2, dung dịch Ni(NO3)2 0,1%( được khảo sát để chọn ra mức tối ưu: Sử dụng w/v) và dung dịch Pd(Cl)2 0,1% (w/v) của Merck. QC 2 mức, mỗi mẫu chạy lặp lại 3 lần. Đánh giá Khí Argon 99,999%, nước khử ion. Mẫu chứng sự ảnh hưởng của nồng độ Triton X-100, HNO3 Serum control lyophilized for trace element- qua các thông số mật độ quang (Abs), tín hiệu ClinCheck 2 mức của Recipe. Mẫu huyết tương nền (BG) và giá trị các mẫu QC thu được. thừa của bệnh nhân sau khi làm xét nghiệm. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và mẫu đo: Mẫu Nguyên lý kỹ thuật phương pháp định lượng QC hoặc huyết tương được pha loãng 10 lần selen bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử sử bằng dung dịch pha loãng mẫu tối ưu chuẩn bị ở dụng lò điện: Một lượng nhỏ mẫu được hóa hơi trên. Các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ và nguyên tử hóa ở nhiệt độ cao trong ống Se 0,5; 1; 2µmol/L pha trong acid HNO3 1%. graphit. Các nguyên tử Se tự do sinh ra trong ống Phương pháp chuẩn được áp dụng là phương graphit hấp thụ tia sáng đơn sắc từ đèn catot pháp thêm chuẩn (standard addition method) do rỗng tạo thành phổ hấp thụ nguyên tử và được nền mẫu và đặc tính phức tạp của kỹ thuật định xác định bởi detector nhân quang điện. Việc định lượng trực tiếp selen trong huyết tương. Cài đặt lượng Selen trong mẫu được thực hiện với một bộ bơm mẫu tự động hút 10 µL mẫu pha loãng đường chuẩn xây dựng từ một dãy dung dịch và 5 µL chất cải biến nền mẫu (lượng tối ưu có chuẩn được chuẩn bị song song với mỗi mẻ mẫu. được sau thực nghiệm đánh giá). 2.2. Quy trình kỹ thuật. Điều kiện phân 2.3. Thẩm định phương pháp: các thông tích selen trên thiết bị AA-7000 tham khảo sách số thẩm định được áp dụng theo hướng dẫn của Cookbook của Shimadzhu. Cường độ dòng đèn ICH [7] và AOAC 2012 [8]. catot rỗng Se là 10 mA, độ rộng khe đo là 0,7 - Giới hạn phát hiện (Limit of detection - nm, chế độ bổ chính nền là Background LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương correction-deterium (BGC-D2), Pyrolysis graphite pháp được đánh giá theo hướng dẫn của tube, thể tích tiêm mẫu là 10 µL. ICH.LOD = 3,3 /s, LOQ=10 /s, trong đó  là Chương trình lò điện được trình bày trong độ lệch chuẩn của đường hồi quy (của đường bảng sau: (tham khảo công bố của Myriam và chuẩn) và s là độ dốc của phương trình hồi quy. cộng sự [6] sử dụng thiết bị AA-6800 của - Khoảng tuyến tính của phương pháp Shimadzhu). Chuẩn bị dung dịch làm việc có nồng độ Se Phương Tốc độ khí 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 mol/L, sau đó pha Nhiệt độ Thời gian Bước pháp gia argon loãng theo tỉ lệ 1:10 trong dung dịch pha loãng. ( C) o (giây) nhiệt (mL/phút) Tiến hành đo lặp lại mỗi dung dịch 3 lần. Tính 1 80 5 RAMP 0.1 2 80 10 RAMP 0.1 giá trị mật độ quang trung bình của mỗi nồng 3 120 10 RAMP 0.1 độ. Xây dựng phương trình tương quan giữa mật 4 120 20 RAMP 0.1 độ quang và nồng độ, nếu hệ số r của phương 5 650 10 RAMP 1.0 trình này ≥0,995 tức là phương pháp tuyến tính 6 650 10 STEP 1.0 đến mức nồng độ được khảo sát. 7 1070 10 RAMP 1.0 - Đánh giá độ chụm (Precision) 8 1070 15 STEP 1.0 Tiến hành đánh giá độ lặp lại (repeatability) 9 1070 3 STEP 0 và độ tái lặp (intermediate repeatability). Sử 10 2270 5 0 dụng mẫu QC 2 mức nồng độ QC1, QC2. Độ lặp 11 24400 2 1.0 lại: Tiến hành phân tích trong cùng một mẻ 10 Tối ưu hóa quy trình kỹ thuật lần lặp lại cho mỗi mẫu QC. Độ tái lặp: Tiến Dung dịch cải biến nền mẫu: sử dụng ba loại hành phân tích trong 10 ngày khác nhau, mỗi dung dịch Pd(NO3)2 0,1% và Mg(NO3)2 0,02%, ngày lặp lại 1 lần cho mỗi mức. Tính TB, SD, độ dung dịch Ni(NO3)2 0,1%( w/v) và dung dịch lệch chuẩn tương đối (RSD hay CV) tại mỗi nồng Pd(Cl)2 0,1% (w/v). Đánh giá sự ảnh hưởng của độ. Độ lệch chuẩn tương đối được so sánh với chất cải biến nền mẫu (3 dung dịch trên) qua tiêu chuẩn cho phép của AOAC 2012. 79
vietnam medical journal n02 - AUGUST - 2020 - Đánh giá độ chính xác (Accuracy). Độ pháp định lượng selen trong các mẫu huyết tương. chính xác của phương pháp được xác định bằng Bảng 1. Kết quả xác định LOD và LOQ độ thu hồi của mẫu QC mức 1, 2 và độ thu hồi của phương pháp của mẫu bệnh nhân thêm chuẩn. Mỗi nồng độ Phương trình tương Mật độ quang= 0,6626 chuẩn bị 10 mẫu đo. Độ thu hồi thêm chuẩn quan x nồng độ + 0,0937 được tính theo công thức sau: Hệ số tương quan r 0,991 % thu hồi = (Cs – C) x 100/Ca; trong đó: Cs là Độ lệch chuẩn của nồng độ đo được trong mẫu thêm chuẩn, C là 0,0071 đường hồi quy nồng độ đo được trong mẫu không thêm chuẩn, (3,3 x 0,071)/0,6626= Ca là nồng độ chuẩn thêm vào. Độ thu hồi được LOD (µmol/L) 0,035 so sánh với tiêu chuẩn của AOAC 2012. (10 x 0,071)/0,6626= 2.4 Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý trên LOQ (µmol/L) 0,107 công cụ Excel của Microsoft Office. Kết quả từ Bảng 1 cho thấy phương pháp III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU phân tích Se huyết tương có giới hạn phát hiện 3.1. Tối ưu hóa phương pháp định lượng (LOD) và giới hạn định lượng tương ứng là 0,035 trực tiếp selen huyết tương bằng quang và 0,107 µmol/L. phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện. Các thực nghiệm tối ưu hóa cho thấy chất cải biến nền mẫu tốt nhất là dung dịch Palladi 1%, lượng chất cải biến tối ưu là 5 uL. Nồng độ tối ưu của Triton X-100 là 0,05% và HNO3 là 2,5% (v.v). Do vậy dung dịch pha loãng mẫu được lựa chọn gồm: 0,05% Triton X-100, 2,5% HNO3. 3.2. Thẩm định phương pháp định lượng trực tiếp selen huyết tương bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng lò điện Hình 2. Khoảng tuyến tính của phương pháp Hình 2 biểu diễn khoảng tuyến tính của phép đo khi nồng độ của selen tăng dần từ 0 đến 7 mol/L. Kết quả cho thấy khoảng tuyến tính của phép đo thu được trong khoảng 0,1- 7 mol/L, phương trình tương quan là y= 0,064253x + 0,10483. Hệ số tương quan r là 0,9989 (>0.95). Bảng 2. Đánh giá độ chụm của phương pháp Mẫu QC1 QC2 Trung bình (µmol/L) 0,664 1,463 Độ lặp lại SD (µmol/L) 0,052 0,132 (n=20) Hình 1. Đường chuẩn của phương pháp CV (%) 7,83 9,02 Hình 1 là đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc Trung bình (µmol/L) 0,676 1,415 Độ tái lặp của mật độ quang vào nồng độ của selen trong SD (µmol/L) 0,048 0,109 (n=20) các mẫu chuẩn có nồng độ tăng dần (0; 0.5; 1 CV (%) 7,10 7,70 and 2mol/L). Sử dụng phương pháp bình Theo tiêu chuẩn đánh giá của AOAC, đối với phương tối thiểu thu được phương trình tương nồng độ chất phân tích là 10, 100 và 1000 (µg/L) quan của mật độ quang với nồng độ chuẩn là y = thì CV tối đa cho phép là 21, 15, 11(%). Kết quả 0.072x + 0.099, hệ số tương quan r là 0.9996 từ Bảng 2 cho thấy hai mẫu phân tích trong thí (>0,95). Hệ số tương quan có giá trị là 0.9996 nghiệm này có nồng độ selen trong khoảng 44,7 cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính giữa mật độ – 135 µg/L (0,566- 1,71 µmol/L), như vậy độ lặp quang và nồng độ selen trong khoảng khảo sát, lại và độ tái lặp thu được là chấp nhận được. đây là cơ sở cho phép chúng tôi xây dựng phương Bảng 3. Độ thu hồi mẫu QC Mẫu QC Nồng độ TB đo Nồng độ mẫu QC theo nhà sản xuất CV (%) (n=20) được (µmol/L) Trung bình (µmol/L) Khoảng cho phép (µmol/L) QC 1 0,676 7,10 0,707 0,566 - 0,849 QC 2 1,415 7,70 1,42 1,14 - 1,71 Kết quả phân tích cho thấy nồng độ selen trung bình đo được khá sát với giá trị trung bình công 80
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 493 - THÁNG 8 - SỐ 2 - 2020 bố của nhà sản xuất (bảng 3), các giá trị đo được đều nằm trong khoảng giới han cho phép. Bảng 4. Độ thu hồi mẫu thật thêm chuẩn Nồng độ chuẩn Selen thêm vào (µmol/L) 1,0 5,0 Nồng độ Selen trung bình đo được trong mẫu không thêm chuẩn (n = 10) (µmol/L) 0,92 1,12 Nồng độ Selen trung bình đo được trong mẫu thêm chuẩn (n = 10) (µmol/L) 1,85 6,10 CV (%) 6,86 3,87 Độ thu hồi trung bình (%) 93,3 99,7 Tiêu chuẩn AOAC (%) 80 – 110 Độ thu hồi mẫu thêm chuẩn đo được của cả hai mức nồng độ đều nằm trong khoảng cho phép theo tiêu chuẩn AOAC. IV. BÀN LUẬN Sau khi tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm, Mối quan hệ giữa nồng độ selen huyết tương phương pháp được đánh giá các đặc tính kỹ và tình trạng ngộ độc selen, hay đặc biệt là tình thuật. Kết quả thẩm định cho thấy độ chụm của trạng thiếu selen đã được thừa nhận [2,3,6]. phương pháp đạt tiêu chuẩn của AOAC 2016. Khi Phương pháp định lượng selen trực tiếp trong so sánh với các nghiên cứu định lượng selen huyết tương bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử huyết tương bằng GFAAS, độ chụm của nghiên (GFAAS) có thể bị ảnh hưởng bởi các vấn đề về cứu này là tương tự [3,4,5,6]. nền mẫu phức tạp, mất mát trong quá trình tiền Do không có các vật liệu tham chiếu, trong nguyên tử hóa, nhiễu quang phổ. Do vậy, việc nghiên cứu này độ chính xác của phương pháp xây dựng một phương pháp định lượng trực tiếp được đánh giá thông qua độ thu hồi của mẫu QC selen huyết tương bằng GFAAS đơn giản, chính và mẫu thật thêm chuẩn. Độ thu hồi cho thấy xác, nhanh chóng, thường quy là việc làm cần phương pháp có độ chính xác cao. Ở cả 2 mức thiết. Chất cải biến nền mẫu được đưa vào lò nồng độ thấp và cao, độ thu hồi đều nằm trong điện cùng với mẫu để tăng hiệu quả của quá giới hạn cho phép. Kết quả này tương đồng với trình phân tách chất phân tích bằng nhiệt trong kết quả đánh giá độ thu hồi của phương pháp giai đoạn tro hóa mẫu, ổn định chất phân tích, định lượng selen trong huyết tương của một số loại bỏ nền mẫu khi mẫu hóa hơi, giảm thiểu yếu nghiên cứu đã công bố [3,4,5,6]. tố nhiễu và cải thiện quá trình nguyên tử hóa. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của Nghiên cứu của Myriam và cộng sự tối ưu hóa phương pháp tương ứng là 0,035 µmol/L và phương pháp định lượng selen trên máy AA- 0,107µmol/L; đáp ứng với yêu cầu về phép định 6800 của Shimadzhu cho thấy Ni là chất cải biến lượng slen huyết tương phải có giới hạn phát nền mẫu tốt nhất, giá lại rẻ [6]. Tuy nhiên, khi hiện ít nhất là 0,1µmol/L khi dùng 50- 200µL tiến hành trên hệ thống AA-7000 tại khoa xét huyết tương [4]. Giới hạn này cũng thấp hơn nghiệm của chúng tôi, Ni không phải là chất cải nhiều so với ngưỡng 0,3µmol/L ở người trưởng biến để phép đo có độ chụm tốt. Do vậy, chúng thành đòi hỏi phải bổ sung Se [4]. Khoảng tuyến tôi đã lựa chọn thêm hai loại chất cải biến nền tính của đường chuẩn phương pháp là từ 0,1 mẫu là Pd(NO3)2 kết hợp với Mg(NO3)2 và dung đến 7,0µmol/L, do vậy khoảng báo cáo kết quả dịch Palladi 0,1%. Đây là các chất được đánh giá rộng, thích hợp cho việc đánh giá kết quả ngộ là phù hợp trong nhiều nghiên cứu [4]. Kết quả độc selen. đánh giá ảnh hưởng của chất cải biến nền mẫu cho thấy dung dịch Palladi 0,1% cho hiệu quả tốt V. KẾT LUẬN nhất và lượng tối ưu đưa vào ống graphit là 5 uL. Phương pháp định lượng trực tiếp selen Tiếp đó nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng huyết tương với chất cải biến nền mẫu là dung của nồng độ Triton X-100 và HNO3 trong dung dịch palladi trên máy quang phổ hấp thụ nguyên dịch pha loãng mẫu. Triton X-100 là chất hoạt tử AAS-7000 của Shimadzhu đã được tối ưu và động bề mặt (surfactant) hay dùng nhất cho pha thẩm định. Kết quả cho thấy phương pháp đảm loãng dịch sinh học. HNO3 trong dung dịch pha bảo độ tin cậy, có thể đưa vào áp dụng trong loãng mẫu có vai trò quan trọng trong ổn định thực hành lâm sàng selen trong quá trình phân tích. Kết quả cho thấy Lời cảm ơn. Nhóm nghiên cứu xin cảm ơn Khoa nồng độ triton-X 100 là 0,05% và HNO3 2,5% Sinh hóa, Bệnh viện Nhi trung ương đã hỗ trợ triển cho mật độ quang tốt nhất; kết quả QC cả 2 khai các thực nghiệm trong nghiên cứu này. mức đều nằm trong giới hạn cho phép. Mức TÀI LIỆU THAM KHẢO nồng độ 2 thành phần này cũng phù hợp với 1. A. Shenkin (2006). Micronutrients in health and nghiên cứu một số tác giả khác [6, 9]. disease. Postgrad Med J., 82 (971), 559–567. 81