TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 58-65<br />
<br />
ẢNH HƯỞNG MỘT SỐ YẾU TỐ TỚI KHẢ NĂNG TẠO CHẤT HOẠT HÓA<br />
BỀ MẶT SINH HỌC CỦA CHỦNG ACINETOBACTER CALCOACETICUS H3<br />
PHÂN LẬP TỪ VEN BIỂN VIỆT NAM<br />
Vương Thị Nga*, Kiều Thị Quỳnh Hoa, Lại Thúy Hiền<br />
Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam, *ngavuong1978@gmail.com<br />
TÓM TẮT: Với đặc tính ưu việt như hoạt động bề mặt, nhũ tương hóa, tạo bọt, chất hoạt hóa bề mặt sinh<br />
học (CHHBMSH) được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực nông nghiệp,<br />
hóa học, y dược và đặc biệt là trong công nghiệp dầu khí. Việc phân lập và tuyển chọn các vi sinh vật biển<br />
có khả năng tạo CHHBMSH cao cũng như tìm hiểu cấu trúc hóa học của chúng luôn cần thiết nhằm ứng<br />
dụng chúng trong xử lý ô nhiễm dầu ven biển. Từ các mẫu cát thu thập tại ven biển Việt Nam, chúng tôi<br />
phân lập được chủng vi khuẩn H3 có khả năng tạo CHHBMSH cao. Phân tích trình tự 16S rDNA cho<br />
thấy, chủng H3 tương đồng 99,9% với trình tự 16S rDNA của loài Acinetobacter calcoaceticus. Đã tìm<br />
được điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp CHHBMSH của chủng này là nhiệt độ 30oC, pH 7, nồng độ NaCl<br />
0-1% và nguồn carbon là dầu DO với chỉ số nhũ hóa E24 đạt 84%, hàm lượng CHHBMSH thô 15,73 g/l.<br />
Phân tích GC-MS cho thấy, CHHBMSH do chủng H3 tạo ra có chứa nhóm kỵ nước (-CH3) và nhóm ưa<br />
nước (-COOH) với cấu trúc hóa học là C16H22O4 (1,2 benzendicarboxylic axit, bis 2-metyl propyl este).<br />
Từ khóa: Acinetobacter, chỉ số nhũ hóa E24, chất hoạt hóa bề mặt sinh học, hydrocarbon, ô nhiễm dầu.<br />
MỞ ĐẦU<br />
<br />
Chất hoạt hóa bề mặt sinh học<br />
(CHHBMSH) là những hợp chất lưỡng cực có<br />
hoạt tính bề mặt do vi sinh vật tạo ra. Chúng có<br />
chứa cả nhóm chức ưa nước và ưa dầu trong<br />
cùng một phân tử. Các phân tử này làm giảm<br />
sức căng bề mặt giữa pha dầu và pha nước, làm<br />
tăng tính linh động và độ hòa tan của<br />
hydrocarbon dầu mỏ, giúp hydrocarbon dầu mỏ<br />
tan trong nước dưới dạng nhũ tương, từ đó làm<br />
tăng bề mặt tiếp xúc giữa vi sinh vật và phân tử<br />
dầu do đó dầu dễ dàng bị phân hủy. Đồng thời,<br />
CHHBMSH làm tăng hiệu quả phân hủy dầu<br />
bằng việc tách vi sinh vật ra khỏi các giọt dầu<br />
nhỏ sau khi chúng hoàn thành quá trình phân<br />
hủy để thực hiện quá trình phân hủy tiếp theo<br />
[6, 12].<br />
Trên thế giới, có nhiều nghiên cứu về khả<br />
năng tăng cường phân hủy hydrocarbon dầu mỏ<br />
bằng CHHBMSH từ vi khuẩn thuộc chi<br />
Acinetobacter [1, 3, 6]. CHHBMSH đầu tiên<br />
được Bayer [9] tách chiết từ chủng vi khuẩn<br />
Acinetobacter calcoaceticus RAG-1. Sau đó, La<br />
Rivie [9] phát hiện ra khả năng ứng dụng chất<br />
này trong khai thác dầu khí. Theo nhiều công<br />
bố, CHHBMSH do vi khuẩn thuộc chi<br />
Acinetobacter tạo ra thuộc nhóm Lipopeptide,<br />
58<br />
<br />
Emulsan và Alasan [2, 3, 15]. Những chất này<br />
an toàn hơn so với CHHBM tổng hợp và ngày<br />
càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh<br />
vực khác nhau đặc biệt là trong xử lý ô nhiễm<br />
môi trường do dầu mỏ.<br />
Ở Việt Nam, vi khuẩn biển có khả năng tạo<br />
CHHBMSH đã được nghiên cứu từ những năm<br />
đầu của thập kỷ trước với sự đa dạng về thành<br />
phần loài như: Pseudomonas sp., Rhodococcus<br />
sp., Bacillus sp., Shigella sp. và Acinetobacter<br />
sp. [7, 8, 14]. Đặc biệt, với sự xuất hiện ở tần<br />
suất lớn chi Acinetobacter tại các địa điểm ô<br />
nhiễm dầu ven biển đã nói lên vai trò của chúng<br />
trong quá trình phân hủy hydrocarbon dầu mỏ.<br />
Trong bài báo này, chúng tôi đề cập đến ảnh<br />
hưởng của một số yếu tố tới khả năng tạo<br />
CHHBMSH<br />
của<br />
chủng<br />
Acinetobacter<br />
calcoaceticus H3 cũng như tìm hiểu bản chất<br />
hóa học của CHHBMSH tạo thành. Đây sẽ là cơ<br />
sở dữ liệu cho việc ứng dụng CHHBMSH do<br />
chủng H3 tạo ra trong xử lý ô nhiễm dầu ven<br />
biển Việt Nam.<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
<br />
Vật liệu<br />
Chủng vi khuẩn H3 phân lập từ mẫu cát ven<br />
biển Việt Nam.<br />
<br />
Vuong Thi Nga, Kieu Thi Quynh Hoa, Lai Thuy Hien<br />
<br />
Sử dụng môi trường khoáng Gost 9023-74<br />
bổ sung 5% dầu diezel (DO) để phân lập và<br />
nghiên cứu khả năng tạo CHHBMSH của chủng<br />
nghiên cứu. Môi trường hiếu khí API RP38<br />
được sử dụng để quan sát hình thái khuẩn lạc.<br />
Phương pháp<br />
Nghiên cứu hình thái tế bào dưới kính hiển<br />
vi điện tử SEM S4800 (Nhật Bản).<br />
Đánh giá khả năng tạo CHHBMSH của<br />
chủng nghiên cứu bằng xác định chỉ số nhũ hóa<br />
<br />
E24 (theo Pruthi).<br />
Đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn bằng đo<br />
mật độ quang tại bước sóng 600 nm.<br />
Phân loại vi khuẩn dựa vào phân tích trình<br />
tự gen 16S rRNA.<br />
Phân tích cấu trúc hóa học của CHHBMSH<br />
bằng GC-MS.<br />
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
<br />
Đặc điểm phân loại chủng H3<br />
<br />
Hình 2. Hình thái tế bào chủng H3 (độ phóng<br />
đại 30.000 lần)<br />
<br />
Hình 1. Hình thái khuẩn lạc chủng H3<br />
<br />
0,02<br />
<br />
Acinetobacter psychrotolerans_ AB207814<br />
58 100 Acinetobacter calcoaceticus_ AJ888983<br />
H3<br />
59<br />
<br />
58<br />
100<br />
<br />
Acinetobacter baylyi_AF509820<br />
Acinetobacter soli_EU290155<br />
<br />
100 H1<br />
Acinetobacter lwoffii_X81665<br />
56<br />
100<br />
70<br />
<br />
Acinetobacter gyllenbergii_AJ293694<br />
Acinetobacter johnsonii_Z93440<br />
Acinetobacter junii_X81664<br />
Acinetobacter baumannii_X81660<br />
<br />
62<br />
<br />
Acinetobacter radioresistens_X81666<br />
Ochrobactrum tritici_AJ242584<br />
<br />
Hình 3. Vị trí phân loại của chủng H3 và các loài có quan hệ họ hàng gần<br />
Chủng vi khuẩn H3 có khả năng tạo<br />
CHHBMSH, được phân lập từ các mẫu cát ven<br />
biển Việt Nam. Trên môi trường chọn lọc, khuẩn<br />
lạc của chủng H3 màu trắng đục ánh xanh, tròn<br />
<br />
lồi, bề mặt bóng ướt, đường kính 2,0-3,0 mm<br />
(hình 1). Chủng H3 thuộc vi khuẩn gram âm, tế<br />
bào hình cầu xếp đôi, ba hoặc kết đám với kích<br />
thước 0,7-1,0 m. Đặc biệt, chủng này có cấu<br />
59<br />
<br />
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 58-65<br />
<br />
trúc dạng ống pili làm cầu kết nối giữa các tế bào<br />
(hình 2). Để xác định vị trí phân loại, chủng vi<br />
khuẩn H3 được phân tích trình tự 16S-rDNA và<br />
so sánh trình tự thu được với Gen Bank để tìm<br />
những loài có trình tự tương đồng với chủng<br />
nghiên cứu. Kết quả cho thấy, trình tự 16S rDNA<br />
của chủng H3 tương đồng 99,9% với trình tự 16S<br />
rDNA của loài Acinetobacter calcoaceticus AJ<br />
888983 (hình 3).<br />
Như vậy, chủng H3 thuộc loài vi khuẩn đã<br />
được nhiều nghiên cứu trên thế giới công bố về<br />
khả năng tạo CHHBMSH cũng như phân hủy<br />
hydrocarbon dầu mỏ [5, 10, 11]. Để có cơ sở<br />
cho việc ứng dụng CHHBMSH do chủng này<br />
tạo ra để xử lý ô nhiễm dầu tại Việt Nam, cần<br />
thiết phải nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho<br />
sinh tổng hợp CHHBMSH cũng như bản chất<br />
của CHHBMSH tạo thành của chủng H3.<br />
Khả năng tạo CHHBMSH của chủng H3<br />
Khả năng tạo CHHBMSH của chủng vi<br />
<br />
khuẩn nghiên cứu đã được đánh giá qua chỉ số<br />
nhũ hoá E24 (Pruthi). Chỉ số nhũ hóa E24 đặc<br />
trưng cho khả năng nhũ hóa với dung môi (có<br />
thể là xylen, DO, JetA1) của sản phẩm trao đổi<br />
chất do vi sinh vật tạo ra. Chủng H3 được nuôi<br />
lắc trên môi trường khoáng Gost có bổ sung 5%<br />
dầu DO là nguồn carbon duy nhất. Khả năng<br />
sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng này<br />
trong 6 ngày nuôi cấy được trình bày ở hình 4.<br />
Kết quả cho thấy, chủng H3 sinh trưởng tốt nhất<br />
và tạo CHHBMSH cao nhất sau 4-5 ngày với<br />
chỉ số nhũ hóa E24 đạt 74%.<br />
Cùng với thí nghiệm đánh giá khả năng nhũ<br />
hoá xylen của CHHBMSH, chúng tôi đã tiến<br />
hành đánh giá độ ổn định nhũ hoá trong điều<br />
kiện nhiệt độ: 4, 50, 70 và 90oC (hình 5). Kết<br />
quả cho thấy, CHHBMSH có hoạt tính ổn định<br />
ở các nhiệt độ khảo sát. Đây là yếu tố thuận lợi<br />
để ứng dụng CHHBMSH do chủng này tạo ra<br />
trong điều kiện nhiệt độ cao ở các giếng khoan<br />
dầu khí.<br />
<br />
Hình 4. Sinh trưởng và khả năng tạo CHHBMSH<br />
của chủng H3<br />
<br />
Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến<br />
sinh trưởng và tạo CHHBMSH của chủng<br />
H3<br />
Ảnh hưởng của nhiệt độ<br />
Chủng H3 đã được nuôi lắc trên môi trường<br />
khoáng Gost có bổ sung 5% DO trong các điều<br />
kiện nhiệt độ 15, 20, 30, 37 và 40oC. Kết quả<br />
cho thấy, chủng H3 sinh trưởng và tạo<br />
CHHBMSH tốt trong khoảng nhiệt độ từ 22 đến<br />
37oC, nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 30oC với<br />
<br />
60<br />
<br />
Hình 5. Độ ổn định nhũ hóa của<br />
CHHBMSH do chủng H3 tạo ra ở<br />
các nhiệt độ khác nhau<br />
<br />
chỉ số nhũ hóa E24 đạt 75% sau 4 ngày nuôi<br />
cấy. Ở nhiệt độ cao (40oC) hoặc thấp (15oC),<br />
chủng H3 sinh trưởng chậm và yếu với chỉ số<br />
E24 chỉ đạt 17-19% (hình 6).<br />
Theo các công bố trên thế giới, nhiệt độ tối<br />
ưu cho quá trình sinh trưởng và tạo CHHBMSH<br />
của vi khuẩn thường nằm trong khoảng từ 28<br />
đến 30oC [2, 13]. Như vậy, dải nhiệt độ thích<br />
hợp cho sinh tổng hợp CHHBMSH của chủng<br />
H3 cũng phù hợp với các công bố về vi khuẩn<br />
ưa ấm tạo CHHBMSH.<br />
<br />
Vuong Thi Nga, Kieu Thi Quynh Hoa, Lai Thuy Hien<br />
<br />
Ảnh hưởng của nguồn carbon<br />
Để tìm nguồn carbon thích hợp cho sinh<br />
trưởng và tạo CHHBMSH, chủng H3 được nuôi<br />
lắc trên môi trường khoáng tối thiểu có bổ sung<br />
5% DO hoặc dầu ôliu hoặc glycerol. Đây cũng<br />
là nguồn carbon phổ biển được nhiều nhà khoa<br />
học trên thế giới sử dụng để sinh tổng hợp<br />
CHHBMSH.<br />
tạo<br />
<br />
Hình 7 cho thấy, chủng H3 sinh trưởng và<br />
CHHBMSH tốt<br />
nhất ở nguồn<br />
<br />
Hình 6. Khả năng tạo CHHBMSH của chủng H3<br />
ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau<br />
Ảnh hưởng của pH<br />
pH môi trường nuôi cấy cũng là một trong<br />
các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sinh trưởng<br />
và tạo CHHBMSH của vi khuẩn. Các nghiên<br />
cứu trước đây đều chỉ ra rằng, pH thích hợp cho<br />
sinh trưởng và tạo CHHBMSH của vi khuẩn nói<br />
chung đều nằm trong khoảng trung tính đến hơi<br />
kiềm. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành khảo sát<br />
khả năng sinh tổng hợp CHHBMSH của chủng<br />
H3 với dải pH: 6,5; 7; 7,5 và 8. Kết quả chỉ ra ở<br />
hình 8 cho thấy, chủng H3 sinh trưởng và tạo<br />
CHHBMSH tốt nhất ở pH trung tính (pH7) với<br />
chỉ số nhũ hóa E24 đạt 76% sau 4 ngày nuôi<br />
cấy. Ở các giá trị pH còn lại, chủng này cũng<br />
thể hiện khả năng tạo CHHBMSH tốt khi chỉ số<br />
E24 đều đạt 64-74%. So sánh với những công<br />
bố của một số tác giả trên thế giới về dải pH<br />
thích hợp cho sinh tổng hợp CHHBMSH của<br />
chi Acinetobacter, kết quả không có sự sai khác<br />
[2, 4].<br />
<br />
carbon là DO, chỉ số E24 lên tới 77% sau 4 ngày<br />
nuôi cấy. Bên cạnh đó dầu ôliu cũng là nguồn<br />
carbon thích hợp cho sinh trưởng và tạo<br />
CHHBMSH của chủng này với chỉ số E24 đạt<br />
70% sau 5 ngày. Tuy nhiên, chủng H3 không sử<br />
dụng glycerol cho sinh trưởng cũng như tạo<br />
CHHBMSH. Kết quả này cũng phù hợp với các<br />
công bố trong và ngoài nước về nguồn carbon<br />
thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp<br />
CHHBMSH của vi khuẩn là DO và ôliu [1, 7, 8].<br />
<br />
Hình 7. Khả năng tạo CHHBMSH của chủng<br />
H3 trên các nguồn cacbon khác nhau<br />
Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl<br />
Chủng H3 được chúng tôi phân lập từ môi<br />
trường biển, nồng độ muối trong nước biển ven bờ<br />
của Việt Nam dao động quanh mức 2,5%, do đó<br />
chúng tôi lựa chọn các nồng độ muối NaCl: 0; 1; 2<br />
và 3% để nghiên cứu sinh trưởng và tạo<br />
CHHBMSH của chủng này.<br />
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở hình 9<br />
cho thấy, chủng H3 có khả năng sinh tổng hợp<br />
CHHBMSH tốt nhất ở nồng độ NaCl từ 0 đến<br />
1% với khả năng nhũ hoá xylen của dịch nuôi<br />
cấy đạt lần lượt là 80% và 79% sau 4 ngày. Tuy<br />
nhiên, ở nồng độ muối cao hơn (2-3%), chủng<br />
H3 cũng sinh trưởng và tạo CHHBMSH tốt với<br />
chỉ số E24 dao động từ 63-68%. Như vậy, với<br />
khả năng sinh trưởng và tạo CHHBMSH tốt ở<br />
dải NaCl rộng (từ 0 đến 3%) sẽ là điều kiện<br />
thuận lợi cho việc ứng dụng chủng H3 trong xử<br />
lý ô nhiễm dầu ven biển Việt Nam.<br />
<br />
61<br />
<br />
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 58-65<br />
<br />
Hình 8. Khả năng tạo CHHBMSH của chủng<br />
H3 ở các giá trị pH khác nhau<br />
Phân tích sản phẩm CHHBMSH do chủng<br />
H3 tạo ra bằng sắc ký khí khối phổ (GC-MS)<br />
Chất HHBMSH do chủng H3 tạo ra được<br />
tách chiết theo phương pháp của Kretschemer.<br />
Theo đó, dịch nuôi cấy được đun nóng ở 80oC<br />
trong 30 phút, hạ pH xuống 2 và để lạnh qua<br />
đêm, sử dụng phễu chiết để thu CHHBMSH và<br />
làm khô sản phẩm. Kết quả cho thấy,<br />
CHHBMSH thô do chủng H3 tạo ra có hàm<br />
lượng 15,73g/l. So sánh với công bố của Xiao<br />
Tang et al. (2008) [16] khi nghiên cứu chủng vi<br />
khuẩn Pseudomonas aeruginosa ZJU tạo ra<br />
12,6 g/l CHHBMSH thô trên nguồn cơ chất<br />
xylen, thì hàm lượng CHHBMSH do chủng<br />
<br />
Hình 9. Khả năng tạo CHHBMSH của chủng<br />
H3 ở các nồng độ NaCl khác nhau<br />
H3 tạo ra là khá cao.<br />
Sau khi thu được CHHBMSH thô, chúng tôi<br />
tiến hành tinh sạch bằng sắc ký bản mỏng<br />
(TCL) rồi phân tích sắc kí khối phổ (GC-MS)<br />
để tìm hiểu bản chất hóa học của chất do chủng<br />
H3 tạo ra. So sánh kết quả thu được với thư viện<br />
chất chuẩn NIST cho thấy, CHHMSH có chứa<br />
các nhóm kỵ nước như metyl (-CH3), benzen và<br />
các nhóm ưa nước như cacboxylic (-COOH) với<br />
cấu trúc hóa học là C16H22O4 (1,2<br />
benzendicacboxylic axit, bis 2- metyl propyl<br />
este) (hình 10 và 11). Như vậy có thể nhận định,<br />
CHHBMSH do chủng H3 tạo ra có hoạt tính bề<br />
mặt và có bản chất hóa học phù hợp với khái<br />
niệm CHHBMSH đã nêu trên.<br />
<br />
Hình 10. Sắc ký khối phổ CHHBMSH do chủng H3 tạo ra<br />
62<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
