Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên quá trình hình thành bào tử nghỉ của ký sinh trùng Perkinsus sp. trên nghêu bến tre (meretrix lyrata)

Chia sẻ: Thi Thi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

134
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên sự hình thành bảo tử nghỉ của ký sinh trùng Perkinsus sp. trên nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) thương phẩm trong điều kiện thí nghiệm, nghiên cứu này đã thu 1.800 mẫu nghêu từ Bến Tre để thí nghiệm với các mức nhiệt độ 20, 25, 30, 400 C và độ mặn 0, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30‰ được nuôi ủ trong điều kiện yếm khí và tối. Các ống nghiệm ở mỗi mức thí nghiệm sẽ được kiểm tra sự có mặt của bào tử nghỉ theo phương pháp của Ray (1952) và được điều chỉnh bởi Choi và ctv (1989) sau 1, 2, 4, 7 và 14 ngày ủ trong môi trường Ray fl uid thioglycollate medium (RFTM). Kết quả nghiên cứu cho thấy ký sinh trùng Perkinsus spp.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên quá trình hình thành bào tử nghỉ của ký sinh trùng Perkinsus sp. trên nghêu bến tre (meretrix lyrata)

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐỘ MẶN LÊN QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH BÀO TỬ NGHỈ CỦA KÝ SINH TRÙNG PERKINSUS SP. TRÊN NGHÊU BẾN TRE (Meretrix lyrata) EFFECTS OF TEMPERATURE AND SALINITY ON THE IN VITRO HYPNOSPORE FORMATION OF PERKINISUS SP. IN BEN TRE HARD CLAMS (Meretrix lyrata) Hứa Thị Ngọc Dung1, Phạm Quốc Hùng1 Ngày nhận bài: 09/11/2015; Ngày phản biện thông qua: 09/3/2016; Ngày duyệt đăng: 15/12/2016 TÓM TẮT Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và độ mặn lên sự hình thành bảo tử nghỉ của ký sinh trùng Perkinsus sp. trên nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) thương phẩm trong điều kiện thí nghiệm, nghiên cứu này đã thu 1.800 mẫu nghêu từ Bến Tre để thí nghiệm với các mức nhiệt độ 20, 25, 30, 400C và độ mặn 0, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30‰ được nuôi ủ trong điều kiện yếm khí và tối. Các ống nghiệm ở mỗi mức thí nghiệm sẽ được kiểm tra sự có mặt của bào tử nghỉ theo phương pháp của Ray (1952) và được điều chỉnh bởi Choi và ctv (1989) sau 1, 2, 4, 7 và 14 ngày ủ trong môi trường Ray ﬂuid thioglycollate medium (RFTM). Kết quả nghiên cứu cho thấy ký sinh trùng Perkinsus spp. có thể biến thái từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ trong khoảng nhiệt độ nước từ 20-350C. Trong đó, nhiệt độ 30-350C được xem là khoảng nhiệt độ tối ưu cho quá trình biến thái từ thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ vì thời gian biến thái xảy ra nhanh nhất (sau một ngày ủ). Còn ở 200C, quá trình biến thái diễn ra chậm hơn (sau 7 ngày ủ). Qua thí nghiệm ảnh hưởng của độ mặn lên sự hình thành bào tử nghỉ từ thể dinh dưỡng của ký sinh trùng Perkinsus cho thấy đây là một loài rộng muối vì bào tử nghỉ được phát hiện ở tất cả các nghiệm thức độ mặn khác nhau, kể cả ở mức 0‰. Tuy nhiên, quá trình hình thành bào tử nghỉ diễn ra nhanh hơn ở mức độ mặn >15‰ (xuất hiện bào tử nghỉ trong 1, 2 ngày đầu ủ). Trong khi đó từ độ mặn 15‰ (after 1-2 incubation days). In salinity level ≤10‰ hypnospore of Perkinsus sp. were formed slower (after 4-7 incubation days). Keywords: Perkinsus, Ben Tre hard clams (Meretrix lyrata), hypnospore, Protozoa parasite 1 Viện Nuôi trồng thủy sản - Trường Đại học Nha Trang 42 • NHA TRANG UNIVERSITY Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, nghề nuôi động vật thân mềm 2 mảnh vỏ ở Việt Nam đã và đang phát triển mạnh mẽ với các đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao như nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata), nghêu lụa (Paphia undulata), tu hài (Lutraria rhynchaena), ngao dầu (Meretrix meretrix Linnaeua, 1758),… Tuy nhiên, song song với việc phát triển đó, nghề nuôi các đối tượng này phải đối mặt với những khó khăn do hiện tượng chết hàng loạt trên diện rộng tại nhiều địa phương trong cả nước, nhưng chưa rõ nguyên nhân. Những thiệt hại về kinh tế, môi trường nghiêm trọng gây lo lắng cho người dân và cả nhà quản lý, tìm ra nguyên nhân và các giải pháp ngăn ngừa hoặc giảm thiểu thiệt hại trở nên cấp thiết. Hiện nay, có nhiều nguyên nhân được cho là đã gây ra dịch bệnh trên nhiều loài động vật hai mảnh vỏ có giá trị tại Việt Nam, trong đó có ký sinh trùng đơn bào thuộc giống Perkinsus. Các báo cáo cho thấy Perkinsus đã gây ra tỷ lệ chết cao và hàng loạt cho nhiều loại nhuyễn thể có giá trị trên toàn thế giới. Villalba và ctv (2004) cho biết, Perkinsus sp. gây hoại tử mô, giảm tăng trưởng, giảm khả năng sinh sản, giảm sự tích trữ năng lượng của mô vật chủ và gây ra tỷ lệ chết cao cho vật chủ của nó [7]. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về bệnh trên động vật hai mảnh vỏ, đặc biệt là bệnh do Perkinsus spp. gây ra còn rất ít. Kết quả Số 4/2016 của các công trình nghiên cứu cho đến nay cho thấy sự hiện hữu của một tác nhân có hình thái giống Perkinsus trên một số loài hai mảnh vỏ nuôi tại nhiều vùng nuôi trọng điểm tại nước ta. Phần lớn các nghiên cứu này chỉ dừng lại ở mức độ xác định sự có mặt và mức độ cảm nhiễm của Perkinsus bằng một số các kỹ thuật như mô học và nuôi trong môi trường FTM [1, 2, 3, 4]. Thông tin về tác động của các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ mặn lên sự biến thái của Perkinsus trên nghêu Bến Tre ở Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự biến thái của ký sinh trùng Perkinsus trên nghêu sẽ giúp ích cho việc xác định thời điểm thả giống, thời điểm thu hoạch có thể tránh được thời điểm bùng phát bệnh do Perkinsus gây ra trên nghêu nuôi tại Việt Nam. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu 1800 mẫu nghêu thương phẩm thu tại Bến Tre được sử dụng để bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của các mức nhiệt độ và độ mặn khác nhau lên sự hình thành bào tử nghỉ của ký sinh trùng Perkinsus trên nghêu Bến Tre trong điều kiện thí nghiệm. Nghêu được sử dụng trong nghiên cứu này có kích cỡ về chiều dài, chiều rộng, chiều cao và trọng lượng trung bình tương ứng như sau: 3,57±0,18; 2,91±0,16; 1,83±0,12; 13,56±2,17. Hình 1. Nghêu dùng trong thí nghiệm và thao tác đo kích thước, cân trọng lượng nghêu 2. Phương pháp nghiên cứu Nghêu thí nghiệm được thu tại cùng một địa điểm là Bình Đại - Bến Tre. Căn cứ vào kết quả thí nghiệm trước về tỷ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm cho thấy nghêu ở địa điểm này có tỷ lệ cảm nhiễm Perkinsus ở mang rất cao (>93%) với cường độ nhiễm >19.000 bào tử nghỉ/g mang. Chính vì vậy, nghêu ở địa điểm này NHA TRANG UNIVERSITY • 43 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản đã được lựa chọn thu để làm tiếp thí nghiệm về ảnh hưởng các mức nhiệt độ và độ mặn lên thời gian hình thành bào tử nghỉ trên nghêu. 2.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự hình thành bào tử nghỉ của Perkinsus 600 mẫu nghêu thương phẩm được sử dụng để tiến hành thí nghiệm với bốn mức nhiệt độ (20, 30, 35, 400C) ảnh hưởng lên thời gian biến thái (1, 2, 4, 7 và 14 ngày) của ký sinh trùng Perkinsus từ giai đoạn thể dinh dưỡng thành bào tử nghỉ. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mô mang của các cá thể nghêu được thu, cân và đặt vào các ống nghiệm 15ml có chứa môi trường FTM có bổ sung kháng sinh (mang của 10 cá thể nghêu/1 ống nghiệm). Sau khi được lắc trộn đều mang với môi trường, các ống nghiệm chứa mẫu được ủ ở các mức nhiệt độ 20, 30, 35, 400C trong bóng tối và lần lượt được mang đi hủy cơ kiểm tra sự hình thành bào tử nghỉ sau 1, 2, 4, 7 và 14 ngày ủ. Thí nghiệm tiến hành cho tới khi quan sát thấy bào tử nghỉ xuất hiện thì dừng. Kích thước nghêu trong thí nghiệm được cân đại đo đại diện 35 con nghêu với kích cỡ trung bình về chiều dài, chiều rộng, chiều cao và trọng lượng tương ứng như sau: 3,59±0,19; 2,93±0,17; 1,82±0,14; 13,90±2,34. Do mục tiêu của thí nghiệm là theo dõi thời gian hình thành bào tử nhanh hay chậm ở các mức nhiệt độ khác nhau nên các số liệu trên chỉ thể hiện kích cỡ nghêu trong thí nghiệm chứ không trình bày trong phần kết quả nghiên cứu. 2.2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của độ mặn lên sự hình thành bào tử nghỉ của Perkinsus Nước cất sử dụng để pha môi trường FTM được cho thêm NaCl và được đo độ mặn bằng khúc xạ kế điều chỉnh đến với các mức độ mặn 0, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30‰, sau đó được đem đi pha môi trường FTM, hấp tiệt trùng môi trường trước khi bố trí nghiệm. 1200 mẫu nghêu thương phẩm được sử dụng để tiến hành thí nghiệm với 8 mức độ mặn từ 44 • NHA TRANG UNIVERSITY Số 4/2016 0, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30‰ ảnh hưởng lên thời gian biến thái (1, 2, 4, 7 và 14 ngày) của ký sinh trùng Perkinsus từ giai đoạn thể dinh dưỡng thành bào tử nghỉ (tương tự như bố trí thí nghiệm nhiệt độ ở mục 2.1.) được ủ ở nhiệt độ 250C. Thí nghiệm được tiến hành cho tới khi quan sát thấy bào tử nghỉ xuất hiện thì ngừng. Kích thước nghêu trong thí nghiệm được cân đại đo đại diện 35 con nghêu với kích cỡ trung bình về chiều dài, chiều rộng, chiều cao và trọng lượng tương ứng như sau: 3,55±0,17; 2,90±0,15; 1,85±0,11; 13,21±1,95. Do mục tiêu của thí nghiệm là theo dõi thời gian hình thành bào tử nhanh hay chậm ở các mức độ mặn khác nhau nên các số liệu trên chỉ thể hiện kích cỡ nghêu trong thí nghiệm chứ không trình bày trong phần kết quả nghiên cứu. 2.3. Phân lập Perkinsus Các ống nghiệm chứa mẫu trong dung dịch FTM (Fluid Thioglycolate Medium) có bổ sung kháng sinh Chloramphenicol (200µg/ml) và Nystatin (200UI/ml) sau thời gian nuôi ủ trong bóng tối và yếm khí với nhiệt độ tùy từng nghiệm thức sẽ được đem đi ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút kéo dài trong 5 phút để loại bỏ môi trường FTM. Sau đó phần mang nghêu trong mỗi ống nghiệm sẽ được tiến hành phân hủy bằng dung dịch NaOH 2M vào ống nghiệm đến mức 14ml, lắc trộn kỹ và ủ trong bể ổn nhiệt ở 600C trong 30 phút, sau đó đem ly tâm 3000 vòng/phút kéo dài trong 5 phút, gạn bỏ hết nước NaOH bên trên. Tiếp tục lặp lại quá trình hủy cơ như trên 3 lần, sau khi gạn bỏ hết phần NaOH bên trên sau khi ly tâm lần 3, phần cặn bên dưới đáy ống nghiệm sẽ được giữ trong dung dịch PBS (Phosphate-Buffered Saline) theo phương pháp của Ray (1952) và được điều chỉnh bởi Choi và ctv (1989) [7, 15]. Các bào tử của Perkinsus (nếu có) sẽ được phát hiện bằng cách quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 10x, 40x. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2016 Hình 2. Các thao tác trong quá trình thí nghiệm A. Tách vỏ lấy mang; B. Cho mang vào ống nghiệm chứa môi trường FTM; C. Lắc trộn đều; D. Xếp vào Khay đựng; E. Đem nuôi ủ trong tủ ấm với nhiệt độ tùy từng thí nghiệm; F. Ly tâm ở 3000rpm kéo dài trong 5 phút; G. Đổ bỏ dịch nổi bên trên; H. Thêm NaOH 2M; I. Lắc trộn đều; J. Đem ủ trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 600C; K. Giữ cặn sau ly tâm trong 1ml PBS III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN biến thái từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ của kí sinh trùng Perkinsus sp. trên nghêu Bến Tre được trình bày ở Bảng 1. Bào tử nghỉ xuất hiện ở các thời điểm khác nhau trong các lô thí nghiệm 20, 30 và 350C và không xuất hiện ở 400C. 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự hình thành bào tử nghỉ của Perkinsus Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của các mức nhiệt độ 20, 30, 35, và 400C lên thời gian Bảng 1. Ngày xuất hiện bào tử nghỉ dưới ảnh hưởng của nhiệt độ Ngày ủ Nhiệt độ (0C) 20 30 35 40 1 - + + - 2 - NK NK - 4 - NK NK - 7 + NK NK - 14 NK NK NK - (+): Phát hiện bào tử nghỉ; (-): Không phát hiện; NK: Khi đã phát hiện bào tử nghỉ (+) thì ngừng kiểm tra vào các ngày tiếp theo Ở nhiệt độ 30 và 350C quá trình biến thái từ thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ xảy ra rất nhanh, quan sát thấy bào tử nghỉ ngay sau ngày ủ đầu tiên. Trong khi đó ở nhiệt độ 200C quá trình biến thái từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ diễn ra chậm hơn, quan sát thấy bào tử nghỉ sau 7 ngày ủ. Như vậy, trong điều kiện thí nghiệm, quá trình biến thái của kí sinh trùng Perkinsus sp. từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang giai đoạn bào tử nghỉ diễn ra nhanh nhất ở 2 mức nhiệt độ 30 và 350C. Do đó, mức nhiệt độ 30 và 350C có thể được xem là mức nhiệt độ tối ưu cho sự hình thành bào tử nghỉ của ký sinh trùng Perkinsus sp. trong điều kiện thí nghiệm. Kết quả thu được từ nghiên cứu này trùng khớp với kết quả nghiên cứu của Park và ctv (2009) thực hiện trên nghêu Ruditapes philippinarum ở mức nhiệt độ 300C: bào tử nghỉ xuất hiện ngay sau ngày ủ đầu tiên. Tuy nhiên, kết quả của nghiên cứu này có sự sai khác các mức nhiệt độ thấp như: ở nhiệt độ 200C bào tử NHA TRANG UNIVERSITY • 45 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản nghỉ được quan sát thấy vào ngày thứ 2 sau khi ủ, trong khi đó ở nhiệt độ 100C và 40C bào tử nghỉ xuất hiện vào ngày thứ 7 sau khi ủ. Như vậy có thể thấy rằng, sự biến thái từ thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ ủ ở nhiệt độ cao diễn ra nhanh hơn (200C và 300C), ở nhiệt độ thấp quá trình xảy ra chậm hơn (40C và 100C). Điều này có thể do sự khác biệt về nhiệt độ giữa các khu vực địa lý, nghiên cứu của Park và ctv (2009) được tiến hành tại Hàn Quốc – là khu vực ôn đới nên mức nhiệt độ thí nghiệm từ 4 – 300C, còn Việt Nam là nước thuộc khu vực nhiệt đới nên các mức nhiệt độ trong thí nghiệm này được điều chỉnh cao hơn. Ngoài ra, có thể do đối tượng thí nghiệm của hai nghiên cứu khác nhau (nghêu Bến Tre Meretrix lyrata và nghêu Ruditapes philippinarum). Theo Casas Số 4/2016 và ctv (2002), nhiệt độ là một trong những yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử nghỉ và phát sinh bào tử động. Ở nhiệt độ cao, quá trình hình thành bào tử nghỉ và phát sinh bào tử động diễn ra thuận lợi hơn. Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của Dungan và Hamilton (1995) cho thấy nhiệt độ 400C là nhiệt độ gây chết đối với kí sinh trùng Perkinsus marinus. Kết quả từ nghiên cứu này ở mức nhiệt độ 400C, không quan sát thấy bào tử nghỉ sau 1, 2, 4, 7, 14 cho thấy sự trùng khớp với kết quả của Dungan và Hamilton (1995) [9]. Ngoài ra, các thông báo từ các cuộc khảo sát của Park và Choi (2001), Chu và ctv (1994), cũng cho thấy nhiệt độ yếu tố quyết định mức độ nhạy cảm của sò Manila và hàu Crassotrea virginica đối với Perkinsus [8, 15]. Hình 2. Bào tử nghỉ kí sinh trùng Perkinsus sp. 2. Ảnh hưởng của độ mặn lên sự hình thành bào tử nghỉ của Perkinsus Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của độ mặn lên quá trình biến thái của kí sinh trùng 46 • NHA TRANG UNIVERSITY Perkinsus sp. trên nghêu Bến Tre từ giai đoạn thể dinh dưỡng sang bào tử nghỉ ở các mức các mức độ mặn 0, 3, 5, 10, 15, 20, 25 và 30‰ cho thấy có sự khác biệt về thời gian biến thái