Ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng tăng sinh mô sẹo “xốp” và bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276<br /> <br /> ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG TĂNG SINH MÔ SẸO<br /> “XỐP” VÀ BƯỚC ĐẦU NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH<br /> (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)<br /> <br /> Lê Kim Cương, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt*<br /> Viện Sinh học Tây Nguyên, (*)duongtannhut@gmail.com<br /> <br /> TÓM TẮT: Ảnh hưởng của 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), -naphthaleneacetic acid (NAA),<br /> thành phần khoáng, giá thể, nguồn mẫu, điều kiện nuôi cấy lên sự cảm ứng, tăng sinh mô sẹo “xốp” và<br /> bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào cây sâm Ngọc Linh đã được trình bày trong nghiên cứu này. Kết quả<br /> cho thấy, mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo “xốp” với tỷ lệ tạo mô sẹo, khối lượng tươi,<br /> khối lượng khô cao nhất ở nồng độ kết hợp giữa 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA và cao gấp 1,6 lần so<br /> với khi chỉ bổ sung riêng rẽ 2,4-D. Môi trường khoáng MS là thích hợp cho mẫu cấy cảm ứng và tăng sinh<br /> tạo thành mô sẹo “xốp”. Mặc dù, mẫu cấy tăng sinh tốt trên giá thể gelrite và agar, tuy nhiên, agar vẫn là<br /> giá thể phù hợp được chọn nhằm tiết kiệm chi phí nhưng vẫn đạt hiệu quả cảm ứng và tăng sinh mô sẹo<br /> “xốp” cao. Mẫu cuống lá được nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày cho khả năng cảm ứng và tăng<br /> sinh mô sẹo “xốp” tốt nhất. Để tạo huyền phù tế bào, sau 8 tuần nuôi cấy, các mô sẹo “xốp”, mọng nước<br /> được dùng làm nguyên liệu nuôi cấy dịch huyền phù tế bào bằng cách cấy chuyền sang môi trường MS<br /> lỏng có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA, 30 g/l sucrose và được lắc ở tốc độ 100 vòng/phút. Huyền<br /> phù tế bào tăng sinh nhanh và thu được sinh khối lớn nhất vào ngày thứ 14 (23,67 mg/ml).<br /> Từ khóa: Panax vietmamensis, 2,4-D, huyền phù tế bào, mô sẹo “xốp”, NAA, tăng sinh mô sẹo.<br /> <br /> MỞ ĐẦU quinquefolium) [28]. Tuy nhiên, đối với sâm<br /> Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Ngọc Linh thì các nghiên cứu về việc thu nhận<br /> Grushv.) là một trong những cây dược liệu quý sinh khối từ huyền phù tế bào còn hạn chế.<br /> cần được bảo tồn có trong Sách Đỏ Việt Nam Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung<br /> 2007 [5]. Sâm Ngọc Linh chứa 52 loại saponin, vào việc khảo sát các yếu tố như chất điều hòa<br /> 17 acid amin, 20 chất khoáng vi lượng, 0,1% sinh trưởng thực vật, thành phần chất dinh<br /> tinh dầu. Tại hội nghị quốc tế về sâm, loài sâm dưỡng, giá thể, nguồn mẫu cấy, điều kiện nuôi<br /> này được xếp vào nhóm các loài sâm quý trên cấy lên sự cảm ứng, tăng sinh mô sẹo “xốp” và<br /> thế giới cùng với sâm Triều Tiên (Panax bước đầu sử dụng nguồn mô sẹo “xốp” này để<br /> ginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolium)... nuôi cấy dịch huyền phù tế bào cây sâm Ngọc<br /> [21]. Hiện nay, nguồn cung cấp sâm Ngọc Linh Linh (Panax vietnamensis) với mục tiêu tạo<br /> còn rất hạn chế do loài sâm này chỉ được trồng nguồn nguyên liệu ban đầu cho việc nhân giống<br /> tập trung ở vùng núi Ngọc Linh và thời gian từ in vitro; thu sinh khối tế bào ở quy mô công<br /> lúc trồng từ hạt cho đến khi thu được củ lên đến nghiệp, cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định<br /> 5-6 năm. Chính vì hàm lượng dược tính cao, giá cho ngành sản xuất dược liệu ở nước ta; đồng<br /> trị kinh tế lớn mà sâm Ngọc Linh đã sớm cạn thời, phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn ở mức<br /> kiệt và đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng độ tế bào: dung hợp tế bào trần, chuyển gien…<br /> do việc khai thác quá mức. Do đó, yêu cầu tìm trên đối tượng sâm Ngọc Linh.<br /> ra những kỹ thuật mới giúp thu được sinh khối<br /> sâm nhanh và hiệu quả đang trở nên bức thiết. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh Vật liệu<br /> học trong nhân sinh khối các loài sâm khác đã<br /> được mở rộng như thu nhận sinh khối rễ sâm Nguồn mẫu<br /> Triều Tiên (Panax ginseng) [13], thu nhận sinh Nguồn mẫu là các cây sâm Ngọc Linh in<br /> khối từ huyền phù tế bào sâm Triều Tiên vitro 3 tháng tuổi, cao khoảng 4,5 cm hiện có tại<br /> (Panax ginseng) [25], thu nhận sinh khối từ Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây<br /> huyền phù tế bào trên cây sâm Hoa Kỳ (Panax trồng (Viện Sinh học Tây Nguyên). Lá và cuống<br /> <br /> <br /> 265<br />  Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut<br /> <br /> lá của cây sâm in vitro được sử dụng làm nguồn Khảo sát ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên<br /> mẫu. Lá được cắt thành những mẫu có kích sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm<br /> thước khoảng 1 x 1 cm, cuống lá cắt thành từng Ngọc Linh<br /> đoạn dài khoảng 1 cm. Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên<br /> Môi trường nuôi cấy môi trường có bổ sung nồng độ các chất điều<br /> Môi trường dinh dưỡng khoáng MS [17], hòa sinh trưởng tối ưu ở thí nghiệm trên và sử<br /> ½MS (môi trường MS có thành phần khoáng đa dụng các loại giá thể khác nhau: agar (8 g/l),<br /> lượng giảm đi một nửa), SH [23] có bổ sung 30 gelrite (2 g/l), bông gòn (kích thước 4  4 cm,<br /> g/l sucrose, 8 g/l agar (ngoại trừ thí nghiệm khoảng 1,95 ± 0,46 g) nhằm tìm ra giá thể thích<br /> khảo sát giá thể). Tùy theo thí nghiệm mà các hợp nhất cho sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo<br /> chất điều hòa sinh trưởng khác nhau được sử “xốp” sâm Ngọc Linh.<br /> dụng (2,4-D, NAA). Các thí nghiệm được điều Khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu và điều<br /> chỉnh pH về 5,8 trước khi hấp khử trùng ở kiện chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh<br /> 121ºC, 1 atm trong 30 phút. Mẫu được cấy vào mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh<br /> bình thủy tinh 250 ml chứa 40 ml môi trường, Mẫu cấy lá (1 × 1 cm) và cuống lá (1 cm)<br /> mỗi công thức 50 mẫu (5 mẫu/bình, 3 lần được cấy vào môi trường tốt nhất thu được ở<br /> lặp lại) đối với các thí nghiệm khảo sát mô sẹo. các thí nghiệm trên. Sau đó, các mẫu cấy được<br /> Huyền phù tế bào được nuôi cấy trong bình đặt dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với<br /> thủy tinh 250 ml chứa 50 ml môi trường lỏng, cường độ 45 µmol.m-2.s-1 hoặc tối hoàn toàn.<br /> đặt trên máy lắc (100 vòng/phút) (Hermle,<br /> Đức). Bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm<br /> Ngọc Linh<br /> Phương pháp<br /> Sau khi tìm ra môi trường nuôi cấy với<br /> Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và NAA lên sự nồng độ chất điều hòa sinh trưởng, giá thể,<br /> cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng phù hợp thì<br /> Linh từ mẫu cấy cuống lá in vitro các mẫu mô sẹo “xốp”, bở được dùng làm<br /> Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự cảm ứng và tăng nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào. Mô sẹo<br /> sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh “xốp” có khối lượng tươi 1 g được nuôi cấy trên<br /> Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên môi trường lỏng với thành phần khoáng, chất<br /> môi trường MS bổ sung 2,4-D ở các nồng độ điều hòa sinh trưởng thực vật, điều kiện nuôi<br /> khác nhau (0; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/l), 30 g/l cấy tối ưu ở các thí nghiệm trên. Huyền phù tế<br /> sucrose và 8 g/l agar. bào sau khi thu nhận được tái sinh lại trên môi<br /> trường rắn với thành phần dinh dưỡng tương tự<br /> Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với NAA lên sự như môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào.<br /> cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc<br /> Linh Phương pháp xác định sinh khối<br /> Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên Xác định khối lượng mô sẹo<br /> môi trường MS có bổ sung 2,4-D với nồng độ Mẫu mô sẹo được lấy ra khỏi bình nuôi cấy<br /> tốt nhất thu được ở thí nghiệm trên kết hợp với và cân trên cân phân tích (Sartorius, Đức) để<br /> NAA ở các nồng độ khác nhau (0,5; 1,0 và 2,0 xác định khối lượng tươi. Sau đó, tiến hành sấy<br /> mg/l), 30 g/l sucrose và 8 g/l agar. mẫu mô sẹo ở 60ºC cho đến khi khối lượng<br /> Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng không đổi để xác định khối lượng khô.<br /> lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” Xác định mật độ tế bào<br /> sâm Ngọc Linh từ mẫu cấy cuống lá in vitro Huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh được thu<br /> Mẫu cuống lá (1 cm) được nuôi cấy trên nhận và được nhuộm bằng thuốc nhuộm<br /> môi trường MS, ½MS, SH, bổ sung 30 g/l carmine-iodine với tỷ lệ 2:1 (dịch huyền phù tế<br /> sucrose, 8 g/l agar với nồng độ 2,4-D, NAA tốt bào:thuốc nhuộm carmine-iodine). Sau đó, hút 5<br /> nhất ở thí nghiệm trên. µl dịch huyền phù đã nhuộm bằng micropipette<br /> <br /> 266<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276<br /> <br /> trải lên lamelle. Đặt lên lame lõm, quan sát dưới trường có chứa 2,4-D sau 8 tuần nuôi cấy được<br /> kính hiển vi (Olympus, Nhật Bản) và đếm tế thể hiện qua bảng 1, hình 1a. Sự cảm ứng và<br /> bào dưới vật kính ×10. tăng sinh mô sẹo khác nhau ở các nồng độ 2,4-<br /> Xác định khối lượng tươi và khối lượng khô sinh D khác nhau trong môi trường nuôi cấy. Sự<br /> khối khác nhau đó được thể hiện qua tỷ lệ tạo mô<br /> sẹo, khối lượng tươi, khối lượng khô của mô<br /> Tiến hành cân eppendorf, hút 1 ml dịch sẹo. Tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo “xốp” đạt 100%<br /> huyền phù tế bào cho vào eppendorf. Sau đó, ở các công thức có bổ sung 1,0 mg/l, 2,0 mg/l<br /> dịch huyền phù tế bào này được ly tâm với tốc 2,4-D (bảng 1). Khối lượng tươi và khối lượng<br /> độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Nhẹ nhàng khô của mô sẹo cũng đạt cao nhất ở công thức<br /> hút bỏ dịch nổi, giữ lại phần cặn lắng đã được ly có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D (268,4 mg/mẫu và<br /> tâm. Cân eppendorf có chứa sinh khối tế bào 9,4 mg/mẫu), mô sẹo tạo thành “xốp”, mọng<br /> lắng ở đáy để xác định khối lượng tươi. Khối nước và có màu trắng trong (bảng 1, hình 1a). Ở<br /> lượng tươi sinh khối là độ lệch giữa hai lần cân. công thức bổ sung nồng độ 2,4-D thấp (0,5<br /> Sau đó, tiến hành xác định khối lượng khô bằng mg/l), mẫu cấy hầu như không cảm ứng tạo<br /> cách sấy eppendorf chứa huyền phù tế bào (đã thành mô sẹo mà cảm ứng tạo thành rễ; còn ở<br /> ly tâm và hút bỏ dịch nổi) trong tủ sấy ở 60ºC nghiệm thức không bổ sung 2,4-D thì mẫu cấy<br /> đến khi khối lượng không đổi. Khối lượng khô hóa nâu và chết. Điều đó chứng tỏ 2,4-D có vai<br /> sinh khối là độ chệnh lệch giữa lần cân cuối và trò quan trọng trong việc cảm ứng và tăng sinh<br /> lần cân đầu tiên. mô sẹo sâm Ngọc Linh. Kết quả này tương tự<br /> Điều kiện thí nghiệm với kết quả của một số nghiên cứu về chi Panax<br /> Các thí nghiệm được tiến hành ở điều kiện như trên cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng<br /> nhiệt độ 23±2ºC, thời gian chiếu sáng 16 C.A. Meyer) [25, 6], cây sâm Mỹ (Panax<br /> giờ/ngày với cường độ 45 µmol.m-2.s-1 (đối với quinquefolium) [27], mẫu cấy cảm ứng hình<br /> các thí nghiệm có chiếu sáng) và độ ẩm trung thành mô sẹo mềm, “xốp” và tăng sinh nhanh<br /> bình 75-80%. khi bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D vào môi trường<br /> nuôi cấy.<br /> Chỉ tiêu theo dõi và thống kê xử lý số liệu<br /> Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với NAA lên sự<br /> Các thí nghiệm khảo sát về sự cảm ứng và cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc<br /> tăng sinh mô sẹo bao gồm các chỉ tiêu sau: tỷ lệ Linh<br /> tạo thành mô sẹo “xốp” (%), khối lượng tươi<br /> (mg), khối lượng khô (mg) được thu nhận sau 8 Sự kết hợp 1,0 mg/l 2,4-D và NAA ở các<br /> tuần nuôi cấy. Trong nuôi cấy huyền phù tế bào, nồng độ khác nhau (0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/l)<br /> chúng tôi tiến hành ghi nhận các chỉ tiêu như vào trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng<br /> mật độ tế bào, khối lượng tươi, khối lượng khô một cách đáng kể đến sự cảm ứng và tăng sinh<br /> của sinh khối huyền phù tế bào sau 7, 14, 21 và của mô sẹo “xốp”. Ở nghiệm thức có bổ sung<br /> 28 ngày nuôi cấy. Số liệu được xử lý và phân 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA thì 100% mẫu<br /> tích bằng phần mềm SPSS 16.0 theo phương cấy tạo thành các mô sẹo “xốp”, mọng nước,<br /> pháp Duncan test với α = 0,05 [8]. màu trắng trong với khối lượng tươi (434,2<br /> mg/mẫu) và khối lượng khô (22,8 mg/mẫu) cao<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN nhất so với các nghiệm thức còn lại, cao gấp 1,6<br /> lần so với nghiệm thức không bổ sung NAA<br /> Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA lên sự cảm (bảng 2, hình 1b). Trong khi đó, nghiệm thức có<br /> ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” từ mẫu cấy bổ sung NAA ở nồng độ thấp hoặc cao hơn 1,0<br /> cuống lá in vitro sâm Ngọc Linh mg/l cũng không làm tăng khả năng tăng sinh<br /> Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự cảm ứng và tăng của mô sẹo.<br /> sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Sự kết hợp của hai loại auxin trong quá trình<br /> Mẫu cấy cuống lá in vitro sâm Ngọc Linh cảm ứng mô sẹo cũng đã được nghiên cứu trên<br /> cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” trên môi nhiều đối tượng khác nhau. Trên cây Thu thảo<br /> <br /> <br /> 267<br />  Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut<br /> <br /> kê (Pogonatherum paniceum) khi bổ sung kết “xốp”, bở, mọng nước, màu trắng. Khi bổ sung<br /> hợp 2,4-D và NAA với các nồng độ khác nhau, ở nồng độ NAA và 2,4-D cao hơn 2,0 mg/l mô<br /> mẫu cấy cũng cảm ứng và tạo thành mô sẹo có sẹo hình thành bở, có màu vàng hoặc trắng xanh<br /> hình thái khác nhau; bên cạnh sự xuất hiện của [10].<br /> các mô sẹo “xốp”, mềm, màu trắng xanh hay Như vậy, trên đối tượng cây sâm Ngọc<br /> vàng nhạt còn có các mô sẹo cứng, chắc, màu Linh, tỷ lệ cảm ứng tạo thành mô sẹo, khối<br /> vàng đậm [29]. Ở cây Ngũ trảo (Vitex negundo) lượng tươi, khối lượng khô đạt cao nhất khi<br /> khi bổ sung 2,4-D kết hợp với NAA ở nồng độ nuôi cấy mẫu cuống lá trên môi trường có sự<br /> thấp (dưới 1,0 mg/l) tạo thành mô sẹo bở, màu kết hợp của 1,0 mg/l 2,4-D và 1,0 mg/l NAA và<br /> trắng; nồng độ 2,4-D và NAA khoảng 1,0 mg/l - cao gấp 1,6 lần so với môi trường chỉ bổ sung<br /> 2,0 mg/l mẫu cấy cảm ứng tạo thành mô sẹo 2,4-D riêng rẽ.<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh<br /> Tỷ lệ tạo mô Khối lượng Khối lượng<br /> 2,4-D<br /> sẹo “xốp” tươi khô Hình thái mô sẹo<br /> (mg/l)<br /> (%) (mg/mẫu) (mg/mẫu)<br /> 0,0 0 14,8d 1,6b Mẫu hóa nâu và chết<br /> Hầu hết mẫu cảm ứng tạo rễ trực<br /> 0,5 2 70,6c 7,0a tiếp, một số mẫu tạo mô sẹo có màu<br /> xanh nhạt, hơi “xốp”<br /> Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu<br /> 1,0 100 268,4a 9,4a<br /> trắng trong<br /> Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng<br /> 2,0 100 193b 9,2a<br /> trong, một số mẫu xuất hiện phôi<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của 1,0 mg/l 2,4-D kết hợp với NAA ở các nồng độ khác nhau lên sự cảm ứng<br /> và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh<br /> Tỷ lệ tạo mô Khối lượng Khối lượng<br /> NAA<br /> sẹo “xốp” tươi khô Hình thái mô sẹo<br /> (mg/l)<br /> (%) (mg/mẫu) (mg/mẫu)<br /> Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu<br /> 0,0 100 270,0b 10,0b<br /> trắng trong<br /> Mô sẹo vàng “xốp”, một số mẫu<br /> 0,5 100 87,4c 8,0b<br /> cảm ứng tạo rễ<br /> Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu<br /> 1,0 100 434,2a 22,8a<br /> trắng trong<br /> Mô sẹo “xốp”, mọng nước, trắng<br /> 2,0 100 203,8b 11,0b<br /> trong, một số mẫu hình thành phôi<br /> Các chữ cái a,b,… thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử Duncan.<br /> <br /> Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự ứng tạo thành mô sẹo “xốp” gần như không có<br /> cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” từ các sự khác biệt (bảng 3). Tuy nhiên, các chỉ tiêu<br /> mẫu cấy cuống lá in vitro sâm Ngọc Linh khối lượng tươi và khối lượng khô của mô sẹo<br /> Các mẫu cấy cuống lá in vitro sâm Ngọc lại khác nhau khi nuôi cấy trên các nguồn<br /> Linh đều cảm ứng và tăng sinh thành mô sẹo khoáng khác nhau. Khối lượng tươi và khối<br /> “xốp” trên các môi trường khoáng MS, ½MS, lượng khô của mô sẹo cao nhất khi nuôi cấy<br /> SH. Ở cả ba loại môi trường tỷ lệ mẫu cấy cảm trên môi trường MS (431,6 và 20 mg/mẫu), tiếp<br /> <br /> <br /> 268<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276<br /> <br /> theo là môi trường ½MS (302,2 và 16,4 nước và có màu trắng trong. Trên môi trường<br /> mg/mẫu) và cuối cùng là môi trường SH (194 ½MS và SH, mô sẹo cũng có hình thái tương tự,<br /> và 8,2 mg/mẫu) (bảng 3). Các mẫu mô sẹo được nhưng một số mẫu lại cảm ứng hình thành rễ<br /> hình thành trên môi trường MS thì “xốp”, mọng (hình 1c).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Ảnh hưởng của 2,4-D, NAA, nguồn khoáng, giá thể, nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng<br /> lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)<br /> a. Nồng độ 2,4-D (0; 0,5; 1,0; 2,0 mg/l, từ phải qua trái); b. Nồng độ NAA (0; 0,5; 1,0; 2,0 mg/l, từ phải qua<br /> trái); c. Nguồn khoáng ½MS, MS, SH (từ phải qua trái); d. Giá thể bông gòn, gelrite, agar (từ phải qua trái);<br /> Mẫu cấy lá (e1) và cuống lá (e3) ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày; Mẫu cấy lá (e2) và cuống lá (e4) ở điều<br /> kiện tối hoàn toàn; thanh đo: 25 mm<br /> <br /> <br /> 269<br />  Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut<br /> <br /> Bảng 3. Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp”<br /> sâm Ngọc Linh<br /> Môi Tỷ lệ tạo mô Khối lượng Khối lượng<br /> Hình thái mô sẹo<br /> trường sẹo “xốp” (%) tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu)<br /> Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng<br /> ½MS 90 302,2b 16,4ab<br /> trong, một số mẫu cảm ứng tạo rễ<br /> Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng<br /> MS 100 431,6a 20a<br /> trong<br /> Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu trắng<br /> SH 96 194b 8,2b<br /> trong, một số mẫu cảm ứng tạo rễ<br /> <br /> Trong nuôi cấy in vitro, thành phần khoáng có được chú ý. Trong nghiên cứu này, các mẫu cấy<br /> vai trò quan trọng trong việc cảm ứng, tăng sinh cuống lá đều cảm ứng tạo mô sẹo “xốp” trên các<br /> và phát sinh hình thái mô sẹo. Một số nghiên cứu giá thể nuôi cấy khác nhau (100%) (bảng 4).<br /> về ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đến khả Tuy nhiên, khối lượng tươi và khối lượng khô<br /> năng cảm ứng và tăng sinh mô sẹo cho thấy, mô của mô sẹo lại có sự khác biệt rõ rệt. Trên giá<br /> sẹo được hình thành từ mẫu cấy lá sâm Ngọc Linh thể agar và gelrite, mô sẹo tăng sinh nhiều hơn<br /> thì cứng và chắc, có khối lượng tươi cao nhất khi so với giá thể bông gòn (bảng 4). Mô sẹo cảm<br /> được nuôi cấy trên môi trường SH, còn trên môi ứng trên giá thể agar và gelrite đều “xốp”, mọng<br /> trường MS và ½MS lại cho kết quả thấp hơn [19]. nước và có màu trắng trong, còn trên giá thể<br /> Trong khi đó, mô sẹo sâm Triều Tiên (Panax bông gòn mô sẹo có màu vàng nhạt (hình 1d).<br /> ginseng) lại tăng sinh tốt trên môi trường khoáng Các mô sẹo màu trắng trong, mọng nước<br /> ½MS [7], còn mô sẹo sâm Mỹ (Panax thường “xốp”, rời rạc hơn và dễ phân tán trong<br /> quinquefolium) lại tăng sinh tốt trên môi trường môi trường lỏng so với các mô sẹo có màu<br /> khoáng MS [1]. Do đó, môi trường khoáng thích vàng. Do đó, các mô sẹo này thích hợp làm<br /> hợp là điều kiện tất yếu cho sự cảm ứng hình nguyên liệu tạo huyền phù tế bào sâm Ngọc<br /> thành mô sẹo “xốp” của sâm Ngọc Linh. Qua kết Linh. Trong nghiên cứu này, giá thể agar thích<br /> quả thí nghiệm cho thấy, môi trường khoáng MS hợp cho sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp”<br /> là thích hợp cho mẫu cấy cảm ứng tạo thành mô sâm Ngọc Linh. Trong giá thể agar có chứa Ca,<br /> sẹo “xốp” và tăng sinh cao nhất. Mg, K và Na [18] có thể là yếu tố cần thiết cho<br /> Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự cảm mô sẹo “xốp” cảm ứng và tăng sinh. Giá thể<br /> ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc bông gòn tuy dẫn truyền chất dinh dưỡng tốt<br /> Linh nhưng lại không thích hợp cho mẫu mô sẹo<br /> “xốp” tăng sinh. Mặc dù, mẫu cấy cảm ứng và<br /> Bên cạnh chất tạo đông được sử dụng phổ tăng sinh tốt trên giá thể agar và gelrite, nhưng<br /> biến như agar, gelrite trong nuôi cấy mô thực xét về hiệu quả kinh tế thì agar vẫn là giá thể<br /> vật thì việc sử dụng các giá thể có cấu trúc xốp, được chọn nhằm tiết kiệm chi phí, nhưng vẫn<br /> thông thoáng khí lại tiết kiệm được chi phí đang đảm bảo cho hiệu quả cao.<br /> <br /> Bảng 4. Ảnh hưởng của giá thể nuôi cấy lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh<br /> Giá Tỷ lệ tạo mô Khối lượng Khối lượng<br /> Hình thái mô sẹo<br /> thể sẹo “xốp”(%) tươi (mg/mẫu) khô (mg/mẫu)<br /> Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu<br /> Agar 100 426,8a 22,2a<br /> trắng trong<br /> Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu<br /> Gelrite 100 355,8ab 18,2a<br /> trắng trong<br /> Bông Mô sẹo “xốp”, mọng nước, màu<br /> 100 137,8b 8,4b<br /> gòn vàng nhạt<br /> <br /> <br /> 270<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276<br /> <br /> Ảnh hưởng của nguồn mẫu và điều kiện hình thành từ mẫu cấy lá ở điều kiện sáng có<br /> chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô màu trắng đục và hơi “xốp” (hình 1e1).<br /> sẹo “xốp” sâm Ngọc Linh Kết quả của nghiên cứu này tương tự một số<br /> Mô sẹo có thể được tạo ra từ nhiều loại cơ nghiên cứu về ảnh hưởng của các loại cơ quan<br /> quan khác nhau của một cơ thể thực vật. Khả khác nhau và điều kiện chiếu sáng đến khả năng<br /> năng cảm ứng và tăng sinh tạo thành mô sẹo khởi tạo, biệt hóa và tăng sinh mô sẹo trên các<br /> “xốp” ở các mẫu cấy có nguồn gốc khác nhau là đối tượng thuộc chi Nhân sâm. Lim & Lee<br /> khác nhau. Tùy theo từng loại mẫu cấy, ánh (1997) [15] sử dụng lá, trụ thượng diệp, cuống<br /> sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian hoa và rễ từ cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng)<br /> tạo thành mô sẹo [20]. Trong nghiên cứu này, nuôi cấy in vitro; tất cả các mẫu cấy đều tạo<br /> các mẫu cuống lá được nuôi cấy trong điều kiện thành mô sẹo cứng, chắc với tỷ lệ cao (100%) và<br /> chiếu sáng 16 giờ/ngày và trong điều kiện tối có khả năng tạo rễ bất định khi nuôi cấy ở điều<br /> hoàn toàn đều cảm ứng tạo thành mô sẹo với tỷ kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. Trên đối tượng sâm<br /> lệ là 100%. Tuy nhiên, khối lượng tươi và khối Mỹ (Panax quinquefolium) thì mô sẹo được hình<br /> lượng khô của mô sẹo thu được trong điều kiện thành từ các mẫu cấy ban đầu là rễ sau 2-3 tuần<br /> sáng cao hơn so với điều kiện tối (bảng 5). Các nuôi cấy, mô sẹo cứng, chắc, màu vàng nhạt, tạo<br /> chỉ tiêu như khối lượng tươi, khối lượng khô phôi soma sau 3 tháng nuôi cấy [26]. Khi nuôi<br /> của mô sẹo hình thành từ cuống lá (453 mg/mẫu cấy một số các cơ quan như rễ, lá, cuống lá, trụ<br /> và 23 mg/mẫu) cũng cao hơn so với mô sẹo hạ diệp... thì sự tạo thành mô sẹo trong điều kiện<br /> hình thành từ lá (286,25 mg/mẫu và 26,25 tối tốt hơn ngoài sáng [3, 11, 12, 24]. Tuy nhiên,<br /> mg/mẫu) (bảng 5). Ở điều kiện chiếu sáng, mô trong một số trường hợp, mẫu cấy lại tạo mô sẹo<br /> sẹo hình thành từ các mẫu cuống lá thì “xốp”, tốt hơn trong điều kiện chiếu sáng. Trên mẫu cấy<br /> mọng nước và có màu trắng trong (hình 1e3); lá cây Vải (Litchi chinensis), mô sẹo cảm ứng và<br /> còn trong điều kiện tối thì mô sẹo “xốp”, mọng tăng sinh tốt ở điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày<br /> nước nhưng lại có màu vàng đục (hình 2e4). Đối [16]. Khối lượng tươi đạt cao nhất khi nuôi cấy<br /> với các mẫu cấy lá trong điều kiện sáng cũng mô sẹo phát sinh từ lá cây Cuccumis sativus ở<br /> cho tỷ lệ tạo mô sẹo “xốp” (96%), khối lượng điều kiện chiếu sáng là 16 giờ/ngày [9].<br /> tươi (286,25 mg/mẫu), khối lượng khô (26,25 Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy, mẫu<br /> mg/mẫu) cao hơn so với các mẫu cấy lá được cấy cuống lá được nuôi cấy trong điều kiện<br /> đặt trong tối (bảng 5). Các mẫu lá được nuôi cấy chiếu sáng 16 giờ/ngày là thích hợp cho quá<br /> trong điều kiện tối hoàn toàn đều chuyển sang trình cảm ứng và tăng sinh mô sẹo “xốp” sâm<br /> màu vàng, mô sẹo hình thành hơi “xốp” và có Ngọc Linh.<br /> màu vàng đục (hình 1e2) khác với mẫu mô sẹo<br /> <br /> Bảng 5. Ảnh hưởng của nguồn mẫu và điều kiện chiếu sáng lên sự cảm ứng và tăng sinh mô sẹo<br /> “xốp” sâm Ngọc Linh<br /> Tỷ lệ tạo mô Khối lượng Khối lượng<br /> Điều kiện Nguồn<br /> sẹo “xốp” tươi khô Hình thái mô sẹo<br /> chiếu sáng mẫu<br /> (%) (mg/mẫu) (mg/mẫu)<br /> Mô sẹo hơi<br /> Lá 96 286,25b 26,25a<br /> “xốp”,trắng đục<br /> Sáng<br /> Cuống Mô sẹo “xốp”, mọng<br /> 100 453a 23a<br /> lá nước, trắng trong<br /> Mô sẹo hơi “xốp”, màu<br /> Lá 76 51,25d 6,25b<br /> vàng đục<br /> Tối<br /> Cuống Mô sẹo “xốp”, mọng<br /> 100 164,25c 6,75b<br /> lá nước, vàng đục<br /> <br /> <br /> <br /> 271<br />  Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut<br /> <br /> Nuôi cấy huyền phù tế bào từ mô sẹo “xốp” như nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển và<br /> cây sâm Ngọc Linh phân hóa tế bào trong những điều kiện khác<br /> nhau; thu nhận các chất trao đổi thứ cấp; chọn<br /> Nuôi cấy huyền phù tế bào thích hợp cho dòng tế bào, tuyển chọn các đặc tính thích hợp<br /> việc nhân giống in vitro và sản xuất sinh khối tế để phục vụ cho nhu cầu sống của con người mà<br /> bào ở quy mô công nghiệp. Bên cạnh đó, việc đặc biệt là các kỹ thuật chuyển gien, dung hợp<br /> nuôi cấy tế bào đơn còn có nhiều ứng dụng khác tế bào cũng như các thao tác ở mức tế bào [22].<br /> .<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Khối lượng sinh khối tươi và khô (mg/ml)<br /> Mật độ tế bào (tế bào/5 µl)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Sự sinh trưởng và phát triển của sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh sau các khoảng thời gian<br /> nuôi cấy khác nhau; MĐTB: mật độ tế bào (tế bào/5 µl); KLT: khối lượng tươi sinh khối (mg/ml);<br /> KLK: khối lượng khô sinh khối (mg/ml)<br /> <br /> Qua nghiên cứu này, bước đầu ghi nhận kể, tế bào bước vào giai đoạn suy thoái và chết<br /> được đường cong sinh trưởng của tế bào cây nếu không được cấy chuyền (hình 2).<br /> sâm Ngọc Linh (hình 2; hình 3a, b, c, d). Mô Vì vậy, việc duy trì huyền phù tế bào phải được<br /> sẹo được đưa vào môi trường nuôi cấy từ ngày thực hiện vào giai đoạn đầu của pha ổn định,<br /> đầu tiên đến ngày thứ 7 là giai đoạn thích ứng vào lúc các tế bào phân chia và phát triển<br /> với môi trường nuôi cấy. Thời gian để các tế nhanh chóng, nếu vượt qua giai đoạn này<br /> bào thích ứng với môi trường nuôi cấy phụ thì sức sống của huyền phù tế bào sẽ giảm<br /> thuộc vào nhiều yếu tố như tuổi mẫu, khối xuống. Do đó, ngày nuôi cấy thứ 14 là thời<br /> lượng mẫu và các điều kiện nuôi cấy. Từ ngày điểm thích hợp cho việc cấy chuyền huyền phù<br /> nuôi cấy thứ 7 đến khoảng ngày thứ 12 các tế tế bào cây sâm Ngọc Linh. Nghiên cứu bước<br /> bào bước sang giai đoạn phân chia nhanh theo đầu này sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp<br /> hàm số mũ (20 tế bào/5 µl). Sự phân chia tế bào theo về huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh. Kết<br /> đạt cao nhất được ghi nhận vào ngày thứ 14 quả cũng cho thấy pha ổn định của tế bào tương<br /> (23,67 mg/ml). Hình 2 cho thấy, đỉnh của đường đối ngắn, do đó, các nghiên cứu tiếp theo về<br /> cong sinh trưởng tế bào tương đối hẹp, điều này đường cong sinh trưởng tế bào cần tiến hành ghi<br /> chứng tỏ pha ổn định của tế bào khá ngắn (vào nhận sinh khối tế bào ở những khoảng thời gian<br /> khoảng ngày nuôi cấy thứ 12 đến ngày thứ 16). ngắn hơn (cứ mỗi 1 hoặc 2 ngày tiến hành thu<br /> Sau đó, sự sinh trưởng của tế bào giảm đi đáng số liệu 1 lần).<br /> <br /> 272<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3. Hình thái tế bào sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)<br /> quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính x40<br /> a. Tế bào đơn sâm Ngọc Linh; b. Tế bào đang phân chia; c. Cụm 3 tế bào;<br /> d. Cụm 4 tế bào; e. Mô sẹo tái sinh từ huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh<br /> <br /> Các giai đoạn sinh trưởng của tế bào cũng bào cây Ớt chuông (Capsicum annuum L.) chỉ<br /> phụ thuộc từng loại cây khác nhau. Trên cây kéo dài 5 ngày, sinh khối tế bào thu được vào<br /> Lộc vừng hoa vàng (Barringtonia racemosa), ngày nuôi cấy thứ 20 là cao nhất [14]. Bên cạnh<br /> thời gian thích ứng với môi trường nuôi cấy kéo đó, đường cong sinh trưởng của các loài khác<br /> dài đến 14 ngày và sinh khối tế bào đạt cao nhất nhau trong cùng một chi cũng đã được nghiên<br /> vào ngày thứ 32 [4]. Giai đoạn thích nghi của tế cứu như trên cây Origanum vulgare và O.<br /> <br /> 273<br />  Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut<br /> <br /> syriacum giai đoạn thích nghi của tế bào, giai suspension culture and secondary<br /> đoạn ổn định và giai đoạn suy vong của hai loài metabolites production in persian oregano<br /> này lại có sự khác biệt. Sinh khối tế bào thu (Origanum vulgare L. ) and arabian oregano<br /> được cao nhất ở Origanum vulgare L. là vào (O. syriacum L.). Jordan J. Agric. Sci., 2(3):<br /> ngày thứ 18 và ở O. syriacum L. là vào ngày thứ 274-282.<br /> 21 [2]. Những kết quả này cho thấy, đường 3. Arya S., Arya I. D. I. and Eriksson T., 1993.<br /> cong sinh trưởng của tế bào ở các loài khác Rapid multiplication of adventitious somatic<br /> nhau không giống nhau. embryos of Panax ginseng. Plant Cell Tiss.<br /> Huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh sau khi Org., 34: 157-162.<br /> cấy chuyền 4-6 lần được trải lên môi trường MS 4. Behbahani M., Shanehsazzadeh M. and<br /> rắn có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA, Hessami M. J., 2011. Optimization of callus<br /> 30 g/l sucrose, 8,0 g/l agar. Sau 4 tuần nuôi cấy, and cell suspension cultures of Barringtonia<br /> chúng tôi nhận thấy có sự xuất hiện của các mô racemosa (Lecythidaceae family) for<br /> sẹo từ dịch huyền phù (hình 3e). Điều này lycopene production. Sci. Agric. (Piracaba,<br /> chứng tỏ, khả năng sống sót và tái sinh khá tốt Braz), 68(1): 69-76.<br /> của huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh, mở ra<br /> tiển vọng mới trong việc nhân giống và thu 5. Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học<br /> nhận sinh khối trên quy mô lớn. và Công nghệ Việt Nam, 2007. Sách Đỏ<br /> Việt Nam, phần II: Thực vật. Nxb. Khoa<br /> KẾT LUẬN học tự nhiên và Công nghệ, Hà Nội, trang<br /> 516.<br /> Trong nghiên cứu này, mẫu cấy cuống lá<br /> 6. Bonfill M., Cusidó R. M., Palazón J., Canut<br /> sâm Ngọc Linh được cảm ứng và tăng sinh tạo<br /> E., Piňol T. and Morales C., 2003.<br /> thành mô sẹo “xốp” tốt nhất trên môi trường<br /> Relationship between peroxidase activity<br /> khoáng MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l<br /> and organogenesis in Panax ginseng<br /> NAA, 30 g/l sucrose, 8,0 g/l agar, pH = 5,8 ở<br /> calluses. Plant Cell Tiss. Org., 73: 37-41.<br /> điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. Mô sẹo “xốp”<br /> được nuôi cấy trong môi trường MS lỏng bổ 7. Choi K. T., Kim M. W., Shin H. S., 1982.<br /> sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l NAA, 30 g/l Induction of callus and organ in tissue<br /> sucrose để tạo huyền phù tế bào; sinh khối tế culture of ginseng (Panax ginseng C. A.<br /> bào thu được cao nhất (23,67 mg/ml) vào ngày Meyer). Kor. J. Ginseng Sci., 6: 162-167.<br /> nuôi cấy thứ 14. Nghiên cứu này bước đầu thu 8. Duncan D. B., 1955. Multiple range and<br /> nhận được sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh multiple F test. Biometrics, 11: 1-42.<br /> dùng làm nguyên liệu ban đầu cho việc nhân<br /> 9. Elmeer K. M. S. and Hennerty M. J., 2008.<br /> giống in vitro; tiến đến việc thu nhận sinh khối<br /> Observations on the combined effects of<br /> tế bào ở quy mô công nghiệp và cung cấp nguồn<br /> light, NAA and 2,4-D on somatic<br /> nguyên liệu ổn định cho ngành sản xuất dược<br /> embryogenesis of cucumber (Cucumis<br /> liệu ở nước ta.<br /> sativus) hybrids. Plant Cell Tiss. Org., 95:<br /> Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn 381-384.<br /> Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ<br /> 10. Farzana B. C., Safiul A. F. M., Maruf H.<br /> Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã hỗ trợ<br /> M., Farhana I. J., Anita R. C., Syeda S.,<br /> kinh phí cho đề tài nghiên cứu này.<br /> Zubaida K. and Mohammed R., 2011.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO Studies with callus induction of Vitex<br /> 1. Andrew S. W., 1990. Callus induction and negundo: an aromatic medicinal plant. Am.-<br /> plant regeneration of American ginseng. Eurasian J. Sustain. Agric., 5(1): 6-14.<br /> Hort. Sci., 25(5): 571-572. 11. Gao X., Zhu C., Jia W., Gao W., Qiu M.,<br /> 2. Arafeh R. M., Shibli R. A., Mahmoud M. A. Zhang Y. and Xiao P., 2005. Induction and<br /> and Shatnawi M. A., 2006. Callusing, cell characterization of adventitious roots<br /> <br /> <br /> 274<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 265-276<br /> <br /> directly from the explants of Panax 20. Pal A., Banerjee A. and Dhar K., 1985. In<br /> notoginseng. Biotechnol. Lett., 27: 1771- vitro organogenesis and somatic<br /> 1775. embryogenesis from leaf explants of<br /> 12. Kim J. H., Chang E. J. and Oh H. I., 2005. Leucosceptum canum Sm. Plant Cell Rep.,<br /> Saponin production in submerged 4: 281-284.<br /> adventitious root culture of Panax ginseng 21. Phai D. N., Chinh N. N., Duc N. M., Cam T.<br /> as affected by culture conditions and T. V., Trung L. T. and Cang N. M., 2002.<br /> elicitors. Asia Pac. J. Mol. Biol. Cultivation and development of Vietnamese<br /> Biotechnol., 13(2): 87-91. ginseng and preliminary results of the study<br /> on cultivated Vietnamese ginseng. Spec. Iss.<br /> 13. Kim Y. S., Hahn E. J., Murthy H. N. and<br /> Med. Res., 6(1): 12-18.<br /> Paek K. Y., 2004. Effect of polyploidy<br /> induction on biomass and ginsenoside 22. Pierik R. L. M., 1987. ln vitro culture of<br /> accumulations in adventitious roots of higher plants, Martinus Nijhoff, Boston pp.<br /> ginseng. J. Plant Bio., 47(4): 356-360. 747.<br /> 14. Kittipongpatana N., Maneerat P., 23. Schenk R. U. and Hildebrandt A. C., 1972.<br /> Pattanakitkosol P. and Kittipongpatana O. Medium and techniques for induction and<br /> S., 2007. Effect of some factors on the growth of monocotyledonous and<br /> growth of Capsicum annuum L. cell dicotyledonous plant cell cultures. Can. J.<br /> suspension culture and biotransformation of Bot., 50: 199-204.<br /> hydroquinone to arbutin. CMU. J. Nat. Sci., 24. Teng W. L., Sin T. and Teng M. C., 2002.<br /> 6(2): 207-218. Explant preparation affects culture initiation<br /> 15. Lim H. T. and Lee H. S., 1997. and regeneration of Panax ginseng and<br /> Regeneration of Panax ginseng C.A. Meyer Panax quinquefolius. Plant Cell Tiss. Org.,<br /> by organogenesis DNA analysis of 68: 233-239.<br /> regenerants. Plant Cell Tiss. Org., 49: 179- 25. Thanh N. T. and Paek K. Y., 2010. Cell<br /> 187. suspension culture Panax ginseng C. A.<br /> 16. Ma X. N, Yi G. J., Huang X. L. and Zeng J. Meyer: Role of plant growth regulators and<br /> W., 2009. Leaf callus induction and medium composition on biomass and<br /> uspension culture establishment in lychee ginsenoside production. Tạp chí Khoa học,<br /> (Litchi chinensis Sonn.) cv. Huaizhi. Acta 26: 191-196.<br /> Physiol. Plant, 31: 401-405. 26. Tirajoh A., Kyung T. S. and Punja Z. K.,<br /> 1998. Somatic embryogenesis and plantlet<br /> 17. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised<br /> regeneration in American ginseng (Panax<br /> medium for rapid growth and bioassays with<br /> quinquefolium L.). In Vitro Cell. Dev. Biol.,<br /> tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15:<br /> 34: 203-211.<br /> 473-497.<br /> 27. Wang J., Gao W. Y., Zang J., Huang T.,<br /> 18. Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên,<br /> Cao Y. and Zhao Y. X., 2010. Dynamic<br /> 2006. Công nghệ tế bào. Nxb. Đại học Quốc change of metabolites and nutrients in<br /> gia Thành phố Hồ Chí Minh, 375.<br /> suspension cells of Panax quinquefolium L.<br /> 19. Nhut D. T., Huy N. P., Luan V. Q., Binh N. in bioreactor. Acta Physiol. Plant, 32: 463-<br /> V, Nam N. B., Thuy L. N. M., Ha Đ. T. N., 467.<br /> Chien H. X., Huong T. T., Cuong H. V., 28. Wang J., Gao W. Y., Zhang J., Zuo B. M.,<br /> Cuong L. K., Hien V. T., 2011. Shoot Zhang L. M. and Huang L. Q., 2012.<br /> regeneration and micropropagation of Production of ginsenoside and<br /> Panax vietnamensis Ha et Grushv. from ex polysaccharide by two-stage cultivation of<br /> vitro leaf-derived callus. Afr. J. Biotechnol., Panax quinquefolium L. cells. In Vitro Cell<br /> 10(84): 19499-19504. Dev. Bio. Plant, 48: 107-112.<br /> <br /> 275<br />  Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut<br /> <br /> 29. Wang W., Zhao X., Zhuang G., Wang S. shoot organogenesis in caryopsis cultures of<br /> and Chen F., 2008. Simple hormonal Pogonatherum paniceum (Poaceae). Plant<br /> regulation of somatic embryogenesis and/or Cell Tiss. Org., 95: 57-67.<br /> <br /> <br /> <br /> EFFECTS OF SOME FACTORS ON FRIABLE CALLUS INDUCTION AND CELL<br /> SUSPENSION CULTURE OF Panax vietmamensis Ha et Grushv.<br /> <br /> Le Kim Cuong, Hoang Xuan Chien, Nguyen Ba Nam, Trinh Thi Huong, Duong Tan Nhut<br /> Tay Nguyen Institute of Biology, VAST<br /> <br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> In the present study, the effects of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), -naphthaleneacetic acid<br /> (NAA), mineral salt formulations, explant sources, cultural conditions on friable callus induction and cell<br /> suspension culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv. were investigated. The results showed that the friable<br /> callus induction rate, fresh weight and dry weight were 1.6-fold higher when calli were cultured on media<br /> supplemented with 1.0 mg/l 2,4-D and 1.0 mg/l NAA than those cultured on media with 2,4-D alone. The best<br /> medium for friable callus proliferation was Murashige and Skoog (MS) supplemented with 1.0 mg/l 2,4-D<br /> and 1.0 mg/l NAA. Petiole explants cultured under 16/8 h light/dark photoperiod resulted in the best friable<br /> callus induction rate, fresh weight and dry weight (100%, 453 mg/explant, 23 mg/explant, respectively). After<br /> 8 weeks of culture, friable calli were transferred to MS liquid medium supplemented with 1.0 mg/l 2,4-D, 1.0<br /> mg/l NAA and 30 g/l sucrose. The suspension cell cultures were maintained on a rotary shaker at 100 rpm.<br /> The maximum cell biomass of 23.67 mg/ml fresh weight was obtained after 14 days of culture.<br /> Key words: Panax vietnamensis, cell suspension, growth curve, friable callus, petiole, 2,4-D, NAA.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 21-6-2012<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 276<br />