Ảnh hưởng của các liều heat shock protein lên các thông số miễn dịch của tôm sú

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:12

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của các liều khác nhau của protein sốc nhiệt ly trích từ vi khuẩn (DnaK) lên đáp ứng miễn dịch của tôm sú. Khả năng đáp ứng miễn dịch của tôm được kiểm tra bằng phản ứng Phenoloxidase thực hiện trên cuvet, so màu bằng quang phổ kế ở bước sóng 492nm và phản ứng định lượng Real-time PCR.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ảnh hưởng của các liều heat shock protein lên các thông số miễn dịch của tôm sú

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LIỀU HEAT SHOCK PROTEIN LÊN CÁC THÔNG SỐ MIỄN DỊCH CỦA TÔM SÚ Lê Hồng Phước1*, Nguyễn Hồng Lộc1, Nguyễn Thị Hiền1, Võ Hồng Phượng1 TÓM TẮT Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của các liều khác nhau của protein sốc nhiệt ly trích từ vi khuẩn (DnaK) lên đáp ứng miễn dịch của tôm sú. Khả năng đáp ứng miễn dịch của tôm được kiểm tra bằng phản ứng Phenoloxidase thực hiện trên cuvet, so màu bằng quang phổ kế ở bước sóng 492nm và phản ứng định lượng Real-time PCR. DnaK được ly trích từ chủng vi khuẩn E. coli có khả năng biểu hiện DnaK gắn với hexahistidine sau đó được tinh sạch bằng bộ kít dưới tác dụng của các hạt từ Dynabead. Lượng DnaK ly trích được kiểm tra bằng phương pháp Bradford. DnaK sau đó được trộn với dung dịch đệm nạp mẫu và điện di trên bản gel 10% SDS-PAGE. Gel sau khi điện di được nhuộm với Bio-safe Coomassie stain (phản ứng SDS-PAGE) hoặc chuyển qua màng lai cho phản ứng với kháng thể đặc hiệu cho DnaK (phản ứng Western Blot). Tôm sú có trọng lượng trung bình 10-12g được tiêm với các liều khác nhau của DnaK (2, 4, 6, 8, 10 hoặc 15µg/tôm), máu tôm được thu ở các thời điểm 2, 4, 7 và 10 giờ sau khi tiêm DnaK. Biểu hiện của gen prophenoloxidase được kiểm tra bằng phản ứng định lượng real-time PCR. Tôm được tiêm với 8 hoặc 10 µg DnaK làm tăng biểu hiện của Prophenoloxidase (proPO) tại thời điểm 2 và 4 giờ sau khi tiêm và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức khác (p < 0,05). Kết quả này cho phép kết luận DnaK có khả năng điều khiển đáp ứng miễn dịch trên tôm sú. Từ khóa: DnaK, tôm sú, HSP70, prophenoloxidase. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu gần đây cho thấy nhiệt độ gây Heat shock protein (Protein sốc nhiệt hay sốc không gây chết kích thích sinh ra lượng HSP Hsp) là loại protein được sinh trong quá trình làm tăng khả năng đáp ứng với hiện tượng nhiễm sốc do nhiệt hoặc do các yếu tố khác như thay khuẩn của động vật không xương sống (Singh và đổi đột ngột các yếu tố môi trường sống (pH, Aballay, 2006). Theo Campisi và ctv., (2003), khi độ mặn,...). Hsp được Ritossa khám phá đầu tiếp xúc với các yếu tố gây sốc mạnh sẽ làm tăng tiên vào năm 1962 trên ruồi dấm Drosophila cường Hsp72 ở chuột. Đây được xem là một dấu melanogaster. Tuy nhiên, mãi đến năm 1974 thì hiệu báo động kích thích các phân tử NO hoạt mới có tên gọi chính thức là Hsp. Theo Lindquist động để chống lại vi khuẩn và làm tăng cường và Craig (1988), HSP được tìm thấy trên hầu hết khả năng phục hồi từ nhiễm khuẩn. các cơ thể sinh vật. Hsp chiếm từ 5-10% trên Nghiên cứu trên cá hồi, Sergio và ctv., tổng protein của tế bào bình thường và có thể (2007) tìm thấy tiềm năng của Hsp như là kháng tăng lên gấp 2-3 lần khi gặp phải các yếu tố gây nguyên kích thích sinh miễn dịch. Kết quả kiểm sốc như nóng, lạnh, thiếu dinh dưỡng, thiếu ôxy tra bằng phản ứng ELISA cho thấy kháng thể hoặc là nhiễm bệnh (Pockley, 2003). Căn cứ trên trong huyết thanh của cá nhiễm Piscirickettsia trọng lượng phân tử, HSP được phân làm nhiều salmonis cho phản ứng dương tính với Hsp được nhóm như Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90,...Một trích từ loài vi khuẩn này. Do đó nhóm nghiên trong những nhóm Hsp được nghiên cứu nhiều cứu này cho rằng Hsp có thể được sử dụng như là Hsp70. là vaccine để kích thích sinh kháng thể. Trung Tâm Quan Trắc Môi Trường & Bệnh Thủy Sản Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 *Email: lehongphuoc@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 25
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Hsp đã được nghiên cứu ở lĩnh vực bệnh khuẩn (DnaK) lên khả năng đáp ứng miễn dịch trên đối tượng thủy sản thông qua việc sử dụng của tôm sú ấu trùng Artemia franciscana nuôi trong điều II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP kiện vô trùng như là một mô hình mẫu để gây NGHIÊN CỨU bệnh thực nghiệm với vi khuẩn. Quy trình sốc 2.1. Ly trích và tinh sạch DnaK nhiệt không gây chết nhưng có tác dụng kích thích sản sinh Hsp70 ở Artemia đã được tối ưu DnaK được ly trích và tinh sạch từ chủng hóa. Cụ thể là ấu trùng Artemia nuôi ở 28°C vi khuẩn E. coli có khả năng biểu hiện DnaK khi được gây sốc ở 37°C trong 30 phút sau đó gắn với hexahistidine. Bước đầu tiên của ly là 6 giờ cho khoảng thời gian hồi phục rồi kiểm trích DnaK là cấy E. coli từ ống giữ giống lên tra khả năng đề kháng của Artemia đã được gây đĩa thạch Luria-Bertani (LB) và ủ ở 37°C trong sốc với Vibrio campbellii. Kết quả cho thấy quy 24 giờ sau đó chọn khuẩn lạc và cấy tăng sinh trình này tăng cường khả năng kháng Vibrios trên môi trường lỏng LB đến pha log (mật độ gây bệnh trên ấu trùng Artemia được gây sốc quang OD600 nm = 0,4 - 0,6). Việc kích thích sinh nhiệt. Tỷ lệ sống tăng gấp đôi ở nhóm được gây DnaK protein được thực hiện bằng cách thêm sốc nhiệt so với nhóm đối chứng chứng tỏ rằng đường L-arabinose (0,5 mg/ml) sau đó tiếp tục Hsp70 có vai trò bảo vệ Artemia đối với tác ủ ở 37°C trong 4 giờ. Toàn bộ vi khuẩn tăng nhân gây bệnh (Yeong và ctv., 2007, 2008). sinh được chuyển qua ống falcon vô trùng ly tâm ở 2.200g trong 15 phút, thu cặn hòa vào Ảnh hưởng của Hsp70 lên khả năng bảo dung dịch đệm Phosphate-Buffered Saline 1X hộ của Artemia đối với Vibrio được thực hiện (PBS, pH = 7,2, Sigma-Aldrich). Vi khuẩn bị thông qua việc khảo sát hàm lượng và hoạt động làm vỡ tế bào và đồng nhất bằng dập mẫu mini của phenoloxidase (Baruah và ctv., 2010). Kết beadsbeater (Biospec, USA) rồi ly tâm ở 2.200 quả cho thấy PO sinh ra sau khi cho Artemia g trong 1 phút ở 4°C, thu dịch nổi để tinh sạch ăn E. coli siêu tổng hợp Artemia-Hsp70 thấp DnaK bằng bộ kít dưới tác dụng của các hạt từ và tương đương với nhóm chỉ cho tiếp xúc với Dynabeads (Dynabeads® His-Tag Isolation và Vibrio. Tuy nhiên, việc kết hợp cả 2 yếu tố dẫn Pull down, Invitrogen). DnaK tinh sạch được đến việc tăng cường hoạt động PO, kết quả kiểm tra bằng phương pháp SDS-PAGE và tương thích với lượng RNA thông tin (bằng kỹ Western Blot. thuật RT-PCR). Từ các kết quả này cho thấy hệ thống miễn dịch có thể trước tiên được hoạt hoá 2.2. Phương pháp xác định hàm lượng bằng Hsp70, sau đó được kích thích tối đa tại protein thời điểm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh. Điều Xác định hàm lượng protein được thực này cho thấy khả năng đạt được tình trạng hoạt hiện theo quy trình Quick StartTM Bradford hóa của hệ miễn dịch có thể tồn tại và là một đặc Protein Assay (BIO-RAD). Máu chứa enzym điểm quan trọng ở vật nuôi thủy sản. Quy trình phenoloxidase được pha loãng với nước cất, hoạt hóa hệ thống miễn dịch lần đầu tiên được lấy 100µL máu pha loãng cho vào một cuvet thực hiện trên động vật nuôi thủy sản cụ thể là 1ml, thêm 1ml dung dịch Bradford, trộn tôm sú, nếu thành công sẽ có khả năng ứng dụng đều và ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút. Đo OD cho chương trình chọn giống tôm sú dựa vào bằng pháy quang phổ (Smart SpecTM Plus tính trạng kháng bệnh. Spectrophotometer) ở bước sóng 595nm. Nồng Mục đích của nghiên cứu này là kiểm tra độ protein chứa trong mẫu được xác định dựa ảnh hưởng của protein sốc nhiệt ly trích từ vi theo đường chuẩn y = 0,0299x + 0,0128 được 26 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 xây dựng bởi nhóm tác giả thực hiện dự án 2.3. Phương pháp SDS-PAGE và về HSP trong đó có nội dung nghiên cứu của Western Blot bài viết này. Đối với mẫu DnaK được tinh Phương pháp SDS-PAGE được ứng dụng sạch tiến hành đo hàm lượng protein tương theo Yeong và ctv., (2008) và Baruah và ctv., (2010). Toàn bộ quy trình phản ứng SDS-PAGE tự như trên. và Western Blot được tóm tắt như sau: Sau khi nhuộm xong với kháng thể thứ đơn dòng 8E2/2 được điều chế từ chuột kháng hai, rửa màng lai 2 lần bằng Trissaline và 1 lần lại DnaK với độ pha loãng 1:1000 (Stressgen bằng 0,1M Trissaline. Cuối cùng nhuộm màng Bioreagents). Kháng thể thứ hai là Horseradish lai bằng diamino benzidine tetrahydrochloride peroxidase conjugated donkey anti-mouse IgG dehydrate (DAB) có sự hiện diện của H2O2. với độ pha loãng là 1:2500 (Affinity BioReagents Ghi chú: Kháng thể thứ nhất là kháng thể Inc., Golden,CO). TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 27
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 2.4. Phản ứng Phenoloxidase (PO assay) T0646) như là chất xúc tác. 200 µl HLS được Phản ứng được tham khảo có bổ sung từ ủ với 200 µL 0,1% trypsin trong CAC buffer ở Ji và ctv., (2009). Trước hết là chuẩn bị dịch nhiệt độ phòng trong 30 phút sau đó thêm 200 chiết từ tế bào máu bị phá vỡ haemocyte lysate µL of L-DOPA 0,3% trong CAC. Mỗi phản ứng supernatant (HLS). Máu tôm sau khi lấy được được thêm vào 600 µL CAC buffer và trộn đều ly tâm 800g trong 10 phút ở 4oC. Thu phần cặn sau đó đo OD ở bước sóng 492 nm. tế bào và rửa bằng dung dịch đệm PBS sau đó 2.5. Phản ứng Realtime-PCR với mồi hòa với 0,6 ml dung dịch đệm được giữ lạnh proPO cacodylate-citrate buffer rồi ly tâm lần nữa. Thu Theo Liu và ctv., (2006) có thể sử dụng hai cặn tế bào và hòa vào 0,6 ml cacodylate (CAC) cặp mồi proPO.Pm và β-actin để xác định biểu buffer, ly tâm 15.000g trong 20 phút ở 4oC, thu hiện của gen đích proPO và tham chiếu β-actin dịch nổi chính là HLS. Lượng Phenoloxidase ở tôm sú. Vì vậy, trong phần nghiên cứu này hoạt hóa trong HLS được xác định bằng chúng tôi phát triển quy trình này nhằm mục quang phổ kế bằng cách cho L-DOPA (L-3,4- đích lựa chọn quy trình thích hợp hơn cho các dihydroxyphenylalanine, Sigma,USA) như thí nghiệm tiếp theo. Trình tự mồi được mô tả là chất nền và trypsin (Sigma, USA, cat. no. chi tiết ở Bảng 1 Bảng 1. Trình tự mồi proPO Gen Mã số trong ngân hàng gen Trình tự mồi Prophenoloxidase AF521948 F- CGACTCCTGGATGCCATACAT (proPO) R- CATCGCGAAGAGGAACTTTGT AF100986 F- CACCACCGCTGAACGAGAA β-Actin R-AAGGGCGACATAGCAAAGTTTC Thành phần phản ứng realtime PCR: Chu trình nhiệt độ chảy: 2X SYBR Master Mix (Promega) 12,5µl 95oC/ 1 phút F primer 1µl 55oC/ 1 phút R primer 1µl Tăng nhiệt độ từ 55oC lên 95oC trong 80 DND/RNA free water 8,5µl bước, mỗi bước tăng 0,5oC trong 10 giây. cDNA mẫu 2 Tính giá trị ∆CT gen đích = CT mẫu thử - CT mẫu đối chứng (CT là số chu kỳ mà tại đó Chu trình nhiệt: tín hiệu huỳnh quang bắt đầu vượt qua giá trị threshold). Nếu quy trình qPCR có lặp lại thì 50oC/ 2 phút tính giá trị trung bình ∆CT gen đích. Thực hiện 95oC/10 phút tương tự để được giá trị trung bình ∆CT gen 95oC/15 giây tham chiếu. 35 chu kỳ 60oC/1 phút Tính giá trị ∆∆CT = trung bình ∆CTgen 95 C/5 phút o đích - trung bình ∆CT gen tham chiếu Tỉ lệ biểu hiện gen (R) = 2-∆∆CT 28 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 2.6. Bố trí thí nghiệm còn thực hiện phản ứng định lượng RT-PCR từ Thí nghiệm có 7 nghiệm thức gồm một máu tôm thu được. nghiệm thức đối chứng và 6 nghiệm thức tiêm III. KẾT QUẢ với 6 nồng độ Hsp70 (2, 4, 6, 8, 10, 15 µg/0,2 3.1. Ly trích DnaK ml/tôm). Mỗi nghiệm thức gồm 5 tôm có trọng lượng trung bình 10-12 g ở mỗi thời điểm thu DnaK được tinh sạch bằng bộ kít dưới tác mẫu. Thu máu tại 4 thời điểm 2, 4, 7 và 10 dụng của các hạt từ Dynabeads (Dynabeads® giờ sau khi tiêm DnaK. Thực hiện phản ứng His-Tag Isolation & Pull down, Invitrogen) phenoloxidase đọc bằng quang phổ kế theo được mô tả cụ thể trong phần phương pháp. phương pháp trình bày ở phần trên. Ngoài ra Hình 1. Tinh sạch DnaK bằng các hạt từ Hình 2. Bước cuối cùng của tinh sạch trong eppendroff (qua lọc và ly tâm) Xác định hàm lượng protein của DnaK được làm cơ sở cho phản ứng SDS-PAGE và Western tinh sạch dựa theo quy trình Quick StartTM Blot. Kết quả ly trích và tinh sạch thu được Bradford Protein Assay (BIO-RAD). Việc định lượng DnaK với nồng độ thông thường từ 1-2 lượng protein trong DnaK được tinh sạch dùng µg/µl. Hình 3. Chuyển bản gel sau khi điện di SDS- Hình 4. Bản gel sau khi ghép với màng lai PAGE lên màng lai để thực hiện phản ứng được vào bồn điện di để thực hiện phản ứng Western Blot Western Blot TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 29
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Hình 5. Kết quả điện di SDS-PAGE của DnaK được sản sinh từ E. coli (1µg DnaK tinh sạch được điện di và nhuộm với Commassie Biosafe; M = thang protein) (hình trái). DnaK được xác định sau khi thực hiện phản ứng Western Blot (hình phải) 3.2. Ảnh hưởng của các liều DnaK lên đáp ứng miễn dịch của tôm sú 3.2.1. Kết quả phản ứng PO assay khi với quy trình của Baruah và ctv., (2011) với quy tiêm tôm sú với các liều DnaK khác nhau trình tương tự nhưng trên đối tượng là Artemia. Kiểm tra phản ứng phenoloxidase bằng Các tác giả này khi thực hiện PO assay đo OD phản ứng tạo màu đo bằng quang phổ kế ở bước bằng máy đọc ELISA. Tuy nhiên cũng có tác sóng 492nm. Máu tôm sau khi thu được chứa giả thực hiện phản ứng trên cuvet đơn và đo OD trong eppendroff và giữ lạnh (Hình 6) sau đó bằng máy quang phổ (Sritunyalucksana và ctv., tiến hành ly tâm thu cặn tế bào và thực hiện các 1999; Sung và ctv., 1998) nghiên cứu trên tôm bước làm vỡ tế bào như mô tả ở phần phương sú và tôm càng xanh. Về cơ bản PO assay được pháp. Cuối cùng thực hiện phản ứng PO assay trong cuvet (Hình 7). Trong nghiên cứu này, thực hiện nhờ L-DOPA và dung dịch đệm (có PO assay được tham khảo có bổ sung và so sánh thể là đệm citrate hoặc Tris saline buffer). Hình 6. Máu tôm được thu và chứa trong dung Hình 7. Phản ứng PO assay được thực hiện dịch kháng đông, giữ lạnh trong cuvet 30 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 Ở thời điểm 2 giờ sau khi tiêm DnaK có thức tiêm 10µg DnaK có phenoloxidase tăng ở sự tăng nhẹ của phenoloxidase ở nghiệm thức cả 2 thời điểm thu mẫu 2 và 4 giờ. Tuy nhiên, tiêm 8, 10 và 15µg protein, các liều tiêm còn việc tăng giảm phenoloxidase ở các nghiệm lại có phenoloxidase tăng rất ít và không khác thức chưa có sự khác biệt rõ rệt. Chính vì vậy, nhiều so với đối chứng (Đồ thị 1). Khuynh phản ứng định lượng bằng realtime PCR cần hướng này cũng được ghi nhận ở lần thí được thực hiện để xem biến động về mặt định nghiệm thứ 2 (Đồ thị 2). Ở các thời điểm 7 và lượng ở các nghiệm thức theo các thời gian 10 giờ sau khi tiêm DnaK, hầu hết các nghiệm thu mẫu khác nhau như thế nào (Kết quả được thức tiêm DnaK có biến động phenoloxidase trình bày ở phần sau). gần bằng với nghiệm thức đối chứng. Nghiệm Đồ thị 1. Biến động lượng phenoloxidase sau khi tiêm DnaK liều 2, 4, 6, 8, 10 và 15 µg/tôm (thí nghiệm 1) Đồ thị 2. Biến động lượng phenoloxidase sau khi tiêm DnaK liều 2, 4, 6, 8, 10 và 15 µg/tôm (thí nghiệm 2) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 31
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 3.2.2. Kết quả định lượng phenoloxidase thức tiêm 8 và 10 µg DnaK. Sự khác biệt này bằng RT-PCR trên máu tôm thu sau khi tiêm còn được tìm thấy ở thời điểm 4 giờ. Tuy nhiên với các liều khác nhau của DnaK ở các thời điểm 7 và 10 giờ không tìm thấy sự Kết quả ở Đồ thị 3 cho thấy ở thời điểm 2 khác biệt về tỷ lệ biểu hiện mRNA ProPO ở các giờ sau khi tiêm DnaK có sự gia tăng đáng kể nghiệm thức. Ở lần thí nghiệm thứ hai cũng cho (gấp 4 lần so với đối chứng) của PO ở nghiệm khuynh hướng tương tự (Đồ thị 4) Đồ thị 3. Kết quả định lượng PO bằng RT-PCR sau khi tiêm tôm với các liều khác nhau của DnaK (thí nghiệm 1) Đồ thị 4. Kết quả định lượng PO bằng RT-PCR sau khi tiêm tôm với các liều khác nhau của DnaK (thí nghiệm 2) 32 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 IV. THẢO LUẬN cứu này cho thấy rằng Hsp70 có nguồn gốc từ Hsp70 là một loại protein được nhận định là prokaryotic hay eukaryotic đều là nguồn khơi thường hiện hữu trong hầu hết các loại tế bào, dậy tác dụng bảo hộ miễn dịch ở Artemia chống tăng mạnh khi đáp ứng với các điều kiện stress lại tác nhân gây bệnh bằng cách hoạt hóa hệ hay yếu tố lạ và tôm sú cũng không phải là điều thống ProPO. Đây là một trong những nghiên ngoại lệ. Ở liều tiêm 8 và 10 μg DnaK đã kích cứu đầu tiên về hoạt động hoạt hóa của Hsp70 ở thích biểu hiện PO cao gấp 4 lần ở thời điểm động vật không xương sống. 2 giờ sau khi tiêm. Lượng PO vẫn còn cao ở Theo Ryckaert và ctv., (2010) thì Hsp70 nghiệm thức này tại thời điểm 4 giờ nhưng sau tái tổ hợp khi tiêm vào playfish (Xiphophorus đó giảm đáng kể ở các thời điểm thu mẫu còn maculates) có vai trò kích thích miễn dịch lại. Có thể là do bản chất DnaK hay đáp ứng kháng lại tác nhân gây bệnh Yersinia ruckeri. miễn dịch của tôm chỉ biểu hiện và kéo dài trong Tuy nhiên, hiệu quả bảo hộ vẫn chưa so sánh một khoảng thời gian ngắn. Ở các thời điểm sau được với vaccine. 4 giờ có thể là do sự bình ổn của hệ miễn dịch Trong nghiên cứu này, các nghiệm thức nên không thấy tăng giảm PO đáng kể. tiêm Hsp70 liều 2, 4, 6 µg DnaK hầu như không Đã có rất nhiều nghiên cứu cho rằng HSP70 có sự khác biệt lớn về phenoloxidase so với đóng vai trò như yếu tố hoạt hóa hệ miễn dịch nhóm đối chứng ở các thời điểm thu mẫu. Theo tự nhiên (Pockley, 2003; Tsan, 2004) cụ thể là các nghiên cứu trước đây thì lượng PO sinh ra kích thích hoạt động của các tế bào trong hệ có liên quan đến chu kỳ lột xác của tôm. Liu và miễn dịch. Nghiên cứu đầu tiên về ứng dụng ctv., (2004) nghiên cứu trên tôm thẻ chân trắng HSP70 tái tổ hợp cho thấy HSP70 có khả năng 8,0–14,4 g ở các giai đoạn lột xác khác nhau kích thích sự sản sinh cytokines như IL-1 hay cho thấy tổng số tế bào máu cao nhất ở giai TNF-α từ bạch cầu đơn nhân lớn ở người hay đoạn sau lột xác lớp vỏ đã cứng (intermoult) đại thực bào ở chuột trong điều kiện in vitro nhưng thấp nhất ở giai đoạn vừa sau lột xác. (Basu và ctv., 2002; Galdiero và ctv., 1997). Hoạt động phenoloxidase cao nhất ở giai đoạn Prophenoloxidase đóng vai trò quan trọng trong intermoult và thấp nhất ở giai đoạn vừa sau lột đáp ứng miễn dịch ở giáp xác. Các nghiên cứu xác. Hoạt động thực bào của tôm với Vibrio cho thấy ProPO có vai trò quan trọng trong cơ alginolyticus giảm một cách đáng kể ở giai chế miễn dịch chống lại các bệnh nhiễm khuẩn đoạn vừa sau lột xác và giai đoạn tiền lột xác. hay ký sinh trùng (Cerenius và Söderhäll, 2004). Trong một thí nghiệm khác, khi tiêm tôm thẻ Hiện tại chưa thấy công bố nghiên cứu về chân trắng ở các giai đoạn lột xác khác nhau ảnh hưởng của tiêm Hsp70 lên PO trên tôm sú. với 105 CFU V. alginolyticus cho thấy sau 10 Tuy nhiên, ảnh hưởng kết hợp của Hsp70 và vi giờ tiêm cho thấy tỷ lệ chết ở nhóm vừa sau khuẩn Vibrio campbellii lên PO trên Artemia lột xác cao hơn và có ý nghĩa so với nhóm ở đã được Baruah và ctv., (2011) nghiên cứu. giai đoạn intermoult. Sau 48-120 giờ theo dõi Theo nhóm tác giả này khi cho Artemia nuôi cho thấy nhóm tôm ở giai đoạn vừa sau lột trong điều kiện vô trùng ăn Hsp70 từ Artemia xác có tỷ lệ chết cao nhất và nhóm intermoult hoặc Hsp70 được kích thích sinh ra từ E. coli cho tỷ lệ chết thấp nhất. Vì vậy để loại trừ khả tiếp theo đó là gây nhiễm bằng V. campbellii cho năng ảnh hưởng của các giai đoạn lột xác đến thấy tăng cường hệ thống ProPO được chứng phenoloxidase sau khi tiêm với các liều khác minh bằng mRNA và ở mức độ protein. Nghiên nhau của DnaK, trong nghiên cứu này chúng TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 33
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 tôi đã chọn lựa tôm đồng đều về giai đoạn lột (lvHSP70) (lv = left ventricular). Tuy nhiên, xác trước khi tiến hành thí nghiệm. không phải tất cả các gen điều hòa miễn dịch Theo Sung (2014) khi cho ấu trùng tôm thẻ đều tăng sau khi tiêm DnaK và chỉ giới hạn ở chân trắng ăn E. coli YS 2 có khả năng sản sinh một số và ở các điểm thời gian nhất định. DnaK khi kích thích bằng Arabinose làm tăng V. KẾT LUẬN cường khả năng đề kháng khi gây nhiễm với Tiêm tôm với 8, 10 µg DnaK làm tăng biểu V. harveyi. Bằng phương pháp Realtime PCR hiện của proPO tại thời điểm 2 và 4 giờ sau khi nhóm tác giả này tìm thấy ở nhóm cho ăn E. coli tiêm, điều này được xác định bằng phản ứng tăng crustin mRNA gấp 7 lần so với nhóm đối định lượng RT-PCR. chứng. Tuy nhiên nhóm tác giả này không tìm Kết quả kiểm tra hoạt tính của phenoloxidase thấy sự khác biệt so với nhóm đối chứng về các bằng phản ứng Phenoloxidase được thực hiện chỉ tiêu miễn dịch khác như ProPO, penaeidin, trên cuvet chưa thấy sự khác biệt lớn về hoạt tính hemocyanin và peroxinectin. phenoloxidase khi tiêm tôm với DnaK. Tuy nhiên Theo kết quả nghiên cứu của Hu và ctv., với kết quả định lượng cho thấy sự khác biệt có ý (2014) cho thấy DnaK có khả năng kích thích nghĩa thống kê ở một số thời điểm thu mẫu. hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng. Sau khi tiêm tôm thẻ chân trắng với DnaK LỜI CÁM ƠN tinh sạch liều 5 µg/tôm nhóm tác giả này tìm Nghiên cứu này được thực hiện trong nội thấy có sự tăng có ý nghĩa thống kê đối với chỉ dung chương trình nghiên cứu song phương tiêu transglutaminases và prophenoloxidases ở Việt Bỉ với kinh phí từ Quỹ phát triển Khoa tôm thẻ chân trắng tại thời điểm 3 giờ sau khi học và Công nghệ Quốc gia. Nhóm tác giả tiêm DnaK. Ngoài sự tăng PO còn có sự tăng chân thành cảm ơn sự tài trợ của Quỹ cũng như giảm của các gen liên quan đến miễn dịch sự giúp đỡ của các giáo sư thuộc Laboratory trên tôm thẻ chân trắng như Penaeidin (PEN), of Aquaculture & Artemia Reference Center Transgluminase (TGase-1), endogenous HSP70 (Gent, Belgium). 34 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ryckaert, J., Pasmans, F., Tobback, E., Duchateau, L., Decostere, A., Haesebrouck, F., 2010. Heat shock Basu, N., Todgham, A.E., Ackerman, P.A., Bibeau, proteins protect platyfish (Xiphophorus maculatus) M.R., Nakano, K., Schulte, P.M., Iwama, G.K., from Yersinia ruckeri induced mortality. Fish & 2002. Heat shock protein genes and their functional Shellfish Immunology 28: 228–231. significance in fish. Gene 295: 173–183. Sergio, H. M., Pablo, C., Marcela, Z., Jorge, O., Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P. and Bossier, P., Fernando, G., Patricio, C., and Vitalia, H., 2007. 2010. Efficacy of heterologous and homologous Immunological characterization of a bacterial heat shock protein 70s as protective agents to protein isolated from salmonid fish naturally Artemia franciscana challenged with Vibrio infected with Piscirickettsia salmonis. Vaccine campbellii. Fish & Shellfish Immunology 29: 25: 2095–2102. 733-739 Singh, V., and Aballay, A., 2006. Heat-shock Baruah, K., Ranjan, J., Sorgeloos, P., Macrae, T.H. and transcription factor (HSF)-1 pathway required for Bossier, P., 2011. Primming the prophenoloxidase Caenorhabditis elegans immunity. Proceedings system of Artemia Franciscana by heat shock of the National Academy of Sciences USA 103: proteins protects against Vibrio campbellii 13092-13097. challenge. Fish & Shellfish Immunology 31(1):134-41 Sritunyalucksana, K., sithisarn, P., withayachumnarnkul, B., and flegel, T.W., 1999. Activation of Cerenius, L., Soderhall, K., 2004. The prophenoloxidase- prophenoloxidase, agglutinin and antibacterial activating system in invertebrates. Immunology activity in haemolymph of the black tiger prawn, Review 198: 116–126. Penaeus monodon, by immunostimulants. Fish & Galdiero, M., de l’Ero, G.C., Marcatili, A., 1997. Shellfish Immunology 9: 21–30. Cytokine and adhesion molecule expression in Sung, H.H., Chang, H.J., Her, C.H., Chang, J.C., human monocytes and endothelial cells stimulated Song, Y.L., 1998. Phenoloxidase activity of with bacterial heat shock proteins. Infecion and hemocytes derived from Penaeus monodon Immunity 65 (2): 699-707 and Macrobrachium rosenbergii. Journal of Hu, B., Phuoc, L.H., Sorgeloos, P., Bossier, P., 2014. Invertebrate Pathology 71(1): 26-33. Bacterial HSP70 (DnaK) is an efficient immune Sung, Y.Y., 2014. Heat Shock Proteins: An Alternative stimulator in Litopenaeus vannamei. Aquaculture, to Control Disease in Aquatic Organism. Journal 418–419, 87–93. of Marine Science: Research & Development Ji, P-F., Yao, C-L., Wang, Z-Y., 2009. Immune response 4:e126. doi: 10.4172/2155-9910.1000e126. and gene expression in shrimp (Litopenaeus Tsan, M.F., 2004. Cytokine function of heat-shock vannamei) hemocytes and hepatopancreas against proteins. AJP: Cell Physiology, 286, 739-744. some pathogen-associated molecular patterns. Fish & Shellfish Immunology 27: 563-570 Yeong, Y.S., Van Damme, E. J.M., Sorgeloos, P., and Bossier, P., 2007. Non-lethal heat shock protect Lindquist, S., and Craig, E. A., 1988. The heat shock gnotobiotic Artemia franciscana larvae against proteins. Annual Review Genetic 22: 631-637. virulent Vibrios. Fish & Shellfish Immunology Liu, C-H., Yeh, S-T., Cheng, S-Y., and Chen, J-C., 22: 318-326. 2004. The immune response of the white shrimp Yeong, Y. S., Pineda, C., MacRae, T. H., Sorgeloos, Litopenaeus vannamei and its susceptibility to P., and Bossier, P., 2008. Exposure of gnotobiotic Vibrio infection in relation with the moult cycle. Artemia franciscana larvae to abiotic stress Fish & Shellﬁsh Immunology 16: 151–161 promotes heat shock protein 70 synthesis Liu, C.H., Yeh, S.P., Kuo, C.M., Cheng, W., Chou, and enhances resistance to pathogenic Vibrio C.H., 2006. The effect of sodium alginate on campbellii. Cell Stress Chaperones 13(1): 59-66. the immune response of tiger shrimp via dietary Yeong, Y.S, Ashame, M.S., Chen, S., MacRae, T.H., administration: activity and gene transcription. Sorgeloos, P. and Bossier, P., 2009. Feeding Fish & Shellfish Immunology 21:442-253. Artemia franciscana (Kellogg) larvae with Pockley, A. G., 2003. Heat shock proteins as regulators bacterial heat shock protein, protects from Vibrio of the immune response. The Lancet 362: 469- campbellii infection. Journal of Fish Diseases 32 476. (8): 675-685. Pockley, A.G., 2005. Heat shock proteins as regulators of the immune response. The Lancet 362: 469–476. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016 35
VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2 EFFECT OF DIFFERENT DOSE OF HEAT SHOCK PROTEINS ON IMMUNE PARAMETERS OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) Le Hong Phuoc1*, Nguyen Hong Loc1, Nguyen Thi Hien1, Vo Hong Phuong1 ABSTRACT This study was conducted to evaluate the effect of different doses of bacterial heat shock protein (DnaK) on immune response of black tiger shrimp (Penaeus monodon). Shrimp’s immune response was tested by carrying out phenoloxidase reaction in cuvet, then measuring OD492nm by photospectrometer and quantification of mRNA by Real-time PCR. DnaK was extracted from E. coli strain overexpressing DnaK with a hexahistidine-tag. After extraction DnaK was purified by Dynabead manegtic beads. The concentration of purified recombinant DnaK was determined by Bradford assay. DnaK sample was then combined with loading buffer and electrophoresed in 10% SDS-PAGE gels. Gels were either stained with Bio-safe Coomassie stain (SDS-PAGE) or transferred to polyvinylidene fluoride membranes for antibody probing (Western Blot). The juvenile P. monodon shrimp (mean body weight = 10-12g) were injected with DnaK at a dose of 2, 4, 6, 8, 10 or 15 µg shrimp-1. Haemolymph were collected at 2, 4, 7, and 10 hours post DnaK injection. The expression of prophenoloxidases gene was monitored via quantitative RT-PCR. Shrimps injected with 8 or 10 µg DnaK resulted in significantly increase in PO at 2 and 4 hours post injection compared to other treatments (p < 0.05). This result suggests that DnaK is able to modulate immune responses in P. monodon. Keywords: DnaK, shrimp, prophenoloxidase, HSP70. Người phản biện: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh Ngày nhận bài: 18/11/2015 Ngày thông qua phản biện: 18/12/2015 Ngày duyệt đăng: 25/12/2015 1. Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2. * Email: lehongphuoc@yahoo.com 36 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 7 - THÁNG 01/2016