Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Ảnh hưởng của nano bạc lên quá trình khử trùng mẫu trong vi nhân giống cây hoa african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

---------------------------

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

DƢƠNG BẢO TRINH

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC

LÊN QUÁ TRÌNH KHỬ TRÙNG MẪU

TRONG VI NHÂN GIỐNG

CÂY HOA AFRICAN VIOLET

(SAINTPAULIA IONANTHA H. WENDL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số ngành: 60420201

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

---------------------------

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM

DƢƠNG BẢO TRINH

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC

LÊN QUÁ TRÌNH KHỬ TRÙNG MẪU

TRONG VI NHÂN GIỐNG

CÂY HOA AFRICAN VIOLET

(SAINTPAULIA IONANTHA H. WENDL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số ngành: 60420201

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt

NCS. Nguyễn Phúc Huy

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2017

TRƢỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

PHÒNG QLKH – ĐTSĐH

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

TP.HCM, ngày..… tháng…..năm 2017

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: DƢƠNG BẢO TRINH Giới tính: NỮ

Ngày, tháng, năm sinh: 07/03/1993 Nơi sinh: Bà Rị – V ng Tàu

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học MSHV: 1541880014

I- TÊN ĐỀ TÀI:

Ảnh hƣởng của nano bạc lên quá trình khử trùng mẫu trong vi nhân

giống cây hoa african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.)

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

 Thứ nhất: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng

[HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy.

 Thứ hai: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng

[HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro.

 Thứ ba: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet in vitro từ

mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc so với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2,

Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vƣờn ƣơm.

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

V- CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt

NCS. Nguyễn Phúc Huy

Cán bộ hƣớng dẫn Khoa quản lý chuyên ngành

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

CBHDI CBHDII

PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt NCS. Nguyễn Phúc Huy

CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TÂY NGUYÊN

Cán bộ hƣớng dẫn kho học : CBHDI CBHDII

PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt NCS. Nguyễn Phúc Huy

Luận văn Thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Công nghệ TP. HCM

ngày … tháng … năm …

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

TT 1 2 3 4 5 Họ và tên Chức danh Hội đồng Chủ tịch Phản biện 1 Phản biện 2 Ủy viên Ủy viên, Thƣ ký

Xác nhận củ Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận s u khi Luận văn đã đƣợc

sử chữ (nếu có).

iii

Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin c m đo n nghiên cứu “Khảo sát ảnh hƣởng củ n no bạc lên quá trình

khử trùng trong vi nhân giống cây ho african violet (Saintpaulia ionantha H.

WendL.)” là công trình nghiên cứu củ tôi dƣới sự hƣớng dẫn củ PGS.TS. Dƣơng

Tấn Nhựt và NCS. Nguyễn Phúc Huy. Nghiên cứu này c ng là một phần trong

nhánh số 3 củ Dự án trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Kho học và Công nghệ Việt

Nam “Nghiên cứu tác động củ hạt n no kim loại lên khả năng tái sinh, sinh trƣởng

phát triển và tích l y hoạt chất trong quá trình nhân giống một số cây trồng có giá

trị kinh tế c o ở Việt N m” thuộc Hợp phần IV: “Nghiên cứu cơ chế tác động và

đánh giá n toàn sinh học củ các chế phẩm n no”, mã số: VAST.TĐ.NANO.04/15-

18. Những kết quả nghiên cứu củ ngƣời khác và các số liệu đƣợc trích dẫn trong

luận văn có chú thích đầy đủ. Đề tài đƣợc tiến hành tại Phòng Sinh học Phân tử và

Chọn tạo giống cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên. Các số liệu,

kết quả, đánh giá đƣ r trong luận văn chƣ đƣợc i công bố trong bất kỳ luận văn

nào trƣớc đây. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm với nhà trƣờng về c m đo n này.

Tác giả luận văn

Ký tên

Dƣơng Bảo Trinh

LỜI CẢM ƠN

Chắc hẳn trong mỗi con ngƣời i c ng có những khoảnh khắc khó quên của

cả cuộc đời, có thể là vui hay buồn,... Nhƣng với tôi có hai dấu ấn mà tôi mãi khắc

ghi đến suốt cả cuộc đời. Đó là lúc tôi chập chững với những bƣớc đi cùng mẹ trong

những ngày đầu tiên đi học, khi còn thơ bé. Và giờ đây, cái cảm giác ấy một lần nữa

lại ùa về khi tôi bƣớc chân vào phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống cây

trồng. Chính các thầy cô, anh chị, các bạn ở đây đã tạo cho tôi có một sự tự tin, nỗ

lực hơn trong cuộc sống c ng nhƣ trong học tập. Để hoàn thành luận văn này, tôi

biết bản thân đã nhận rất nhiều sự giúp đỡ của mọi ngƣời.

Đầu tiên, với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin đƣợc bày tỏ lời

cảm ơn chân thành tới Thầy, PGS. TS. Dƣơng Tấn Nhựt. Thầy đã tận tình chỉ bảo

cho tôi biết thế nào là nghiên cứu kho học, qu sự giảng dạy củ Thầy, cả chân trời

tri thức nhƣ rực sáng trƣớc mắt tôi. Có lẽ, tôi sẽ không b o giờ biết đƣợc những

điều kỳ diệu ấy nếu nhƣ không có sự tâm huyết, nhiệt tình, tận tụy củ Thầy. Làm

sao tôi quên đƣợc từng lời răng dạy nghiêm khắc trong những buổi họp, h y những

câu chuyện hóm hỉnh trong bàn ăn, đặc biệt là hình ảnh đôi t y khẳng khiu, run run

củ Thầy trong những ngày bệnh nhƣng vẫn cố gắng gƣợng, đích thân chụp hình

kết quả thí nghiệm cho chúng tôi cốt là để số liệu, hình ảnh thu đƣợc chính xác và

sắc nét nhất. Chính giây phút ấy, tôi biết bản thân thật m y mắn khi đƣợc trở thành

học trò củ Thầy – “Ngƣời Thầy Toàn Tâm”.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến NCS. Nguyễn Phúc Huy đã chi sẻ nhiều kinh

nghiệm, những kiến thức thực tế, những lời động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt

luận văn tốt nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn B n lãnh đạo Viện Nghiên cứu Kho học Tây

Nguyên; Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo s u Đại học, các giảng viên củ Trƣờng

Đại học Công nghệ TP.HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong

suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.

Tôi xin cảm ơn tới các cán bộ phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo giống

cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên: TS. V Quốc Luận, NCS. V

Thị Hiền, TS. Nguyễn Bá N m, NCS. Hoàng Th nh Tùng, cô Phi Phƣợng. Cảm ơn

mọi ngƣời đã nhiệt tình, dành nhiều thời gi n để chỉ bảo, giúp đỡ tôi.

Tôi c ng xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến tập thể các nh chị cán bộ, nhân viên

tại công ty CP Công nghệ Sinh học Thái Dƣơng đã giúp tôi có những buổi kiến tập

thực tế bổ ích.

Xin cảm ơn tập thể lớp 15SSH21 trƣờng Đại học Công nghệ Thành phố Hồ

Chí Minh, cùng tất cả các nh chị, các bạn học sinh, sinh viên, học viên củ các

trƣờng Đại học Kho học Tự nhiên, Đại học Đà Lạt, Đại học Yersin Đà Lạt, Đại

học Huế, Đại học Tôn Đức Thắng,… đã và đ ng thực tập tại phòng Sinh học Phân

tử và Chọn tạo giống cây trồng – Viện Nghiên cứu Kho học Tây Nguyên.

Bằng sự tin yêu và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đến

ThS. BS. CKII. Trần Trọng Nhật Huy, kho Nội, Trung tâm Y tế Vietsovpetro –

bác sĩ điều trị, ngƣời đã cứu sống tôi không chỉ một mà rất nhiều lần, cảm ơn nh vì

đã luôn tận tình cứu chữ , qu n tâm, đồng hành cùng tôi trong cuộc sống. Tôi sẽ

không thể có đủ sức khỏe để hoàn thành luận văn này nếu không có anh.

Trên hết, con xin gửi lời cảm ơn đến b mẹ, chị h i và út. Dù có đi đâu, làm

gì, con (em, chị) vẫn mãi là ngƣời con, ngƣời em, ngƣời chị trong gi đình; vẫn luôn

cần một điểm tự , để đƣợc dỗ dành những phút con mít ƣớt, yếu lòng nhất. Con biết

mọi ngƣời thƣơng con, lo cho sức khỏe củ con nên đã từng rất giận khi con quyết

định rời x gi đình mình. Ông bà t thƣờng nói “Đi một ngày đàng, học một sàng

khôn”, quả đúng là nhƣ thế, bởi con cảm thấy bản thân đã chín chắn hơn rất nhiều

s u khoảng thời gi n rèn luyện. Và đặc biệt, khi càng x mọi ngƣời, con mới càng

nhận r không đâu bằng gi đình. Con xin lỗi và cảm ơn mọi ngƣời vì đã luôn tin

tƣởng con, ủng hộ cho lý tƣởng sống củ con, dẫu rằng con vẫn chƣ thành công

nhƣ mọi ngƣời kỳ vọng. Nhà là nơi để về, là nơi để yêu thƣơng đong đầy, con mãi

yêu mọi ngƣời.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn Đà Lạt – Mảnh đất thân thƣơng gắn với những câu

chuyện về “Lòng ngƣời và những Bài học trong Cuộc sống”. Trân trọng cảm ơn!

TP. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 07 năm 2017

Người thực hiện luận văn

Dƣơng Bảo Trinh

TÓM TẮT

Khử trùng mẫu cấy là gi i đoạn vô cùng quan trọng của quá trình tạo nguồn

mẫu b n đầu trong nuôi cấy in vitro. Các chất khử trùng hiện n y thƣờng có tính

độc cao gây ảnh hƣởng trực tiếp hoặc gián tiếp cho sức khỏe con ngƣời và môi

trƣờng.

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nano bạc không chỉ kháng khuẩn hiệu quả

mà còn n toàn cho con ngƣời. Do đó, n no bạc đ ng đƣợc sử dụng rộng rãi trong

nhiều lĩnh vực khác nh u nhƣ: y học, dƣợc phẩm, mỹ phẩm, sinh học, nông

nghiệp,… Tuy nhiên, các báo cáo về ảnh hƣởng của nano bạc trong gi i đoạn khử

trùng mẫu cấy thực vật vẫn còn hạn chế.

Trong nghiên cứu này, các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2,

AgNO3] và nano bạc đã đƣợc sử dụng để khử trùng mẫu cấy african violet

(Saintpaulia ionantha H. Wendl.) với dãy nồng độ, thời gian khử trùng khác nhau

nhằm khảo sát khả năng khử trùng và cảm ứng mẫu cấy của nano bạc trong giai

đoạn khử trùng mẫu. Sau khi khử trùng, chúng tôi tiến hành theo dõi và đánh giá sự

sinh trƣởng, phát triển của mẫu cấy qu các gi i đoạn khác nhau.

Kết quả cho thấy, mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng nano bạc ở nồng độ 0,05%

trong 15 phút cho hiệu quả tốt nhất mà không có tác động xấu đến sự sinh trƣởng và

phát triển của mẫu cấy. Nano bạc kích thích sự cảm ứng của mẫu cấy. Đây là

nghiên cứu đầu tiên về khả năng khử trùng c ng nhƣ v i trò của nano bạc lên sự

vii

sinh trƣởng và phát triển của cây african violet (Saintpaulia ionantha H. Wendl.).

ABSTRACT

Surface sterilization is the most important step in preparation of explants for

micropropagation, because controlling fungal and bacterial contamination of plant

from field sources is very difficult. Most of surface disinfectants are now highly

toxic influence either directly or indirectly to human health and the environment.

Many studies have demonstrated not only nano silver antibacterial effect

efficient but also extremely safe for humans. So, the silver nanoparticles have been

widely used in many different fields of life, such as medicine, pharmaceuticals,

cosmetics, biological, agricultural,... However, reports on the effect of silver

nanoparticles for surface sterilization of plant explants are still limited.

Nano silver and typical disinfectants [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] were tested

for sterilization of african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.), by varying their

concentration and time of exposure. The target of this study was to examine

evaluated the possibility of sterilization and stimulate explants of nano silver for

micropropagation. After performing the decontamination step, we observed to

evaluate the growth and development of explants through subsequent stages of the

micropropagation process of african violet.

The results indicated that among these sterilizing agents nano silver at

concentration of 0.05% for 15 minutes was the best for controlling the infection.

Nano silver could be applied without adverse effects on the plant growth and

development. The induction of the explants in culture was also stimulated by silver

nanoparticles. This is the first report on in vitro establishment using nano silver to

reduce bacterial infections, as well as the role of silver nanoparticles on the growth

viii

and development of african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.).

MỤC LỤC

Trang

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ........................................................................... i

LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. v

TÓM TẮT ................................................................................................................ vii

CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1

1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2

1.3. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 2

1.4. Ý nghĩ đề tài...................................................................................................... 2

1.4.1. Ý nghĩ kho học ......................................................................................... 2

1.4.2. Ý nghĩ thực tiễn .......................................................................................... 3

1.5. Kết cấu luận văn ................................................................................................. 3

CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 1

2.1. Tổng quan về cây african violet ......................................................................... 4

2.1.1. Phân loại và đặc điểm .................................................................................. 4

2.1.2. Tình hình nghiên cứu african violet ............................................................. 5

2.2. Sơ lƣợc về gi i đoạn khử trùng trong vi nhân giống thực vật ............................ 6

2.3. Sơ lƣợc về các chất khử trùng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật .................. 8

2.3.1. Calcium hypochlorite [Ca(ClO)2] ................................................................ 8

2.3.1.1. Giới thiệu ................................................................................................. 8

2.3.1.2. Nhƣợc điểm ............................................................................................. 9

2.3.2. Mercury chloride (HgCl2) ............................................................................ 9

2.3.2.1. Giới thiệu ................................................................................................. 9

2.3.2.2. Nhƣợc điểm ........................................................................................... 10

2.3.3. Một số chất khử trùng khác ....................................................................... 10

2.3.3.1. Hydro peroxide (H2O2) .......................................................................... 10

2.3.3.2. Nƣớc brom ............................................................................................. 11

2.3.3.3. Các chất kháng sinh ............................................................................... 11

2.3. Sơ lƣợc về nano bạc ......................................................................................... 11

2.3.1. Nano bạc .................................................................................................... 11

2.3.1.1. Giới thiệu về bạc kim loại và cơ chế kháng khuẩn của bạc .................. 11

2.3.1.2. Ƣu điểm của nano bạc ........................................................................... 12

2.3.2. Nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................. 13

2.3.2.1. Các nghiên cứu sinh trƣởng và phát triển của nano bạc trong

nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................................... 13

2.3.2.2. Các nghiên cứu về khả năng khử trùng của nano bạc trong nuôi

cấy mô tế bào thực vật ........................................................................... 14

CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 4

3.1. Đị điểm và thời gian tiến hành đề tài .............................................................. 17

3.2. Phƣơng pháp thí nghiệm................................................................................... 17

3.2.1. Nguồn mẫu và nguyên liệu ........................................................................ 17

3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy .................................................................................. 17

3.2.3. Điều kiện nuôi cấy ..................................................................................... 17

3.2.4. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 18

3.2.4.1. Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng

thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm

ứng mẫu cấy........................................................................................... 18

3.2.4.2. Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng

thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái

mẫu cấy in vitro ..................................................................................... 20

3.2.4.3. Nội dung 3: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african

violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc

với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở

gi i đoạn vƣờn ƣơm ............................................................................... 21

3.2. Giải phẫu hình thái và quan sát mô học ........................................................... 22

3.3. Chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu ...................................................................... 23

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 17

4.1. Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông

dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy ......... 24

4.2. Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông

dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy

in vitro .............................................................................................................. 46

4.3. Nội dung 3: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet

in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các

chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn

vƣờn ƣơm ......................................................................................................... 55

CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 59

5.1. Kết luận ............................................................................................................ 59

5.1.1. Kết quả đạt đƣợc ........................................................................................ 59

5.1.2. Quy trình khử trùng mẫu cấy african violet bằng nano bạc ...................... 59

5.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 61

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH .......................................................................... 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 63

1. Tài liệu tiếng Việt ............................................................................................... 63

2. Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................... 64

PHỤ LỤC .................................................................................................................. 71

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

B5 : Gamborg và đồng tác giả (1968)

BA : 6-Benzylaminopurine

DNA : Deoxiribonucleic acid

IBA : 3-Indol butyric acid

MS : Murashige và Skoog (1962)

NAA : Naphthalene acetic acid

xii

SAM : S-Adenosyl methionine

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác

nhân vô trùng ........................................................................................... 8

Bảng 3.1. So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng

trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy .................................................... 19

Bảng 3.2. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của mẫu cấy african violet in

vitro từ nguồn mẫu khử trùng bằng nano bạc với các chất khử

trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ....................................... 20

Bảng 3.3. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển và tạo cây hoàn chỉnh của chồi

african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng

nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2,

AgNO3] .................................................................................................. 21

Bảng 3.4. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của cây african violet in vitro

có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất

khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn

vƣờn ƣơm .............................................................................................. 22

Bảng 4.1a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc

và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ

lệ mẫu nhiễm ......................................................................................... 25

Bảng 4.1b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của

nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy

thông qua tỷ lệ mẫu nhiễm .................................................................... 26

Bảng 4.2a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc

và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ

lệ mẫu cấy chết ...................................................................................... 27

Bảng 4.2b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của

nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy

xiii

thông qua tỷ lệ mẫu cấy chết ................................................................. 28

Bảng 4.3a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc

và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy thông qua tỷ

lệ mẫu cấy thành công ........................................................................... 30

Bảng 4.3b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của

nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy

thông qua tỷ lệ mẫu cấy thành công ...................................................... 31

Bảng 4.4. Sự phát sinh hình thái khác nhau giữa nano bạc và chất khử

trùng thông dụng sau 30 ngày nuôi cấy ................................................. 41

Bảng 4.5. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của cụm chồi tái sinh từ mẫu

cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2,

Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy ............................................... 47

Bảng 4.6. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển và tạo cây hoàn chỉnh của chồi

tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc

với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 ................................................................ 52

Bảng 4.7. So sánh sự thích nghi, sinh trƣởng của cây african violet in vitro

có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với HgCl2,

xiv

Ca(ClO)2, AgNO3 sau 4 tuần ở điều kiện ex vitro ................................. 55

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1. Cây hoa african violet .............................................................................. 4

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu cấy ......................................................... 7

Bảng 2.1. Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác

nhân vô trùng ........................................................................................... 8

Hình 4.1. Sự cảm ứng giữa các mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc và

HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy ................................... 42

Hình 4.2. Giải phẫu hình thái và quan sát mô học của các mẫu cấy khử

trùng bằng nano bạc và các chất khử trùng thông dụng sau 30

ngày nuôi cấy ......................................................................................... 43

Hình 4.3. Mẫu lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc, HgCl2,

Ca(ClO)2 và AgNO3 trong gi i đoạn tái sinh chồi sau 30 ngày

nuôi cấy ................................................................................................. 48

Hình 4.4. Mẫu cấy african violet khử trùng bằng nano bạc, HgCl2,

Ca(ClO)2 và AgNO3 trong gi i đoạn tạo cây hoàn chỉnh sau 30

ngày nuôi cấy ......................................................................................... 53

Hình 4.5. Cây con tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng

nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 ................................................ 56

Hình 4.6. African violet ra hoa sau 4 tháng trồng ngoài vƣờn ƣơm ..................... 57

Hình 5.1. Sơ đồ khử trùng mẫu cấy bằng nano bạc trong quy trình nhân

giống cây african violet ......................................................................... 60

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu lá cây african violet

của HgCl2 ............................................................................................ 33

Biểu đồ 4.1b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african

violet của HgCl2 .................................................................................. 33

Biểu đồ 4.2a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu lá cây african violet

của Ca(ClO)2 ....................................................................................... 34

Biểu đồ 4.2b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african

violet của Ca(ClO)2 ............................................................................. 35

Biểu đồ 4.3a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu lá cây african violet

của AgNO3 .......................................................................................... 36

Biểu đồ 4.3b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng mẫu cuống lá cây african

violet của AgNO3 ................................................................................ 36

Biểu đồ 4.4a. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu lá african violet thành công khi khử

trùng bằng nano bạc ............................................................................ 37

Biểu đồ 4.4b. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu cuống lá african violet thành công

khi khử trùng bằng nano bạc ............................................................... 38

Biểu đồ 4.5. Biểu đồ thể hiện số chồi tái sinh từ mẫu cấy lá cây african

violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3

xvi

sau 30 ngày nuôi cấy ........................................................................... 49

Chƣơng 1

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Đƣ mẫu từ môi trƣờng ex vitro vào in vitro là gi i đoạn vô cùng khó khăn

bởi vì ở gi i đoạn này mẫu cấy thông thƣờng dễ bị nhiễm nấm, khuẩn, bị chết hoặc

mẫu cấy phát triển chậm, gây tốn kém và mất thời gi n cho ngƣời thực hiện. Có

rất nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên: chất khử trùng, nồng độ và thời

gian khử trùng mẫu cấy chƣ phù hợp là những nguyên nhân chính dẫn đến sự thất

bại trong gi i đoạn vào mẫu b n đầu (Abdi et al., 2012). Phần lớn các chất khử

trùng mẫu đ ng đƣợc sử dụng hiện nay [HgCl2, Ca(ClO)2,…] là các chất mang

tính tẩy rửa cao, kháng vi sinh vật theo cơ chế ăn mòn vách, thành tế bào vi khuẩn

và nấm nên thƣờng gây ảnh hƣởng đến mẫu cấy nhƣng vẫn không hiệu

quả trong khử trùng mẫu (Ines et al., 2013). Ngoài ra, hầu hết các chất đƣợc

sử dụng trong khử trùng mẫu cấy hiện nay đều có tác động xấu tới sức khỏe con

ngƣời (WHO, 2000). Việc tìm ra một loại chất khử trùng mới an toàn cho sức

khỏe, hiệu quả trong khử trùng mẫu và có tác dụng kích thích mẫu cấy là việc vô

cùng cần thiết.

Bạc và các muối bạc đã đƣợc sử dụng phổ biến trong khử trùng y khoa nhờ

đặc tính kháng nấm, kháng khuẩn mà không gây ảnh hƣởng đến sức khỏe và sự

tăng sinh của các mô biểu bì (Abdi et al., 2012). Mặt khác, ion bạc còn đóng v i

trò quan trọng trong việc tác động phát sinh phôi soma, tạo chồi và tạo rễ (Bais et

al., 2000), ảnh hƣởng tích cực trong điều chỉnh quá trình sinh lý bao gồm cả hình

thái của mẫu cấy (Halevy et al., 1981); do đó, ion bạc đã đƣợc sử dụng trong nuôi

cấy mô thực vật nhằm kích thích mẫu cấy c ng nhƣ hạn chế số lƣợng mẫu nhiễm

(Russell et al., 1994; Abdi et al., 2012). Thông thƣờng các ion bạc luôn đi kèm với

các cation tồn tại ở dạng muối nhƣ: bạc nitrate, bạc thiosulph te,… điều này ảnh

hƣởng đến hiệu quả hấp thu và khử trùng của ion bạc.

Công nghệ n no r đời để khắc phục tình trạng trên, với các đặc tính ƣu việt

nhƣ: tăng hiệu quả tiếp xúc bề mặt nên ion dễ dàng bám dính xâm nhập vào tế bào

vi sinh vật hay thực vật hơn, dễ dàng di chuyển bên trong thực vật giúp tăng hiệu

quả hấp thu và khử trùng, hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thành công vƣợt trội trong

lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật (Husen, Siddiqi, 2014). Nhiều nghiên cứu

chứng minh nano bạc có khả năng khử trùng đã đƣợc thực hiện, tuy nhiên chƣ có

nghiên cứu nào mang tính hệ thống và đầy đủ về ảnh hƣởng của nano bạc trong

gi i đoạn khử trùng mẫu c ng nhƣ phát sinh hình thái của mẫu cấy từ gi i đoạn in

vitro đến gi i đoạn ex vitro.

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

 So sánh khả năng khử trùng mẫu của nano bạc với các chất khử trùng thông

dụng thông qua sự cảm ứng và phát sinh hình thái của các loại mẫu cấy cây

african violet ex vitro khi vào mẫu in vitro bao gồm: Mẫu cấy lá chứa gân

chính, mẫu cấy phiến lá, mẫu cấy cuống lá cắt ngang, mẫu cấy cuống lá cắt dọc.

 Đánh giá ảnh hƣởng của nano bạc thông qua quá trình theo dõi sự sinh trƣởng,

phát triển của chồi và cây con african violet in vitro; sự sinh trƣởng, phát triển

củ cây con khi đƣ r trồng ở điều kiện vƣờn ƣơm.

1.3. Nội dung nghiên cứu

 Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng

[HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy.

 Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng

[HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro.

 Nội dung 3: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet in vitro

từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2,

Ca(ClO)2, AgNO3] ở gi i đoạn vƣờn ƣơm.

1.4. Ý nghĩa đề tài

1.4.1. Ý nghĩa khoa học

Những tiến bộ về khoa học vật liệu trong những thập niên đầu thế kỷ XXI

đã tạo tiền đề để công nghệ nano có những bƣớc phát triển mạnh mẽ và từng

bƣớc có mặt trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghệ nhƣ kho học vật liệu,

vật lý, hóa học, sinh học,… và công nghệ sinh học thực vật. Trong đó, n no bạc

đƣợc nhìn nhận nhƣ một nhân tố mới có hiệu quả trong nuôi cấy mô tế bào thực

vật. Các nghiên cứu về nano bạc hiện chủ yếu đánh giá tác động ngăn sinh tổng

hợp ethylene, từ đó gián tiếp tác động lên sinh trƣởng và phát triển của thực vật.

Ngoài ra, nano bạc còn đƣợc quan tâm vì khả năng kháng khuẩn, nấm cao. Hiện

nay, nano bạc chỉ đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân hỗ trợ khử trùng trong giai

đoạn khử trùng mẫu. Nghiên cứu này mang tính hệ thống đầy đủ về ảnh hƣởng

của nano bạc trong việc khử trùng, phát sinh hình thái của mẫu cấy ex vitro cây

african violet nói riêng và là bƣớc đầu nghiên cứu khả năng sử dụng nano bạc

khử trùng mẫu cấy thực vật nói chung.

1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Việc khử trùng mẫu cấy ex vitro hiện nay ở các phòng thí nghiệm chủ yếu

sử dụng chất khử trùng mẫu cấy có tính tẩy rử và ăn mòn c o nên có khả năng

gây độc và ức chế mẫu cấy. Ngoài r , đ phần các chất khử trùng hiện nay có

ảnh hƣởng tiêu cực đến sức khỏe con ngƣời; do đó, việc khảo sát và đánh giá

khả năng khử trùng, kháng khuẩn, nấm của nano bạc thay thế cho kháng sinh

hay các chất khử trùng này mang lại lợi ích vô cùng lớn, và là một bƣớc ngoặc

mới trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.

1.5. Kết cấu luận văn

Ngoài phần danh mục tài liệu tham khảo, nội dung chính của luận văn gồm

có 5 chƣơng:

Chƣơng 1. Mở đầu

Chƣơng 2. Tổng quan tài liệu

Chƣơng 3. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu

Chƣơng 4. Kết quả và thảo luận

Chƣơng 5. Kết luận và kiến nghị

Chƣơng 2

TỔNG QUAN

TÀI LIỆU

CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về cây african violet

2.1.1. Phân loại và đặc điểm

Ngành : Tracheobionta

Phân ngành : Spermatophyta

: Magnoliopsida Lớp

: Scrophulariales Bộ

: Gesneriaceae Họ

Chi : Saintpaulia Hình 2.1. Cây hoa african violet

Loài : Saintpaulia ionantha H. WendL. (Saintpaulia ionantha H. WendL.)

Saintpaulia spp. thuộc họ Gesneriaceae, giống Saintpaulia H. WendL. đƣợc

phân loại vào nhóm cây cỏ lƣu niên. Thân cây gồm các lá ngắn, dày và kéo dài

chậm chạp, hoặc có thân bò ngang. Rễ mọc ra từ các đốt thân (Jungnickel, Zaid,

1992).

Lá có cuống dày, phiến lá từ dạng hình tim hơi tròn đến hình elip. Các lá mọc

đối, khít với nhau và xếp lại giống nhƣ hình vƣơng miện. Lớp lông c ng góp phần

vào sự phân biệt giữa các loài. Các lông tuyến có cuống ngắn hoặc không có cuống

thì không có giá trị phân loại trong giống này. Các lông che chở trên lá có thể dài

hoặc ngắn, dựng đứng hoặc nằm ngang, sự phân bố các lông trên lá chỉ có ở dạng

thẳng đứng, có lá các lông chỉ ở dạng nằm ngang hoặc có cả hai dạng phân bố trên

cùng một lá (Jungnickel, Zaid, 1992).

Cây african violet phát triển cao khoảng 30 cm. Các lá thuôn tròn thành hình

bầu dục, dài 2,5 – 8,5 cm với một cuống 2 – 10 cm, lông mịn, kết cấu nhiều thịt.

Các ho có đƣờng kính 2 – 3 cm, với một thùy tràng hoa có 3 – 10 bông hoặc nhiều

hơn trên một cành hoa mảnh mai. Các loài hoang dã có màu tím, xanh nhạt, hoặc

trắng. African violet là loài hoa với đ dạng màu sắc, có cánh đơn cánh kép rất đẹp

mắt, có thể nở và sống dƣới ánh sáng trắng, ánh sáng nhân tạo, không gian kín nhƣ

các văn phòng làm việc mà không phải chăm sóc nhiều.

2.1.2. Tình hình nghiên cứu african violet

Nhiều giống Saintpaulia đã đƣợc nhân giống thƣơng mại và sự phát triển của

các cây mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh đƣợc thu nhận nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng.

Các cây con khỏe mạnh, sạch bệnh và giống nhau về mặt di truyền đã đƣợc lƣu trữ

trong in vitro trong một thời gian dài (Jungnickel, Zaid, 1992).

Theo Bilkey và Cocking (1982), khả năng tái tạo khác nh u củ mô biểu bì và

hạ bì ở Saintpaulia ionantha H. WendL. tùy thuộc vào môi trƣờng muối khoáng cơ

bản đƣợc sử dụng trong nuôi cấy. Môi trƣờng chứa 0,1 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA

cho sự tạo thành mô sẹo trên cuống lá cắt ngang còn nguyên lớp tế bào biểu bì và

trên cuống lá bị tách bỏ lớp biểu bì (chỉ còn lớp các tế bào hạ bì). Sự tạo cây chỉ xảy

ra trên cuống lá có chứa các lớp tế bào biểu bì. Trên môi trƣờng B5 với cùng nồng

độ các chất điều hò sinh trƣởng đã diễn ra sự tạo chồi trên cả hai loại mẫu cấy. Khi

trồng các cây thu đƣợc trên cả hai loại mô biểu bì và hạ bì đến khi ra hoa,các tác giả

nhận thấy rằng, các cây thu đƣợc từ mô hạ bì khỏe mạnh hơn, lớn hơn về khối

lƣợng tƣơi 25%, đƣờng kính lá lớn hơn 11%, nhiều lá hơn 28%, cuống lá mập hơn

14% và dài hơn 18% so với các cây thu từ các lớp tế bào biểu bì.

Theo Dallon (1987), từ lá, cuống lá và phần phát hoa của african violet có thể

phát sinh tạo cơ qu n bình thƣờng và hoàn chỉnh trên môi trƣờng có 0,5 mg/l BA

kết hợp với 0,5 mg/l NAA. Theo George (1993), việc nuôi cấy phát hoa in vitro của

các cây african violet thể khảm đã tạo ra các cây con đồng kiểu gene với cây mẹ.

Điều này có thể là do các chồi con đƣợc tạo ra từ đỉnh sinh trƣởng bên hoặc đỉnh

sinh trƣờng củ phát ho đã biệt hóa thành chồi sinh dƣỡng. Chồi con african violet

có thể nuôi cấy đƣợc trong môi trƣờng đơn giản gồm 23 g đƣờng, 240 ml nƣớc cất,

1 viên inositol 125 mg, 1 viên vitamin có chứa B1 và các khoáng tố, 4 muỗng nƣớc

dừa và 1 viên vôi nhỏ để điều chỉnh pH. H koz ki (1993) đã nghiên cứu ảnh hƣởng

của nồng độ đƣờng và pH môi trƣờng lên sự tạo mô sẹo, tái sinh và tăng trƣởng

chồi từ lá african violet. Thời gian hình thành mô sẹo và chồi ngắn nhất trên môi

trƣờng MS có chứ 30 g/l đƣờng, pH 5,8 và đây c ng là môi trƣờng cho chỉ số tái

sinh chồi cao nhất. Shizuk Ohki (1993) đã qu n sát các th y đổi bề mặt mô học của

quá trình biệt hóa chồi từ lá cây african violet bằng kính hiển vi điện tử SEM

(scanning electron microscopy). Trong nghiên cứu này, Ohki qu n sát động thái của

các sự th y đổi ở các tế bào biểu bì của lá trong suốt quá trình nuôi cấy và xác định

sự tồn tại của các loại tế bào đặc biệt mà chúng sẽ tạo ra chồi. Đồng thời c ng xác

định nồng độ chất điều hò sinh trƣởng ảnh hƣởng đến sự tạo chồi trực tiếp không

qua sự hình thành mô sẹo trên các giống đƣợc thử nghiệm.

Phạm Tấn Trƣờng và Võ Thị Bạch M i (2008) đã vào mẫu thành công cây

Saintpaulia spp. khi sử dụng Ca(ClO)2 10% trong 10 phút và c ng đạt kết quả

tƣơng tự khi dùng HgCl2 0,1% trong 5 phút; theo các tác giả, môi trƣờng 0,5 mg/l

IBA và 2,5 mg/l BA cho khả năng tái sinh chồi cao nhất và môi trƣờng chứa 0,5

mg/l IBA cho khả năng tạo rễ cao nhất.

Nguyễn Thị Kim Luyến và đồng tác giả (2008) cho rằng trong sự ra hoa của

african violet, mô phân sinh ngọn ở nách lá hoạt động trở thành mô phân sinh hoa

và cuối cùng thành nụ ho đầu tiên. Các nụ ho s u đó xuất hiện ở bên dƣới nụ hoa

đầu tiên. C ng trong nghiên cứu này, các tác giả đã kết luận acid salicylic có khả

năng cảm ứng sự chuyển mô phân sinh dinh dƣỡng thành mô phân sinh hoa. Bên cạnh đó, nồng độ AgNO3 2,5x10-4 g/l giúp cho sự nở và ngăn cản sự héo sớm của

hoa african violet in vitro.

2.2. Sơ lƣợc về giai đoạn khử trùng trong vi nhân giống thực vật

Toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro luôn luôn đƣợc tiến hành trong điều kiện

vô trùng. Vì vậy, điều kiện vô trùng là một trong những yếu tố quan trọng nhất,

quyết định sự thành bại của nuôi cấy in vitro. Phƣơng pháp vô trùng mẫu cấy phổ

biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt

nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng

xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy.

Sơ đồ xử lý mẫu cấy ex vitro:

Mẫu cấy ex vitro

Rửa kỹ bằng xà phòng và nƣớc máy

Cho vào bình tam giác ngâm trong cồn 70oC

khoảng 20 – 60 giây

Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần

Tiếp tục lắc mẫu trong dung dịch diệt khuẩn 1 – 25%

trong 5 – 15 phút với vài giọt Tween 80

Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 5 – 6 lần

Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm hoại tử

Mẫu cấy

Cấy lên môi trƣờng nuôi cấy

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu cấy

(Minh, 2004)

Trong quá trình xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm,

khuẩn; các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trƣớc khi xử lý cần rửa sạch bằng xà

phòng và nƣớc máy. Sau khi xử lý xong, mô cấy đƣợc rửa sạch nhiều lần bằng nƣớc

cất vô trùng, loại bỏ những phần bị dập trƣớc khi đặt mô cấy lên môi trƣờng nuôi

cấy (Minh, 2004). Các chất kháng sinh ít đƣợc sử dụng vì tác dụng không triệt để và

ảnh hƣởng xấu lên sự sinh trƣởng của mô cấy. Ngoài r , ngƣời ta còn sử dụng các

chất làm giảm sức căng bề mặt nhƣ: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt

nấm khuẩn. Street (1975) đã đƣ r khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các

chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy nhƣ s u:

Bảng 2.1. Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các

tác nhân vô trùng

Tác nhân vô trùng Nồng độ Thời gian xử lý (phút)

9 – 10% 5 – 30 Hypochlorite calcium [Ca(ClO)2]

Hypochlorite sodium (NaClO) 2% 5 – 30

10 – 12% 5 – 15 Hydroperoxid (H2O2)

Nƣớc brom 1 – 2% 2 – 10

0,1 – 1% 2 – 10 Mecury chloride (HgCl2)

Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60

2.3. Sơ lƣợc về các chất khử trùng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật

2.3.1. Calcium hypochlorite [Ca(ClO)2]

2.3.1.1. Giới thiệu

Ca(ClO)2 là một hợp chất thuộc nhóm chlorine, có màu trắng, dễ t n trong

nƣớc, giải phóng khí Cl2 làm cho nƣớc có mùi hắc đặc trƣng. Trong công nghệ hó

học: dùng trong nƣớc sơn, chất hò t n, chất tạo bọt, thuốc trừ sâu, hó chất chống

đông,… Xử lý nƣớc sinh hoạt, nƣớc thải công nghiệp và khu đô thị. Trong thủy sản:

tẩy trùng o, hồ, tr ng thiết bị, dụng cụ,… Diệt vi khuẩn, virus, tảo, vi sinh vật trong

môi trƣờng nƣớc. Oxi hó các vật chất hữu cơ và mầm bệnh ngoại l i trong sản xuất

giống. Trong nuôi cấy mô thực vật: sử dụng nhƣ một chất để khử trùng khi đƣ các

nguồn mẫu b n đầu từ môi trƣờng ex vitro chuyển s ng in vitro, nồng độ từ 5 – 10%

trong khoảng từ 5 – 30 phút.

Ca(ClO)2 là chất oxi hó mạnh có tác dụng oxi hó vật chất hữu cơ sống trên

cơ thể sinh vật. Chúng tác động lên thành tế bào, hệ enzyme củ vi sinh vật tiếp xúc

với Ca(ClO)2 thì nguyên tử hydro trong cấu trúc phân tử đƣợc th y thế bởi Cl2, phá

hủy hệ enzyme củ vi khuẩn, gây chết vi sinh vật.

2.3.1.2. Nhƣợc điểm

Ca(ClO)2 có tính ăn mòn c o và đây c ng chính là cơ chế diệt khuẩn của

chúng – ăn mòn màng tế bào; vì thế, chúng t không khó để gặp phải tình trạng mẫu

cấy sống nhƣng bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm hay mẫu cấy không bị nhiễm khuẩn,

không nhiễm nấm nhƣng lại chết hoặc không thể tái sinh; bởi vì các mô tế bào thực

vật rất dễ bị tổn thƣơng khi tiếp xúc với Ca(ClO)2 dẫn đến mẫu cấy sẽ khó tái sinh,

thời gian tái sinh kéo dài. Ngoài ra, ngộ độc có thể xảy r khi con ngƣời nuốt hay hít

phải Cl2 từ Ca(ClO)2. Cl2 sẽ phản ứng tạo ra HCl và HOCl gây độc đối với con

ngƣời (bỏng rát trong miệng, sƣng họng, đau họng, đau dạ dày, nôn mửa, tổn

thƣơng hệ tuần hoàn,…) (WHO, 2000; Ines et al., 2013).

2.3.2. Mercury chloride (HgCl2)

2.3.2.1. Giới thiệu

Thủy ngân là một nguyên tố hó học trong bảng tuần hoàn có ký hiệu Hg

(tiếng Hy Lạp hydr rgyrum, tức là thủy ngân) và số nguyên tử 80. Thủy ngân là

một nguyên tố kim loại nặng tồn tại ở dạng lỏng, có ánh bạc trong nhiệt độ thƣờng.

Thủy ngân đƣợc sử dụng trong các nhiệt kế, áp kế và các thiết bị kho học khác.

Thủy ngân thu đƣợc chủ yếu bằng phƣơng pháp khử khoáng chất chu s (HgS).

Mercury chloride (HgCl2) là một dạng củ thủy ngân, hiện đƣợc sử dụng phổ

biến trong nhiều lĩnh vực nhƣng chủ yếu ở quy mô phòng thí nghiệm. Trong đầu thế

kỷ 20, thủy ngân đƣợc cấp phát cho trẻ em hàng năm nhƣ là thuốc nhuận tràng và

tẩy giun. Bột ngậm cho trẻ em và một số v cxin có chứ chất bảo quản thimerosal

(một phần là etyl thủy ngân) kể từ những năm 1930. Mercury chloride còn là chất

tẩy trùng đối với các bác sĩ, bệnh nhân và thiết bị. Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, từ

năm 1994, Hussain và đồng tác giả đã thành công khi sử dụng HgCl2 nhƣ là một

chất giúp chống lại các vi khuẩn và nấm trong gi i đoạn vào mẫu b n đầu. Hiện

nay, HgCl2 thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 0,1 – 1% trong khoảng 2 – 10 phút cho

bƣớc khử trùng mẫu cấy (WHO, 2000).

2.3.2.2. Nhƣợc điểm

Thủy ngân nguyên tố lỏng ít độc, nhƣng các hợp chất và muối của nó lại rất

độc, có thể gây tổn thƣơng não và g n khi con ngƣời tiếp xúc hay nuốt phải. Ngoài

ra, thủy ngân còn dễ dàng hấp thụ qu d , các cơ qu n hô hấp và tiêu hóa. Các hợp

chất vô cơ ít độc hơn so với hợp chất hữu cơ của thủy ngân. Cho dù ít độc hơn so

với các hợp chất củ nó nhƣng thủy ngân vẫn tạo ra sự ô nhiễm đáng kể đối với môi

trƣờng vì nó tạo ra các hợp chất hữu cơ trong các cơ thể sinh vật. Một trong những

hợp chất độc nhất của nó là dimetyl thủy ngân, độc đến mức chỉ vài µl rơi vào d có

thể gây tử vong.

Chứng bệnh min m t là một dạng ngộ độc thủy ngân. Thủy ngân tấn công hệ

thần kinh trung ƣơng và hệ nội tiết, đồng thời ảnh hƣởng tới miệng, các cơ hàm mặt

và răng. Sự phơi nhiễm kéo dài gây ra các tổn thƣơng não, gây tử vong, hoặc có thể

gây ra các dị tật bẩm sinh ở thai nhi, mất khả năng điều hòa vận động, th y đổi tính

cách, mất trí nhớ, mất ngủ, mệt mỏi, đ u đầu, giảm cân, căng thẳng tâm lý và viêm

lợi (WHO, 2000).

2.3.3. Một số chất khử trùng khác

2.3.3.1. Hydro peroxide (H2O2)

Hydro peroxide (h y còn gọi là nƣớc oxi già) có công thức hó học H2O2.

Hydrogen peroxide là một chất oxi hó mạnh mẽ và đƣợc sử dụng nhƣ một chất tẩy

trắng và khử trùng. Tuy nhiên, H2O2 là chất oxi hóa mạnh có khả năng ăn mòn c o,

ảnh hƣởng đến mô biểu bì của thực vật trong quá trình khử trùng, do đó, áp suất

thẩm thấu của mẫu cấy giảm nên mẫu khó mà hấp thu các chất dinh dƣỡng từ môi

trƣờng nuôi cấy dẫn đến thời gian vào mẫu bị kéo dài. Mặc khác, hiện nay có khá

nhiều vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme catalase, enzyme này có khả năng trung

hòa tác dụng diệt khuẩn của H2O2 nên khi sử dụng H2O2 để khử khuẩn thì tác dụng

không cao.H2O2 là chất oxi hóa mạnh có thể gây nổ và ảnh hƣởng đến sức khỏe con

ngƣời. (WHO, 2000).

2.3.3.2. Nƣớc brom

Brom là nguyên tố hó học thuộc nhóm h logen, có ký hiệu Br và số nguyên

tử 35. Cả nhóm halogen thuộc nhóm VIIA trong bảng hệ thống tuần hoàn. Br có

nguyên tử khối bằng 80. Brom c ng là một chất hóa học dùng để khử trùng, khi

brom đƣợc thêm vào nƣớc nó tạo thành chất khử trùng và phản ứng với chất ô

nhiễm trong nƣớc. Brom là một là một chất có khả năng b y hơi c o, mùi hắc khó

chịu và đƣợc đánh giá là khá độc. Hơi brom gây kích ứng niêm mạc, chảy nƣớc

mắt, ho, suyễn, chóng mặt, đ u đầu, đ u bụng, chảy máu m i, gây mất trí nhớ, rối

loạn tâm thần,… (WHO, 2000).

2.3.3.3. Các chất kháng sinh

Kháng sinh h y còn gọi là trụ sinh, kháng khuẩn đƣợc sử dụng phổ biến

(Ampicillin, Penicillin, Amoxillin, Streptomycin, P romycin,…) trong nuôi cấy mô

thực vật nhằm ngăn chặn sự phát sinh hoặc tiêu diệt sự phát triển củ khuẩn, nấm

mốc. Tuy nhiên, kháng sinh lại gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sức khỏe con ngƣời là:

gây khó khăn cho chẩn đoán; tiêu diệt các vi khuẩn có lợi; gây kháng thuốc; một số

loại kháng sinh gây dị ứng, suy tủy và các bệnh khác nhƣ điếc, suy gan hay suy

thận,… Trong nuôi cấy mô thực vật thì kháng sinh đƣợc dùng để diệt hoặc ức chế

các nguồn nhiễm từ môi trƣờng ex vitro, tuy nhiên kháng sinh có khả năng hấp thụ

qua da, niêm mạc và có khả năng khuếch tán trong không khí (Ines et al., 2013),

nên việc sử dụng kháng sinh trong khử trùng mẫu là điều không đƣợc khuyến khích.

2.3. Sơ lƣợc về nano bạc

2.3.1. Nano bạc

2.3.1.1. Giới thiệu về bạc kim loại và cơ chế kháng khuẩn của bạc

Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và

nấm; tuy nhiên, bạc khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân,…), vì bạc

không thể hiện tính độc với con ngƣời. Từ x xƣ , ngƣời t đã sử dụng đặc tính này

của bạc để phòng bệnh. Ngƣời cổ đại sử dụng các bình bằng bạc để lƣu trữ nƣớc,

rƣợu dấm. Trong thế kỷ 20, ngƣời t thƣờng đặt một đồng bạc trong chai sữ để kéo

dài độ tƣơi của sữa. Bạc và các hợp chất của bạc đƣợc sử dụng rộng rãi từ đầu thế

kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều trị các vết bỏng và khử trùng (Siddhartha et al.,

2007).

Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglycan, thành phần cấu tạo nên

thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxi vào bên trong tế bào

dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc đƣợc lấy ra khỏi tế bào ng y s u đó,

khả năng hoạt động của vi khuẩn lại có thể đƣợc phục hồi. Cấu trúc tế bào củ động

vật không có thành tế bào, nên ion bạc không thể gây tổn thƣơng cho con ngƣời hay

động vật (Siddhartha et al., 2007).

Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý đƣợc mô tả nhƣ s u: sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó

sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sulfhydryl – SH của phân tử

enzyme chuyển hóa oxi và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp

của tế bào vi khuẩn. Ngoài ra, các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của

DNA và trung hò điện tích của gốc phosph te do đó ngăn chặn quá trình sao chép

DNA. Sau khi thuốc kháng sinh đƣợc phát minh và đƣ vào ứng dụng với hiệu quả

c o ngƣời t không còn qu n tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa. Tuy

nhiên, từ những năm gần đây, do hiện tƣợng các chủng vi sinh ngày càng trở nên

kháng thuốc, sự quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn hay các

ứng dụng khác của bạc đã qu y trở lại, đặc biệt là dƣới dạng hạt có kích thƣớc nano

(Siddhartha et al., 2007).

2.3.1.2. Ƣu điểm của nano bạc

Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thƣớc từ 1 nm đến 100 nm. Các hạt nano

nhỏ, có diện tích tiếp xúc bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn, tạo ra hiện

tƣợng cộng hƣởng plasmon bề mặt; hiện tƣợng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt

đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào

nồng độ và kích thƣớc hạt nano. Bạc nano là vật liệu có diện tích bề mặt riêng rất

lớn, có những đặc tính độc đáo nhƣ: tính khử khuẩn, chống nấm, có khả năng phát

xạ tia hồng ngoại đi x ; không có hại cho sức khỏe con ngƣời với liều lƣợng tƣơng

đối cao, không có phụ gia hóa chất. Ngoài ra, nano bạc còn có khả năng phân tán ổn

định trong các loại dung môi khác nhau, độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dƣới

tác dụng của ánh sáng hay các tác nhân oxi hóa khử thông thƣờng, và ổn định ở

nhiệt độ cao và chi phí cho quá trình sản xuất thấp (Kargov et al., 1986).

2.3.2. Nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.3.2.1. Các nghiên cứu sinh trƣởng và phát triển của nano bạc trong nuôi

cấy mô tế bào thực vật

Nano bạc và ion bạc đƣợc nhìn nhận nhƣ một tác nhân mới trong nuôi cấy mô

thực vật vì nó không đƣợc bổ sung trực tiếp trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng quy

với vai trò là chất dinh dƣỡng. Trong khoa học thực vật, các công trình nghiên cứu

không những tập trung vào hiệu quả kháng vi sinh vật của nano bạc, một số nhà

khoa học đã khám phá thêm đƣợc hiệu quả thú vị của nó trên thực vật trong nuôi

cấy mô đó là ức chế sinh tổng hợp ethylene, từ đó gián tiếp giúp cho sinh trƣởng

của thực vật đƣợc tăng cƣờng.

S rm st và đồng tác giả (2011) đã ghi nhận hiệu quả tích cực trong vi nhân

giống cây Araucaria excelsa. Kết quả cho thấy, cây sinh trƣởng, phát triển mạnh

trên môi trƣờng MS có bổ sung nano bạc, cây tƣơi, tăng trƣởng tốt, sắc tố ổn định

hơn so với đối chứng. Tƣơng tự nhƣ trong vi nhân giống Tecomella undulata

(Roxb.), khi bổ sung nano bạc sẽ tăng tỷ lệ sống sót, giảm hiện tƣợng rụng lá gây ra

bởi ethylene, tăng hệ số nhân chồi và chiều cao của thực vật (Aghdaei et al., 2012).

Nhiều nhà khoa học đã chứng minh đƣợc tác dụng của bạc là chất ức chế tổng hợp

ethylene trong nuôi cấy mô bằng cách ức chế hoạt động S-adenosyl-L-methionine

(SAM) – là một tiền chất để tạo thành ethylene, hoặc làm mất liên kết ethylene và

ngăn ngừa các tín hiệu ức chế của ethylene lên thực vật bao gồm các tác động tiêu

cực nhƣ rụng lá, giảm hàm lƣợng chlorophyll dẫn đến chết cây khi chuyển r điều

kiện tự nhiên (Zhao et al., 2002, Miyazaki et al., 1987). Dƣơng Tấn Nhựt và đồng

tác giả (2014) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của nano bạc (kích thƣớc ≤ 20 nm) trong

khoảng nồng độ 0 – 20 mg/l lên sự tăng trƣởng của một số loại cây trồng nuôi cấy

in vitro có giá trị kinh tế cao của Việt Nam. Kết quả cho thấy, nano bạc ở nồng độ

10 mg/l bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy cho sự sinh trƣởng tốt nhất với đối tƣợng

cúc và dâu tây, trong khi đó đối với đồng tiền là 5 mg/l; tuy nhiên, cần tiến hành

nghiên cứu chuyên sâu và quy mô rộng hơn để đánh giá tất cả các khía cạnh ảnh

hƣởng của nano bạc lên sinh lý mô và tế bào thực vật.

Nano bạc ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của cây trồng bằng cách

gây ra những biến đổi đáng kể ở mức độ sinh lý và phân tử theo hƣớng tích cực

hoặc tiêu cực tùy theo loài thực vật, kích thƣớc, cấu trúc và nồng độ nano bạc sử

dụng. Khi nghiên cứu trên sự sinh trƣởng, phát triển cây con, một số nhà khoa học

đã cho thấy, nano bạc không chỉ làm tăng cƣờng khả năng sinh trƣởng, phát triển

mà còn có v i trò tăng cƣờng các quá trình biến dƣỡng trong cây nhƣ sinh tổng hợp

chlorophyll, tổng hợp carbohydrate, protein và các enzyme chống oxi hóa của nhiều

loài thực vật. Khi hấp thu hạt nano bạc, ngoài tác dụng kháng vi sinh vật rất mạnh,

dựa vào tính chất vật lý của hạt nano bạc hấp thu ánh sáng trong dải sóng 390 – 420

nm nên khi đó tại bƣớc sóng này cƣờng độ ánh sáng đƣợc thực vật hấp thu mạnh.

Cây phát triển trên môi trƣờng có bổ sung nano bạc sinh trƣởng tốt hơn, giảm hiện

tƣợng rụng lá gây ra bởi ethylene, lá cây xanh đậm hơn do tích l y chlorophyll

mạnh hơn so với cây trên môi trƣờng đối chứng (Sarmast et al., 2011; Aghdaei et

al., 2012; Salama et al., 2012).

2.3.2.2. Các nghiên cứu về khả năng khử trùng của nano bạc trong nuôi

cấy mô tế bào thực vật

Môi trƣờng nhân giống hiện n y giàu năng lƣợng khiến cho vi sinh vật dễ

dàng tăng trƣởng, chiếm ƣu thế và cạnh tr nh dinh dƣỡng với thực vật. Vì vậy, tác

nhân vi sinh vật là một trong những vấn đề đƣợc quan tâm đầu tiên và xuyên suốt

trong nuôi cấy mô thực vật.

Ion Ag+ trƣớc n y đƣợc biết đến nhƣ một loại ion khoáng có khả năng kháng

khuẩn cao (Ines et al., 2013). Với kích thƣớc nhỏ, các hạt n no giúp tăng diện tích

tiếp xúc bề mặt, vì vậy khả năng các hạt nano bạc diệt khuẩn tốt hơn các muối chứa

ion bạc là hoàn toàn c o, đã có báo cáo ghi nhận sự khử trùng của nano bạc trong

nuôi cấy mô thực vật (Abdi et al., 2008). Việc áp dụng các hạt nano bạc trong kỹ

thuật nuôi cấy mô thực vật để ngăn chặn sự nhiễm các vi sinh vật b n đầu đƣợc báo

cáo bởi Abdi và đồng tác giả (2008). Nghiên cứu này đã đƣợc tiến hành trong giai

đoạn khử trùng của quá trình nhân giống cây Nữ lang (Valeriana officinalis L.),

nguyên nhân gây nhiễm chủ yếu là vi khuẩn Xanthomonas sp. nội sinh gây bạc lá.

Các đốt thân củ cây đƣợc ngâm trong dung dịch nano bạc (35 nm) ở h i gi i đoạn;

trƣớc và sau khi khử trùng bề mặt ở nồng độ 25, 50 và 100 µg/ml và thời gian xử lý

là 30, 60, 180, 300, 600 và 1200 phút. Kết quả thu nhận đƣợc cho thấy sử dụng

dung dịch nano bạc 100 µg/ml trong 180 phút sau khi khử trùng bề mặt có khả năng

kiểm soát nhiễm khuẩn đến 89% mà không có bất kỳ tác động bất lợi nào lên đặc

tính sinh trƣởng của cây con.

Ngoài ra, hiệu quả kháng vi sinh vật gây nhiễm trong khử trùng c ng đã đƣợc

chứng minh trên cây Araucaria excelsa R. Br. (Sarmast et al., 2011). Ở đối tƣợng

này, nano bạc đƣợc bổ sung trực tiếp vào môi trƣờng nuôi cấy in vitro và làm trì

hoãn sự xuất hiện các vi sinh vật gây nhiễm c ng nhƣ giảm tỷ lệ nhiễm trong nuôi

cấy mô. Bên cạnh đó, khả năng kháng nấm c ng đã đƣợc nghiên cứu và cho thấy

hoạt động kháng nấm của nano bạc phụ thuộc vào kích cỡ, hạt nano càng nhỏ thì

hiệu quả càng c o. Cơ chế chủ yếu cho hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc là khả

năng bám dính và khả năng xâm nhập vào bên trong màng tế bào vi khuẩn, bẻ gãy

hoặc tƣơng tác các liên kết nội phân tử DNA, protein của vi khuẩn. Tuy nhiên,

những tác động tiêu cực của chúng với thành tế bào thực vật là không thể tránh khỏi

khi xử lý ở nồng độ cao hoặc trong thời gian dài và những tác động tiêu cực đó vẫn

chƣ đƣợc làm rõ.

Rostami và Shahsavar (2009) đã thành công trong việc kiểm soát và hạn chế

nhiễm khuẩn trong nuôi cấy ô liu khi bổ sung 40 mg/l nano bạc vào

môi trƣờng MS. Gh r ti và đồng tác giả (2010) c ng đã nghiên cứu và kết luận rằng

khi bổ sung 75 ppm nano bạc vào môi trƣờng nuôi cấy óc chó B Tƣ sẽ giúp kiểm

soát hiện tƣợng nhiễm khuẩn khi nuôi cấy. Trong một thí nghiệm khác,

F khrfesh ni và đồng tác giả (2012) đã nghiên cứu hoạt động kháng khuẩn của các

nồng độ nano bạc khác nhau trong nuôi cấy mô ho đồng tiền. Kết quả cho thấy, khi

bổ sung nano bạc vào môi trƣờng nuôi cấy ở nồng độ 100 mg/l thì an toàn cho mẫu

cấy và giúp kiểm soát đƣợc vấn đề nhiễm khuẩn trong nuôi cấy.

Abdi (2012) đã thành công khi sử dụng nano bạc nồng độ 120 mg/l, kích

thƣớc 35 nm để khử trùng bề mặt mẫu Valeriana officinali L. trong nhân giống in

vitro. Gần đây nhất, Dƣơng Tấn Nhựt và đồng tác giả (2017) đã bổ sung nano bạc

vào môi trƣờng nuôi cấy ho cúc để thay thế gi i đoạn hấp khử trùng mà không gây

ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây; vì thế, nano bạc đƣợc đánh giá

là một chất khử trùng mới, hiệu quả và an toàn với thực vật. Tuy nhiên, chƣ có

nghiên cứu nào so sánh đầy đủ và hệ thống về khả năng khử trùng của nano bạc.

Chƣơng 3

VẬT LIỆU

VÀ

PHƢƠNG PHÁP

CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài

 Đị điểm: Đề tài đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và

chọn tạo giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên).

 Đề tài đƣợc tiến hành từ tháng 8 năm 2016 đến tháng 8 năm 2017.

3.2. Phƣơng pháp thí nghiệm

3.2.1. Nguồn mẫu và nguyên liệu

Đối tƣợng nghiên cứu là cây hoa african violet (Saintpaulia ionantha H.

WendL.) trồng tại vƣờn ƣơm Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên.

Mẫu lá và cuống lá của những cây hoa african violet 6 tháng tuổi (10 cm)

sinh trƣởng và phát triển tốt, không bị sâu bệnh, đƣợc chọn làm nguồn mẫu

b n đầu.

Dung dịch nano bạc do Viện Công nghệ môi trƣờng cung cấp. Các hạt

nano bạc (nAg) kích thƣớc ≤ 20 nm tạo bằng phƣơng pháp khử dung dịch

nƣớc sử dụng tiền chất là AgNO3, tác nhân khử là NaBH4 và chất ổn định

đƣợc sử dụng là chitosan (Chau et al., 2008).

3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy

Môi trƣờng đƣợc sử dụng trong thí nghiệm là môi trƣờng MS

(Murashige, Skoog, 1962) có bổ sung 30 g/l sucrose và 9 g/l agar; pH môi

trƣờng đƣợc điều chỉnh về 5,8 trƣớc khi hấp khử trùng bằng autoclave ở

121°C, 1 atm trong thời gian 30 phút và bổ sung các chất điều hò sinh trƣởng

ở tỷ lệ khác nhau theo từng gi i đoạn của thí nghiệm (Nhựt et al., 2005; Hiếu

et al., 2006).

3.2.3. Điều kiện nuôi cấy

Thí nghiệm in vitro đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 25 ± 2°C, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cƣờng độ chiếu sáng 45 µmol.m-2.s-1 dƣới ánh

sáng huỳnh qu ng và độ ẩm trung bình 55 – 60%. Thí nghiệm ex vitro đƣợc

tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 17 – 25°C, độ ẩm trung bình 70 – 80% và sử

dụng ánh sáng tự nhiên có che sáng 50%.

3.2.4. Bố trí thí nghiệm

3.2.4.1. Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng

thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng

mẫu cấy

 Mục đích

Khảo sát khả năng khử trùng mẫu cấy và ảnh hƣởng của nano bạc so với

HgCl2, Ca(ClO)2 và AgNO3 lên sự cảm ứng của mẫu cấy african violet.

 Tiến hành thí nghiệm

Mẫu cuống lá và lá african violet chọn từ vƣờn ƣơm đƣợc xử lý sơ bộ và

khử trùng bằng dung dịch HgCl2 (nồng độ 0,05%; 0,1%; 0,3%; 0,5%; 1%),

Ca(ClO)2 (nồng độ 8,5%; 9%; 9,5%; 10%; 10,5%), AgNO3 (nồng độ 0,3%;

0,5%; 0,7%; 0,1%; 1,5%) và dung dịch nano bạc (nồng độ 0,01%; 0,015%;

0,025%; 0,05%; 0,1%) có bổ sung vài giọt Tween-80 trong các khoảng thời

gian 3 phút, 5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút và 30 phút.

Mẫu cấy sau khi khử trùng đƣợc chia thành 4 loại mẫu cấy gồm: mẫu

cuống lá cắt ngang (dày 1 mm), mẫu cuống lá cắt dọc (dài 1 cm), mẫu lá chứa

gân chính giữa (0,5 x 0,5 cm), mẫu phiến lá (0,5 x 0,5 cm); và cấy lên môi

trƣờng MS có bổ sung 0,1 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA (Nhựt et al., 2005; Hiếu et

al., 2006). Riêng mẫu lá, đặt mặt dƣới tiếp xúc với môi trƣờng. Nồng độ các

chất sử dụng trong khử trùng và thời gian khử trùng th y đổi theo nghiệm thức

thể hiện cụ thể ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông dụng trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy

Chất khử trùng thông dụng Nano bạc AgNO3 HgCl2 Ca(ClO)2

Thời gian (min)

0,05 (%) 0,1 (%) 0,3 (%) 0,5 (%) 1 (%) 8,5 (%) 9 (%) 9,5 (%) 10 (%) 10,5 (%) 0,3 (%) 0,5 (%) 0,7 (%) 1 (%) 1,5 (%) 0,01 (%) 0,015 (%) 0,025 (%) 0,05 (%) 0,1 (%)

3 A (1-1) A (2-1) A (3-1) A (4-1) A (5-1) B (1-1) B (2-1) B (3-1) B (4-1) B (5-1) C (1-1) C (2-1) C (3-1) C (4-1) C (5-1) D (1-1) D (2-1) D (3-1) D (4-1) D (5-1)

5 A (1-2) A (2-2) A (3-2) A (4-2) A (5-2) B (1-2) B (2-2) B (3-2) B (4-2) B (5-2) C (1-2) C (2-2) C (3-2) C (4-2) C (5-2) D (1-2) D (2-2) D (3-2) D (4-2) D (5-2)

10 A (1-3) A (2-3) A (3-3) A (4-3) A (5-3) B (1-3) B (2-3) B (3-3) B (4-3) B (5-3) C (1-3) C (2-3) C (3-3) C (4-3) C (5-3) D (1-3) D (2-3) D (3-3) D (4-3) D (5-3)

15 A (1-4) A (2-4) A (3-4) A (4-4) A (5-4) B (1-4) B (2-4) B (3-4) B (4-4) B (5-4) C (1-4) C (2-4) C (3-4) C (4-4) C (5-4) D (1-4) D (2-4) D (3-4) D (4-4) D (5-4)

20 A (1-5) A (2-5) A (3-5) A (4-5) A (5-5) B (1-5) B (2-5) B (3-5) B (4-5) B (5-5) C (1-5) C (2-5) C (3-5) C (4-5) C (5-5) D (1-5) D (2-5) D (3-5) D (4-5) D (5-5)

30 A (1-6) A (2-6) A (3-6) A (4-6) A (5-6) B (1-6) B (2-6) B (3-6) B (4-6) B (5-6) C (1-6) C (2-6) C (3-6) C (4-6) C (5-6) D (1-6) D (2-6) D (3-6) D (4-6) D (5-6)

3.2.4.2. Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng

thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy

in vitro

 Mục đích

Theo dõi sự phát sinh hình thái của các mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng

nano bạc so với chất khử trùng thông dụng.

 Tiến hành thí nghiệm

Các mô sẹo (1 x 1 cm) thu từ các nghiệm thức tốt nhất của thí nghiệm

trƣớc đƣợc cấy lên môi trƣờng tái sinh chồi có bổ sung 0,2 mg/l BA (Nhựt et

al., 2005; Hiếu et al., 2006). Sau 1 tháng, các chồi đơn in vitro cao khoảng 1 cm

thu ở thí nghiệm trƣớc đƣợc tách ra từ các mẫu cấy và đƣợc cấy lên môi trƣờng

tạo cây hoàn chỉnh có bổ sung 0,5 mg/l BA  0,2 mg/l NAA  1 g/l than hoạt

tính (Nhựt et al., 2005; Hiếu et al., 2006). Nghiệm thức đƣợc bố trí nhƣ bảng

3.2 và bảng 3.3.

Bảng 3.2. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của mẫu cấy african violet in

vitro từ nguồn mẫu khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng thông

dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3]

STT Nghiệm thức Nguồn mẫu

Mô sẹo in vitro cây african violet có nguồn gốc 1 E1 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng HgCl2

Mô sẹo in vitro cây african violet có nguồn gốc 2 E2 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng Ca(ClO)2

Mô sẹo in vitro cây african violet có nguồn gốc 3 E3 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng AgNO3

Mô sẹo in vitro cây african violet có nguồn gốc 4 E4 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng nano bạc

Bảng 3.3. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển và tạo cây hoàn chỉnh của chồi

african violet in vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc

với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3]

STT Nghiệm thức Nguồn chồi

Chồi in vitro cây african violet có nguồn gốc F1 1 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng HgCl2

Chồi in vitro cây african violet có nguồn gốc F2 2 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng Ca(ClO)2

Chồi in vitro cây african violet có nguồn gốc F3 3 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng AgNO3

Chồi in vitro cây african violet có nguồn gốc F4 4 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng nano bạc

3.2.4.3. Nội dung 3: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african

violet in vitro từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng

thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở giai đoạn vƣờn ƣơm

 Mục đích

So sánh khả năng sống sót của cây khử trùng bằng nano bạc với các chất

khử trùng khác.

 Tiến hành thí nghiệm

Các cây african violet nuôi cấy in vitro đƣợc khử trùng bằng nano bạc,

HgCl2, Ca(ClO)2 và AgNO3 đƣợc rửa sạch g r, s u đó trồng vào vỉ với giá thể

là xơ dừa trộn với đất mùn theo tỷ lệ 1:1. Trong tuần đầu sau khi trồng, tƣới

phun sƣơng 2 lần/ngày vào sáng sớm và chiều mát, s u đó tƣới 1 lần/ngày. Thí

nghiệm này nhằm so sánh khả năng sống sót của cây khử trùng bằng nano bạc

với các chất khử trùng khác.

Các nghiệm thức đƣợc bố trí nhƣ bảng 3.4. dƣới đây:

Bảng 3.4. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của cây african violet in vitro

có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng

thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở giai đoạn vƣờn ƣơm

Nghiệm STT Loại cây con Số cây thức

Cây con african violet in vitro nhân có nguồn gốc 1 G1 30 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng HgCl2

Cây con african violet in vitro nhân có nguồn gốc

2 G2 30 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng Ca(ClO)2

Cây con african violet in vitro nhân có nguồn gốc

3 G3 30 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng AgNO3

Cây con african violet in vitro nhân có nguồn gốc 4 G4 30 từ mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng nano bạc

3.1. Giải phẫu hình thái và quan sát mô học

Mẫu chồi và mô sẹo đƣợc cắt mỏng và nhuộm kép, tạo thành tiêu bản theo

phƣơng pháp của Trần Công Khánh (1981). Qu n sát dƣới kính hiển vi quang học

(Olympus, Japan) vật kính x10, x40. Các bƣớc giải phẫu hình thái:

1. Tạo lát cắt mỏng, ngang, dọc qua trục phôi, rễ, thân lát cắt ngang lá qua thân lá.

2. Ngâm mẫu đã cắt trong Javel 10% khoảng 15 phút.

3. Rửa sạch mẫu bằng nƣớc cất.

4. Ngâm mẫu trong acid acetic 45% trong 15 phút mục đích để cố định mẫu.

5. Rửa sạch mẫu bằng nƣớc cất cho đến khi hết mùi acid (khoảng 6 lần rửa).

6. Ngâm mẫu đã ráo nƣớc trong phẩm nhuộm 2 màu trong 5 phút.

7. Rửa lại mẫu bằng bình phun nhỏ giọt cho đến khi nƣớc trong đĩ petri ngâm

mẫu không còn màu phẩm nhuộm khoảng 2 phút).

8. Ngâm mẫu trong nƣớc cất để bảo quản mẫu.

9. Đặt mẫu lên lame, nhỏ lên mẫu 1 giọt nƣớc cất hoặc 1 giọt glycerine, đậy lamelle lên (nhẹ nhàng đặt lamelle với lame 1 góc 45o rồi thả lamelle xuống,

tránh tạo bọt khí).

10. Quan sát mẫu dƣới kính hiển vi quang học 2 mắt CX21 Olympus, b n đầu ở vật

kính x4 chuyển dần lên x10, x40.

3.2. Chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu

Số chồi (chồi/mẫu), số lá (lá/mẫu), đƣờng kính lá (cm), số rễ (rễ/mẫu), khối

lƣợng tƣơi (g), khối lƣợng khô (g), tỷ lệ mẫu sống (%), đặc điểm hình thái của

mẫu cấy.

Phƣơng pháp đo đƣờng kính lá: chiều dài củ đƣờng kính kính lá chính là

khoảng cách của hai mép lá khi đi qu đƣờng trung trực của gân lá.

Tiến hành bố trí thí nghiệm theo phƣơng pháp hoàn toàn ngẫu nhiên. Các thí

nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần, thí nghiệm vào mẫu đƣợc tiến hành trên 50 bình × 1

mẫu/nghiệm thức, lấy ngẫu nhiên 20 bình để thu số liệu. Các thí nghiệm in vitro

đƣợc tiến hành trên 10 bình × 3 mẫu/nghiệm thức, lấy ngẫu nhiên 3 bình để thu số

liệu. Thí nghiệm ex vitro đƣợc bố trí 50 cây trên 1 nghiệm thức, lấy ngẫu nhiên 30

cây để thu số liệu.

Số liệu đƣợc thu nhận s u 15 ngày đối với thí nghiệm khử trùng và 30 ngày

với tất cả các thí nghiệm. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Statgraphics

Centurion XV theo phƣơng pháp DMRT (Dunc n, 1955) ở mức ý nghĩ p ≤ 0,05.

Chƣơng 4

KẾT QUẢ

VÀ

THẢO LUẬN

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Nội dung 1: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông

dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong khử trùng và cảm ứng mẫu cấy

 So sánh khả năng khử trùng mẫu cấy của nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2,

AgNO3

Phƣơng pháp thông dụng nhất hiện n y để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu

cấy là sử dụng các hóa chất có hoạt tính bề mặt có tác dụng diệt nấm và khử khuẩn.

Chất khử trùng cần đảm bảo diệt nấm, vi khuẩn, nhƣng lại phải ít độc hoặc không

gây hại đối với mẫu cấy. Có nhiều nghiên cứu chứng minh bạc nói chung và nano

bạc nói riêng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn cao, nghiên cứu này nhằm khảo

sát khả năng khử trùng mẫu cấy của nano bạc.

Kết quả cho thấy chỉ 3 ngày sau nuôi cấy, tất cả mẫu cấy ở nghiệm thức khử

trùng bằng nano bạc ở nồng độ 0,025% trong thời gi n 5 phút đã xuất hiện nấm và

vi khuẩn. Trong khi đó, các mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc ở nồng độ 0,1% trên

5 phút hóa nâu. Đến ngày thứ 7, mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng nano bạc, AgNO3 và

HgCl2 đã bắt đầu cảm ứng với môi trƣờng trong khi đó mẫu cấy khử trùng bằng

Ca(ClO)2 sau 15 ngày mới có dấu hiệu cảm ứng. Sau 15 ngày theo dõi, kết quả ghi

nhận đƣợc cho thấy khả năng khử trùng mẫu cấy của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2,

AgNO3 là khác nhau thể hiện qua tỷ lệ khử trùng thành công (bảng 4.1a, bảng 4.1b),

tỷ lệ mẫu nhiễm (bảng 4.2a, bảng 4.2b), tỷ lệ mẫu chết (bảng 4.3a, bảng 4.3b) của

thí nghiệm.

Bảng 4.1a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Chất khử trùng thông dụng

Nano bạc

Thời

HgCl2

Ca(ClO)2

AgNO3

gian

0,05

0,1

0,3

0,5

8,5

9,5

10,5

0,3

0,5

0,7

1,5

0,01

0,015

0,025

0,05

0,1

(phút)

(%)

100a* 100a 100a 28,33i

100a 100a 100a 100a 86,67c 100a

100a

100a 100a 100a 100a 100a 100a

100a 8,33op 6,67pq

100a 100a 100a 100a

100a

100a 100a 100a 100a 100a 100a

100a

100a 100a 100a 16,67l

100a

100a 100a 100a 100a 31,33h 6,67pq

15 53,33f

100a 100a 20,00k

100a

100a 13,33m 8,33op 100a 100a 100a 8,33op

20 36,67g

100a 100a 23,33j

100a

100a 63,33e 11,67mn 5,00q 100a 100a 53,33f 1,67r

- 33,33g

81,67d 10,00no

88,33b

thông qua tỷ lệ mẫu nhiễm

Ghi chú: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử DMRT. Ký hiệu – thể hiện những nghiệm thức không có mẫu nhiễm

Bảng 4.1b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Chất khử trùng thông dụng

Nano bạc

Thời

HgCl2

Ca(ClO)2

AgNO3

gian

(phút)

0,05

0,1

0,3

0,5

8,5

9,5

10,5

0,3

0,5

0,7

1,5

0,01

0,015

0,025

0,05

0,1

(%)

100a*

100a 100a 10,00ij

100 a 100 a 100 a 100 a 53,33d 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a 100 a

100a 8,33jk

100a 100a 100a 100a

100a 100a 100a 100a 100a 100a 100a 100a 100a 100a

100a

3,33l

100a 100a 100a 11,67hi

100a 100a 100a 100a 100a 100a 100a 100a 13,33h

21,67f

100a 100a 3,33l

100a 100a 100a 13,33h 10,00ij 100a 100a 100a 3,33l

11,67hi

100a 100a 3,33l

100a 100a 16,67g 6,67k 6.67k 100a 100a 33,33e

13,33h

71,67c 6,67k

78,33b

cấy thông qua tỷ lệ mẫu nhiễm

Ghi chú: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử DMRT.

Ký hiệu – thể hiện những nghiệm thức không có mẫu nhiễm

Bảng 4.2a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Chất khử trùng thông dụng

Nano bạc

Thời

HgCl2

Ca(ClO)2

AgNO3

gian

(phút)

0,05

0,1

0,3

0,5

8,5

9,5

10,5

0,3

0,5

0,7

1,5

0,01

0,015

0,025

0,05

0,1

(%)

100a

13,33p

100a 71,67e 100a

38,33k 80,00c 100a 100a

100a

11,67p 68,33f

76,67d 100a

100a 100a

23,33m 100a

35,00l 43,33j

20,00no 100a

15 46,67i* 100a

100a

100a 100a

46.67i 76,67d 100a

36,67kl 36,67kl 50,00h

20 63,33g 100a

100a

100a 100a

- 51,67h 100a

100a

- 21,67mn 23,33m 100a

100a

100a 100a 66,67f 100a 100a

100a

100a 18,33o 90,00b 100a

100a

100a 11,67p 100a 100a

100a 100a

thông qua tỷ lệ mẫu cấy chết

Ghi chú: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử DMRT.

Ký hiệu – thể hiện những nghiệm thức không có mẫu chết

Bảng 4.2b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Chất khử trùng thông dụng

Nano bạc

Thời

HgCl2

Ca(ClO)2

AgNO3

gian

(phút)

0,05

0,1

0,3

0,5

8,5

9,5

10,5

0,3

0,5

0,7

1,5

0,01

0,015

0,025

0,05

0,1

(%)

90,00c 100a

46,67j

43,33k 75,00g 100a 100a

100a

78,33f 100a 100a 100a

38,33mn 100a

25,00r 81,67e

33,33p 100a

15 78,33f* 100a 100a 100a 100a

- 65,00h 83,33e 100a

35,00op 40,00lm

20 88,33cd 100a 100a 100a 100a

- 73,33g 100a

100a

83,33e 36,67no 41,67kl

- 43,33k 53,33i 100a

100a

100a 100a 100a 100a 86,67d 100a 100a

100a

100a 28,33q 93,33b 100a

100a

100a 21,67s 100a 100a

100a

thông qua tỷ lệ mẫu cấy chết

Ghi chú: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử DMRT.

Ký hiệu – thể hiện những nghiệm thức không có mẫu chết

Nhìn chung, ở cùng một chất khử trùng, cùng nồng độ và thời gian khử trùng,

mẫu cấy lá nhiễm nhiều hơn mẫu cấy cuống lá. Xét ở thông số khử trùng tốt nhất

của các nghiệm thức, có thể thấy khử trùng mẫu cấy bằng nano bạc có số mẫu

nhiễm thấp nhất (8,33% ở lá và 3,33% ở cuống lá) so với HgCl2 (8,33% ở cả lá và

cuống lá), Ca(ClO)2 (16,67% ở lá và 11,67% ở cuống lá), AgNO3 (11,67% ở lá và

6,67% ở cuống lá) Đặc biệt, tỷ lệ mẫu nhiễm khi khử trùng bằng AgNO3 c o hơn rất

nhiều với các nghiệm thức còn lại.

Trong khi đó, khi theo dõi số liệu thể hiện số mẫu cấy chết khi khử trùng bằng

nano bạc và các chất khử trùng ở bảng 4.2a và bảng 4.2b, nhận thấy, số mẫu cấy

cuống lá chết sau khử trùng lại tập trung chủ yếu trên mẫu cấy cuống lá.

Khử trùng mẫu cấy là gi i đoạn quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ

quy trình nhân giống in vitro. Đối với mỗi loại cây, mỗi loại mô khác nhau phải

xác định phƣơng thức khử trùng khác nhau cho thích hợp. Mặt khác, đị điểm thu

nhận và độ sạch của mẫu c ng có ảnh hƣởng đến tỷ lệ thành công ở gi i đoạn này

(Minh, 2004).

Bảng 4.3a. So sánh khả năng khử trùng mẫu lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi cấy

Tỷ lệ mẫu thành công (%)

Chất khử trùng thông dụng

Nano bạc

Thời

HgCl2

Ca(ClO)2

AgNO3

gian

(phút)

0,05

0,1

0,3

0,5

8,5

9,5

10,5

0,3

0,5

0,7

1,5

0,01

0,015

0,025

0,05

0,1

(%)

53,33d* 13,33h

23,33g

60,00b

56,67c 25,00g

33,33f 23,33g

53,33d 46,67e

71,67a

- 25,00g

51,67d 45,00e

- 25,00g 75,00a

thông qua tỷ lệ mẫu cấy thành công

Ghi chú: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử DMRT. Ký hiệu – thể hiện những nghiệm thức không có mẫu thành công

Bảng 4.3b. So sánh khả năng khử trùng mẫu cuống lá african violet của nano bạc và HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 15 ngày nuôi

Tỷ lệ mẫu thành công (%)

Chất khử trùng thông dụng

Nano bạc

Thời

HgCl2

Ca(ClO)2

AgNO3

gian

(phút)

0,05

0,1

0,3

0,5

8,5

9,5

10,5

0,3

0,5

0,7

1,5

0,01

0,015

0,025

0,05

0,1

(%)

48,33f* 25,00h

18,33i

50,00de

61,67a 18,33i

- 31,67g 16,67i

- 51,67cd 28,33c

63,33a

- 23,33h

56,67b 51,67cd

- 23,33h 46,67f

cấy thông qua tỷ lệ mẫu cấy thành công

Ghi chú: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một bảng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử DMRT Ký hiệu – thể hiện những nghiệm thức không có mẫu thành công

Bảng 4.3a và bảng 4.3b thể hiện tỷ lệ mẫu cấy thành công khi khử trùng bằng

nano bạc và các chất khử trùng khác. Có thể nhận thấy, thông số khử trùng của chất

khử trùng hoàn toàn không giống nhau. Cụ thể, HgCl2 sẽ khử trùng đạt kết quả tốt

nhất ở nồng độ 0,1% trong thời gian 5 phút. Trong khi thông số khử trùng tốt nhất

của Ca(ClO)2 là 10% trong 10 phút, của AgNO3 là 1% trong 20 phút và nano bạc là

0,05% trong 15 phút.

Khi khử trùng bằng nano bạc ở nồng độ 0,05% trong thời gian 15 phút cho kết

quả khử trùng tốt nhất ở cả mẫu lá (71,67%) và cuống lá (63,33%). Tỷ lệ này cao

hơn khi so sánh với kết quả ở thông số tốt nhất của HgCl2 là nồng độ 0,1% trong 5

phút trên mẫu lá (53,33%) và cuống lá (48,33%) african violet. Tƣơng tự, kết quả

trên c ng có sự khác biệt rõ rệt khi sử dụng chất khử trùng mẫu lá (60,00%) và

cuống lá (50,00%) african violet bằng Ca(ClO)2 ở nồng độ 10% trong 10 phút. Với

chất khử trùng AgNO3, thông số khử trùng tốt nhất là 1% trong 20 phút. Khi so với

kết quả khử trùng bằng HgCl2, Ca(ClO)2, nano bạc thì kết quả khử trùng bằng

AgNO3 trên cả mẫu lá (51,67%) và cuống lá (56,67%) không có nhiều sự khác biệt.

Nhƣ vậy, các cơ qu n trƣớc khi đƣ vào nuôi cấy có thời gian khử trùng càng dài thì

tỷ lệ mẫu nhiễm giảm nhƣng tỷ lệ mẫu chết lại tăng, do chất khử trùng ngoài tác

dụng diệt các vi sinh vật, thì nó c ng gây độc cho mô nuôi cấy. Các chất khử trùng

khác nhau có thông số khử trùng, và yếu tố quyết định sự thành công trong thông số

khử trùng khác nhau.

0 2

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

0.05 (%) 0,1 (%) 0.3 (%) 0.5 (%) 1 (%)

Thành công Chết Nhiễm

Biểu đồ 4.1a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng

mẫu lá cây african violet của HgCl2

0 3

5 1

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

0.05 (%) 0,1 (%) 0.3 (%) 0.5 (%) 1 (%)

Thành công Chết Nhiễm

Biểu đồ 4.1b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng

mẫu cuống lá cây african violet của HgCl2

Cụ thể với HgCl2, khi tăng nồng độ lên 0,3% và giữ nguyên thời gian khử

trùng trong 5 phút, tỷ lệ thành công sẽ giảm (13,33% ở lá, 25% ở cuống lá) chỉ còn

⁄ so với tỷ lệ mẫu cấy thành công ở nghiệm thức tốt nhất (53,33% ở lá, 48,33% ở cuống lá). Mặt khác, khi giữ nguyên nồng độ các chất khử trùng, chỉ tăng

bằng

thời gian khử trùng lên 10 phút, tỷ lệ mẫu cấy thành công lại tiếp tục giảm mạnh

(22,33% ở lá, 18,33% ở cuống lá), các mẫu cấy đ số bị hóa nâu và chết.

Có thể kết luận, ở chất khử trùng HgCl2, cả hai yếu tố ảnh thời gian và nồng

độ đều có ảnh hƣởng trực tiếp đến sự thành công của quá trình khử trùng.

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

8.5 (%) 9 (%) 9.5 (%) 10 (%) 10.5 (%)

Thành công Chết Nhiễm

Biểu đồ 4.2a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng

mẫu lá cây african violet của Ca(ClO)2

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

8.5 (%) 9 (%) 10 (%) 10.5 (%) 9.5 (%)

Thành công Chết Nhiễm

Biểu đồ 4.2b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng

mẫu cuống lá cây african violet của Ca(ClO)2

Tƣơng tự HgCl2, khi khử trùng mẫu cấy bằng Ca(ClO)2, nếu giữ nguyên nồng

độ 10% và tăng thời gian khử trùng lên 15 phút, tỷ lệ thành công giảm đáng kể

(22,33% ở lá, 16,67% ở cuống lá) so với tỷ lệ thành công ở nghiệm thức tốt nhất

(60% ở lá, 50% ở cuống lá). Mặc khác, khi khử trùng mẫu cấy ở nồng độ thấp hơn

9,5% trong cùng khoảng thời gian 10 phút thì không thành công, các mẫu cấy đ

phần sẽ bị nhiễm khuẩn nấm và chết. Tuy nhiên, với cùng khoảng nồng độ 9,5%

nhƣng tăng thời gian khử trùng lên 15 phút, thì kết quả thu nhận lại hoàn toàn khác

biệt. Tỷ lệ thành công đạt 33,33% ở mẫu lá và 31,67% ở mẫu cuống lá. Từ đó, có

thể kết luận, với chất khử trùng Ca(ClO)2, thì cả hai yếu tố nồng độ, thời gi n đều

ảnh hƣởng đến tỷ lệ thành công trong khử trùng mẫu cấy.

0 2

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 3

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

0.3 (%) 0.5 (%) 0.7 (%) 1 (%) 1.5 (%)

Thành công Chết Nhiễm

Biểu đồ 4.3a. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng

mẫu lá cây african violet của AgNO3

5 1

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

0.3 (%) 0.5 (%) 0.7 (%) 1 (%) 1.5 (%)

Thành công Chết Nhiễm

Biểu đồ 4.3b. Biểu đồ thể hiện khả năng khử trùng

mẫu cuống lá cây african violet của AgNO3

Nghiệm thức AgNO3 khác với HgCl2 và Ca(ClO)2, tỷ lệ thành công khi khử

trùng bằng AgNO3 chủ yếu chịu ảnh hƣởng bởi yếu tố nồng độ trong khử trùng,

điều này thể hiện qua tỷ lệ thành công của cùng một nồng độ khi tăng hoặc giảm

thời gian khử trùng không có sự khác biệt thống kê. Ở các nghiệm thức sử dụng

AgNO3, nhận thấy khi khử trùng ở nồng độ 1% trong 15 phút (53,33% ở lá, 51,67%

ở cuống lá) và 20 phút (51,67% ở lá, 56,67% ở cuống lá) không có nhiều sự

khác biệt, tuy nhiên kết quả khử trùng với khoảng thời gian 20 phút sẽ cho kết quả

tốt hơn.

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

0.01 (%) 0.015 (%) 0.025 (%) 0.05 (%) 0.1 (%)

Thành công Chết Nhiễm

Biểu đồ 4.4a. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu lá african violet thành công

khi khử trùng bằng nano bạc

5 1

0 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

0 1

5 1

0 2

0 3

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

0.01 (%) 0.015 (%) 0.05 (%) 0.1 (%) Thành công 0.025 (%) Chết Nhiễm

Biểu đồ 4.4b. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu cuống lá african violet thành công

khi khử trùng bằng nano bạc

Riêng với nano bạc, có thể thấy nồng độ và thời gian là hai yếu tố quan trọng,

tỷ lệ nghịch và bổ trợ cho nhau, ảnh hƣởng đến tỷ lệ thành công củ gi i đoạn khử

trùng. Nồng độ càng cao, thời gian khử trùng càng thấp và ngƣợc lại. Tuy nhiên,

nếu nồng độ thấp hơn 0,025%, h y thời gian khử trùng c o hơn 20 phút thì khử

trùng sẽ không thành công.

African violet thuộc loại thân thảo, sát mặt đất, toàn thân lại phủ đầy lông mịn,

nên cây bám rất nhiều đất cát và các vi sinh vật gây bệnh. Việc khử trùng tạo mẫu

cấy sạch để có nguồn vật liệu nuôi cấy cho đối tƣợng này là hết sức khó khăn nên

đây đƣợc chọn là một loại cây thí điểm để thử nghiệm về khả năng khử trùng. Toàn

bộ quá trình nuôi cấy in vitro luôn luôn đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng. Vì

vậy, điều kiện vô trùng là một trong những yếu tố quan trọng nhất, quyết định sự

thành bại của nuôi cấy in vitro.

Trong khi đó, môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật có chứ đƣờng, muối khoáng

và vitamin thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân chia tế

bào của nấm và vi khuẩn nhanh hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. Nếu môi

trƣờng nuôi cấy bị nhiễm vài bào tử nấm mốc hoặc vi khuẩn thì s u vài ngày đến

một tuần toàn bộ bề mặt môi trƣờng và mẫu cấy sẽ phủ đầy nấm, khuẩn. Cần loại bỏ

khuẩn và nấm, vì trong điều kiện này mô cấy không thể phát triển và chết dần. Khác

với nuôi cấy vi sinh, có thể kết thúc trong vài ngày, và nuôi cấy trên môi trƣờng

phân lập chuyên biệt, mức độ vô trùng trong nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi sự vô

trùng rất cao. Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro đƣợc lựa chọn từ những cá thể ƣu tú

của loài, khỏe mạnh và sạch bệnh, nhƣng ít nhiều có nhiễm vi sinh vật và nấm tùy

thuộc và sự tiếp xúc của chúng với môi trƣờng xung quanh.

Việc khử trùng mẫu trƣớc khi đƣ vào nuôi cấy là rất cần thiết và quyết định

sự thành công của cả quá trình này. Nghiên cứu của Phạm Tấn Trƣờng và Võ Thị

Bạch M i (2008) đã chỉ ra rằng mẫu cấy african violet khi khử trùng bằng HgCl2

0,1% trong thời gian 5 phút và Ca(ClO)2 10% trong 10 phút sẽ đạt tỷ lệ sống sót

50%, kết quả này có sự tƣơng đồng với kết quả của nghiệm thức HgCl2 và Ca(ClO)2

trong nghiên cứu này, và có thể thấy tỷ lệ này thấp hơn rất nhiều khi so sánh với

nano bạc, nhƣng lại khá cao so với kết quả ở nghiệm thức sử dụng AgNO3. Ines và

đồng tác giả (2013) c ng đã khử trùng thành công mẫu cấy nh đào bằng AgNO3 ở

nồng độ 1% trong 20 phút nhƣng tỷ lệ thành công c o hơn rất nhiều (96,7%).

Nano bạc làm tăng cƣờng hoạt tính hóa học của bạc do cấu trúc đạt kích thƣớc

tới hạn, điều này sẽ cho phép một lƣợng lớn nguyên tử có thể tƣơng tác với mục

tiêu làm nâng cao hiệu quả tác động bề mặt. Mặc khác, do tác dụng theo nhiều cơ

chế khác nhau nên nano bạc có khả năng diệt khuẩn khá hiệu quả (Chaloupka et al.,

2010). Công dụng của nano bạc trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để ngăn chặn

nhiễm khuẩn đã đƣợc nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng khác nhau (Sondi, Salopek,

2004; Kim et al., 2007; Navarro et al., 2008). Tuy nhiên, nồng độ, thời gian và

phƣơng pháp xử lý nano bạc của mỗi loại cây trồng là khác nh u, điều này đã đƣợc

báo cáo qua nhiều công bố (Rostami, Shahsavar, 2009; Gharati et al., 2010;

Fakhrfeshani et al., 2012).

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nano bạc (kích thƣớc > 20 nm) trong

khử trùng bề mặt mẫu cấy african violet. Trƣớc đó, tác dụng khử trùng bề mặt mẫu

cấy của nano bạc đã đƣợc báo cáo đầu tiên bởi Abdi và đồng tác giả (2012) trong

khử trùng bề mặt mẫu cấy Valeriana officinali L. Theo đó, các tác giả đã kết luận sử

dụng nano bạc (kích thƣớc 35 nm) nồng độ 0,012% trong 180 phút sẽ cho kết quả

khử trùng tốt nhất. Kết quả này tƣơng đồng với kết quả của chúng tôi về khả năng

khử trùng của nano bạc, tuy có sự khác biệt về kích thƣớc hạt nano, nồng độ và thời

gian khử trùng. Gần đây, Dƣơng Tấn Nhựt và đồng tác giả (2017) đã bổ sung nano

bạc (kích thƣớc ≤ 20nm) vào môi trƣờng nuôi cấy ho cúc để thay thế gi i đoạn hấp

khử trùng mà không gây ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây; vì thế,

 So sánh vai trò của nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 trong giai đoạn khử

nano bạc đƣợc đánh giá là một chất khử trùng hiệu quả và an toàn với thực vật.

trùng lên sự cảm ứng của mẫu cấy

Sau 30 ngày nuôi cấy, kết quả cho thấy 100% các mẫu cấy sống sót từ gi i đoạn

khử trùng có sự cảm ứng rõ rệt với môi trƣờng nuôi cấy (hình 4.1 và bảng 4.4).

Bảng 4.4. Sự phát sinh hình thái khác nhau giữa nano bạc và chất khử trùng thông dụng sau 30 ngày nuôi cấy

HgCl2

Ca(ClO)2

AgNO3

Khối mô sẹo cứng xanh. Khối mô sẹo cứng vàng nâu. Mô sẹo xốp xanh, nhiều chồi nhỏ.

Cuống lá cắt ngang

Cuống lá cắt dọc

Sẹo xốp, cấu trúc rời rạc, có nhiều sơ khởi chồi và chồi qua mô sẹo. Xuất hiện rễ tơ.

Mẫu cấy xanh nhạt. Sẹo hình thành nhiều sơ khởi chồi, xuất hiện phôi hình cầu.

Mẫu cấy vàng nhạt. Ít sẹo, các sẹo hình thành sơ khởi chồi. Không quan sát thấy phôi.

Phiến lá

Mẫu cấy xanh, sẹo xốp có khả năng tạo phôi, ít sơ khởi chồi, không quan sát thấy phôi và chồi, mẫu cấy có rất nhiều rễ tơ.

Nano bạc Mô sẹo xốp trắng, cấu trúc rời rạc, xuất hiện một vài sơ khởi chồi, tử diệp lớn x nh đậm. Ít sẹo và chồi. Mô sẹo xốp xanh, cấu trúc rời rạc, hình thành nhiều sơ khởi chồi và chồi qua mô sẹo. Xuất hiện các phôi hình cầu, phôi hình thủy lôi, phôi 2 lá mầm. Mẫu cấy xanh. Sẹo xốp có khả năng tạo phôi, hình thành nhiều sơ khởi chồi và chồi qua mô sẹo, xuất hiện nhiều phôi hình cầu và thủy lôi, phôi soma phát sinh gián tiếp qua mô sẹo, nhiều chồi hình thành từ phôi, nhiều rễ tơ.

Lá chứa gân chính

Hình thành sẹo xốp có khả năng tạo phôi trên cả mô lá và gân lá, hình thành nhiều sơ khởi chồi và chồi qua mô sẹo ở mô lá, xuất hiện rất nhiều rễ tơ.

Hình thành sẹo xốp có khả năng tạo phôi trên cả mô lá và gân lá, hình thành nhiều sơ khởi chồi và chồi qua mô sẹo ở mô lá, xuất hiện rễ tơ.

Mẫu cấy xanh. Sẹo xốp có khả năng tạo phôi, hình thành nhiều sơ khởi chồi và chồi qua mô sẹo, xuất hiện ít phôi soma hình cầu phát sinh gián tiếp qua mô sẹo. Hình thành sẹo xốp có khả năng tạo phôi trên cả mô lá và gân lá, hình thành nhiều sơ khởi chồi và chồi qua mô sẹo ở mô lá.

Mẫu cấy vàng xám, có mô chết, sẹo xốp có khả năng tạo phôi, hình thành nhiều sơ khởi chồi qua mô sẹo, xuất hiện ít phôi soma hình cầu phát sinh gián tiếp qua mô sẹo. Hình thành sẹo xốp có khả năng tạo phôi trên mô lá, gân lá không phát sinh hình thái, hình thành nhiều sơ khởi chồi và chồi qua mô sẹo ở mô lá.

Hình 4.1. Sự cảm ứng giữa các mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc và HgCl2,

Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy

Ghi chú: (a1, a2, a3, a4) Mẫu cuống lá cắt ngang [lần lượt khử trùng bằng: HgCl2,

Ca(ClO)2, AgNO3, nano bạc], (b1, b2, b3, b4) Mẫu cuống lá cắt dọc [lần lượt khử

trùng bằng: HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3, nano bạc], (c1, c2, c3, c4) Mẫu phiến lá [lần

lượt khử trùng bằng: HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3, nano bạc], (d1, d2, d3, d4) Mẫu lá

chứa gân chính [lần lượt khử trùng bằng: HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3, nano bạc].

Hình 4.2. Giải phẫu hình thái và quan sát mô học của các mẫu cấy khử trùng

bằng nano bạc và các chất khử trùng thông dụng sau 30 ngày nuôi cấy

Ghi chú: (a) Khối mô sẹo có sự hình thành sơ khởi chồi quan sát dưới vật kính x40,

(b) Sơ khởi chồi phát triển thành cấu trúc chồi quan sát dưới vật kính x40, (c) Chồi

chưa phân biệt rõ mô phân sinh đỉnh quan sát dưới vật kính x40, (d) Chồi có cấu

trúc hoàn chỉnh với mô phân sinh đỉnh chồi và hai lá mầm quan sát dưới vật kính

x10, (e) Khối sẹo xốp có khả năng hình thành phôi quan sát dưới vật kính x10, (f)

Phôi soma hình cầu phát sinh thông qua mô sẹo quan sát dưới vật kính x40, (g)

Phôi hình thủy lôi phát sinh thông qua mô sẹo quan sát dưới vật kính x40, (h) Phôi

hai lá phát sinh thông qua mô sẹo quan sát dưới vật kính x40.

Trong thí nghiệm này, nhận thấy sự xuất hiện của phôi soma ở các dạng

(hình 4.2f, g, h) là hoàn toàn ngẫu nhiên. Nhận thấy đ phần cơ qu n phát sinh gián

tiếp thông qua mô sẹo . Quan sát hình thái mẫu cấy cảm ứng tạo thành (hình 4.1 và

bảng 4.3), nhận thấy hầu hết các mẫu cấy lá và mẫu cuống lá cắt dọc có xu hƣớng

tạo sẹo xốp có khả năng tạo phôi (hình 4.2e), nhiều sơ khởi chồi (hình 4.2a). Trong

khi, các mẫu cấy cuống lá cắt ngang lại có sự khác biệt rõ ràng về hình thái cảm ứng

giữa các nghiệm thức. Cụ thể, mẫu cấy cuống lá cắt ngang khử trùng bằng các chất

khử trùng thông dụng hình thành khối mô sẹo cứng màu xanh nhạt (HgCl2) (hình

4.1a1) hoặc vàng nâu [Ca(ClO)2] (hình 4.1a2), khác biệt với mô sẹo xốp có sơ khởi

chồi, chồi hình thành sớm (hình 4.2b, c, d), phát triển nh nh vƣợt trội của mẫu cấy

khử trùng bằng AgNO3 (hình 4.1a3) hay nano bạc (hình 4.1a4).

Ngoài ra, có thể quan sát thấy các mẫu cấy ở nghiệm thức sử dụng Ca(ClO)2

(hình 4.1a2, b2, c2, d2) có sự ức chế so với mẫu cấy khử trùng bằng HgCl2 (hình

4.2a1, b1, c1, d1), AgNO3 (hình 4.2a3, c3, b3, d3) hoặc khử trùng bằng nano bạc

(hình 4.2a4, b4, c4, d4). Các mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng HgCl2 phát sinh hình

thái tƣơng tự nhƣng có phần phát triển chậm hơn các mẫu cấy khử trùng bằng nano

bạc. Đặc biệt, mẫu phiến lá và lá chứa gân chính khử trùng bằng AgNO3 (hình

4.1c3, d3) và nano bạc (hình 4.1c4, d4) xuất hiện rễ tơ. Riêng với nghiệm thức khử

trùng bằng nano bạc, các chồi c o vƣợt trội.

Trong khi chất điều hò sinh trƣởng liên quan trực tiếp đến gi i đoạn đầu của

quá trình tái sinh, thì yếu tố mẫu cấy và tác động ức chế/ kích thích của các chất khử

trùng lên mẫu cấy lại có v i trò nhƣ chiếc chì khó điều khiển tốc độ cảm ứng và

khả năng phát triển của mẫu cấy. Nghiên cứu này đã làm rõ v i trò của chất khử

trùng đến hình thái cảm ứng của mẫu cấy. Kích thƣớc nhỏ của các hạt nano giúp

chúng tăng hiệu quả tƣơng tác tiếp xúc bề mặt, dễ dàng xâm nhập, tác động tận sâu

bên trong tế bào (Sondi, Salopek, 2004; Kim et al., 2007; Navarro et al., 2008;

Nasser et al., 2013) tăng hiệu quả khử trùng, tạo ra sự khác biệt trong cảm ứng và

phát triển mẫu cấy.

Nano kim loại có thể đƣợc hấp thu qu lá, các n no đi vào khí khổng trên lá,

từ đó di chuyển vào hệ thống mạch của lá và vận chuyển đến các cơ qu n khác qu

phloem. Khác với tế bào động vật, tế bào thực vật có vách tế bào, và gần nhƣ không

có sự thực bào. Trƣớc khi đi vào tế bào thực vật, các hạt nano kim loại phải xuyên

qu đƣợc thành tế bào và màng nguyên sinh chất. Kích thƣớc lỗ trên vách tế bào

thực vật khoảng 5 – 20nm (Carpita, Gibeaut, 1993). Các hạt n no có kích thƣớc nhỏ

hơn các lỗ trên vách tế bào mới có thể xâm nhập vào bên trong để tiến đến màng

sinh chất, trong khi các hạt n no có kích thƣớc lớn sẽ không thể vào đƣợc. Tuy vẫn

còn nhiều tranh luận xung qu nh cơ chế hấp thu, vận chuyển hay chuyển hóa nano

trong thực vật, nhƣng khả năng xâm nhập nội bào củ n no đƣợc chấp nhận rộng

rãi, mặc dù cơ chế cụ thể của việc hấp thu nano vẫn chƣ đƣợc xác định rõ ràng.

Bằng hệ thống kính hiển vi điện tử truyền suốt, sự hấp thu nano kim loại đƣợc

mô tả trong những nghiên cứu gần đây (Du et al., 2011; Speranza et al., 2010).

Ngoài r , đã có các báo cáo cho rằng hạt nano có thể cảm ứng hình thành các lỗ mới

với kích thƣớc lớn trên vách tế bào thực vật, bằng cách đó các hạt nano có kích

thƣớc lớn mới có thể xâm nhập đƣợc vào trong. Bên cạnh đó, các nhà kho học

c ng sử dụng những hệ thống kính hiển vi huỳnh quang hay quang học để quan trắc

sự xâm nhập của các nano kim loại (Liu et al., 2010; Wang et al., 2011; Wild,

Jones, 2009). Khi Wild và Jones (2009) sử dụng kính hiển vi kích thích hai photon

để quan sát sự di chuyển của các nano kim loại trong rễ cây lúa mì, các tác giả nhận

thấy các nano kim loại xâm nhập qua vách tế bào ở rễ phần lớn, và chỉ có một ít

đƣợc giữ lại ở bề mặt. Corredor và đồng tác giả (2009) c ng nhận thấy hạt nano có

khả năng xâm nhập vào bên trong mô ở nhiều vùng khác nhau trên cây bí ngô.

Mặt khác, tại các phòng thí nghiệm hiện nay chủ yếu sử dụng các loại natri

hypochlorite, c lcium hypochlorite, mercury chloride,… có tính tẩy rử và ăn mòn

cao nên có khả năng gây độc và ức chế mẫu cấy (Ines et al., 2013) đây là lý do

chính khiến các mẫu cấy khi sử dụng HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 cảm ứng chậm hơn

so với mẫu cấy ở nghiệm thức sử dụng nano bạc.

Ngoài ra, khi có sự tác động của nano bạc, gene mã hóa cho auxin trong tế bào

thực vật sẽ đƣợc kích thích (Syua et al., 2014) khiến lƣợng auxin nội sinh tăng lên,

do đó các mẫu cấy ở nghiệm thức sử dụng nano bạc xuất hiện rễ tơ, chồi cao và rõ

ràng hơn so với khối mô sẹo chứ sơ khởi chồi ở các nghiệm thức còn lại. Các muối - luôn đƣợc biết đến với khả năng kích thích sự tạo rễ, do đó, khoáng chứa gốc NO3

các mẫu cấy ở nghiệm thức sử dụng AgNO3 xuất hiện nhiều rễ hơn so với các mẫu

cấy còn lại.

Trong nghiên cứu này, khi so sánh hình thái phát sinh từ các loại mẫu cấy, có

thể nhận thấy mẫu cấy lá phát triển ổn định, khó bị ức chế hơn mẫu cấy cuống.

Quan sát giải phẫu mô học, nhận thấy các tế bào mô vách và bó mạch libe ở cuống

lá hay gân chính sẽ cho lƣợng sẹo xốp có hình thành sơ khởi chồi thấp so với tế bào

mô dậu ở lá, nên mẫu lá thích hợp sử dụng trong công tác nhân giống hơn.

Tóm lại, sử dụng nano bạc ở nồng độ 0,05% khử trùng mẫu lá trong 15 phút

cho hiệu quả khử trùng tối ƣu nhất, mẫu cấy cảm ứng nhanh và không có dấu hiệu

ức chế.

4.2. Nội dung 2: So sánh vai trò của nano bạc với các chất khử trùng thông

dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] trong phát sinh hình thái mẫu cấy in vitro

 So sánh vai trò của nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 giai đoạn khử

trùng lên hình thái chồi african violet in vitro

Sau 30 ngày nuôi cấy, nhìn chung, tổng số chồi tái sinh của hai nghiệm thức

sử dụng HgCl2 và Ca(ClO)2 không có khác biệt về mặt thống kê. Trong khi đó, các

cụm chồi tái sinh từ mẫu cấy african violet khử trùng bằng nano bạc lại có sự khác

biệt rõ rệt về hình thái và sự phát triển (bảng 4.5, hình 4.3 và hình 4.4).

Bảng 4.5. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển của cụm chồi tái sinh từ mẫu cấy

lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau

30 ngày nuôi cấy

Khối lƣợng Khối lƣợng Số chồi Số chồi Số chồi Tổng số Chất khử tƣơi khô cao cao cao chồi trùng (g) (g) < 0,5 cm 0,5 – 1 cm 1 – 1,5 cm (chồi/mẫu)

3,006b* 0,095d 6,00c 24,33d 7,33a 37,67c HgCl2

2,725d 0,103c 9,67c 28,33c 3,67b 41,67c Ca(ClO)2

2,406c 0,187b 32,33b 42,00a - 74,3b AgNO3

Nano bạc 4,117a 0,233a 52,00a 36,00b - 88,00a

Ghi chú: (*) Những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự

khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 trong phép thử LSD.

Cụm chồi tái sinh từ nghiệm thức sử dụng HgCl2 (hình 4.3a1) gồm các chồi

lớn (1 – 1,5 cm), rất ít chồi vừa (0,5 – 1 cm) và nhỏ (< 0,5 cm), chồi xanh, cụm chồi

phát triển với xu hƣớng tăng kích thƣớc các chồi b n đầu mà không tăng

số lƣợng chồi nhƣ ở nghiệm thức sử dụng AgNO3 (hình 4.3c1) hay nano bạc

(hình 4.4d1). Đối với cụm chồi tái sinh từ mẫu cấy khử trùng bằng Ca(ClO)2, các

chồi đơn chủ yếu có kích thƣớc từ 0,5 – 1 cm (hình 4.4b1). Đặc biệt có sự tƣơng

đồng nhất định về hình thái cụm chồi ở nghiệm thức sử dụng HgCl2 và Ca(ClO)2

(hình 4.3a2, b2). Ngoài ra, cụm chồi ở nghiệm thức khử trùng bằng AgNO3 và nano

bạc lại có xu hƣớng phát triển khá giống nhau (hình 4.3c2, d2). Tuy nhiên, các cụm

chồi trong nghiệm thức khử trùng bằng nano bạc (hình 4.3d2) vƣơn dài và dễ tách

chồi đơn hơn so với cụm chồi ở nghiệm thức khử trùng bằng AgNO3.

Hình 4.3. Mẫu lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc, HgCl2, Ca(ClO)2

và AgNO3 trong giai đoạn tái sinh chồi sau 30 ngày nuôi cấy

Ghi chú: (a1,a2) Hình thái cụm chồi african violet in vitro tái sinh từ mẫu lá khử

trùng bằng HgCl2, (b1,b2) Hình thái cụm chồi african violet in vitro tái sinh từ mẫu

lá khử trùng bằng Ca(ClO)2, (c1,c2) Hình thái cụm chồi african violet in vitro tái

sinh từ mẫu lá khử trùng bằng AgNO3, (d1,d2) Hình thái cụm chồi african violet in

vitro tái sinh từ mẫu lá khử trùng bằng nano bạc.

(Chồi)

100.00

90.00 0.00

70.00

80.00 0.00 36.00

60.00

42.00 50.00

3.67

40.00

7.33 30.00 52.00 28.33 20.00 24.33 32.33 10.00 9.67 6.00 0.00

Ca(ClO)2 AgNO3 N no bạc HgCl2 HgCl2 Ca(ClO)2 AgNO3 N no bạc

Số chồi c o < 0,5 cm Số chồi c o 0,5 – 1 cm Số chồi c o 1 – 1,5 cm

Biểu đồ 4.5. Biểu đồ thể hiện số chồi tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet

khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 sau 30 ngày nuôi cấy

Cụ thể hơn, theo dõi ở hình 4.4, nhận thấy tổng số chồi phát sinh từ mẫu cấy

khử trùng bằng nano bạc (88 chồi) và AgNO3 (74,3 chồi) khác biệt đáng kể so với

cụm chồi thu từ mẫu cấy khử trùng bằng HgCl2 (37,67 chồi), Ca(ClO)2 (41,67 chồi).

Tuy nhiên, số chồi kích thƣớc 1 – 1,5 cm ở nghiệm thức HgCl2 c o hơn (7,33 chồi)

trong khi ở nghiệm thức sử dụng sử dụng nano bạc hay AgNO3 lại không có chồi

đạt kích thƣớc này.

Sự phát sinh hình thái của mô tế bào thực vật chủ yếu đƣợc quy định bởi chuỗi

polyamines và các chất điều hò sinh trƣởng nội, ngoại sinh (Galston, 1983).

Polyamines là nhóm các chất hữu cơ có h i hoặc nhiều amino nguyên sinh có tiền

thân là SAM (Evans, Malmberg, 1989; Bais et al., 2000). Ion bạc ức chế sự tổng

hợp ethylene, giúp gi tăng lƣợng polyamines (Halevy, 1981). Các polyamines có

liên quan trực tiếp đến các quá trình: kích thích sự tái sinh ở thực vật, phân chia tế

bào, tổng hợp protein, sao chép DNA, phát sinh hình thái và phản ứng với stress

sinh học ở thực vật (Songstad et al., 1988, Chi et al., 1991; Tabor et al., 1984; Van

Den et al., 1994; Walden et al., 1997; Kumar, Rajam., 2004), từ đó ảnh hƣởng trực

tiếp đến sự hình thành và phát triển chồi của mẫu cấy. Sự ảnh hƣởng của ion bạc

trong nhân giống in vitro c ng đã đƣợc nghiên cứu bởi Sh rm và đồng tác giả

(2008) trên đối tƣợng Capsicum frutescens Mill, các mô phản ứng đồng thời làm

- – một gốc có khả năng

tăng số chồi tối đ khi có sự tác động của bạc.

Muối AgNO3 ngoài Ag+ còn chứa các gốc muối NO3

ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật, dẫn đến sự xuất hiện một

số khác biệt về hình thái của nghiệm thức sử dụng AgNO3 so với nghiệm thức sử

dụng nano bạc.

Tác động của nano bạc lên sự phát triển của mẫu cấy c ng đã đƣợc Saber và

đồng tác giả (2014) báo cáo, các tác giả nhận thấy hàm lƣợng phenol tiết ra trong

nuôi cấy hoa hồng giảm khi sử dụng nano bạc sau khử trùng bề mặt mẫu cấy và

giúp mẫu cấy phát triển ổn định. Seif và đồng tác giả (2011) c ng đƣ r báo cáo về

sự ảnh hƣởng của nano bạc trong nhân giống cây lƣu ly. Theo đó, số chồi, số lƣợng

lá, chiều cao cây, khối lƣợng khô, năng suất hạt c ng nhƣ hàm lƣợng polyphenol và

tannin trong chồi củ cây lƣu ly tăng một cách đáng kể. Nghiên cứu củ Dƣơng Tấn

Nhựt và đồng tác giả (2014) đã cho thấy nano bạc có kích thích sự sinh trƣởng và

phát triển củ cây cúc, dâu tây, đồng tiền nuôi cấy in vitro. Có rất nhiều báo cáo về

ảnh hƣởng tích cực và tiêu cực của nano bạc đến sự tăng trƣởng – phát triển của

thực vật (Syua et al., 2014). Tuy nhiên, ở nghiên cứu này, nano bạc có tác động tích

cực đến sự phát sinh hình thái tạo chồi.

Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu về hấp thụ, vận chuyển và tích l y các loại

nano kim loại trong hệ thống cây trồng. Các nano kim loại có thể dễ dàng thâm

nhập vào lớp biểu bì gốc, khí khổng hoặc nội mạc tế bào. Cuối cùng, chúng di

chuyển vào mạch xylem theo phloem đến và tích l y tại các bộ phận của cây

(Sondi, Salopek, 2004; Kim et al., 2007; Navarro et al., 2008). Kurep và đồng tác

giả (2010) đã nhận thấy sự tích l y của nano trong các tế bào của rễ và lá cây

Arabidopsis khi nghiên cứu với nano TiO2. Trong một nghiên cứu khác về sự hấp

thụ củ n no, Coredor và đồng tác giả (2009) c ng cho kết quả tƣơng tự với đối

tƣợng nano Fe3O4 ở cây bí đỏ. Các ion kim loại củ đóng v i trò cơ bản trong các

quá trình sinh học nhƣ hô hấp, tăng trƣởng, s o chép gene,… Tất cả sự th y đổi về

nồng độ ion kim loại trong tế bào đều có thể dẫn đến sự hình thành các tín hiệu ion

kim loại tƣợng trƣng mới, ảnh hƣởng đến chức năng của tế bào (Dean et al., 2012).

Đây có thể chính là nguyên nhân khiến cụm chồi thu đƣợc từ mẫu lá khử trùng bằng

nano bạc phát triển khác biệt hoàn toàn với nghiệm thức của các chất khử trùng

truyền thống, do hàm lƣợng ion bạc trong quá trình khử trùng bằng nano bạc đã

thẩm thấu sâu và tích trữ ở nội bào mẫu cấy.

Bƣớc vào gi i đoạn tái sinh chồi, yếu tố quan trọng nhất là hệ số nhân chồi; vì

vậy, có thể kết luận rằng cụm chồi tái sinh từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc sinh

trƣởng và phát triển tốt nhất ở gi i đoạn này.

 So sánh vai trò của nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3 trong giai đoạn

khử trùng lên hình thái cây con african violet in vitro

S u gi i đoạn nhân nh nh là gi i đoạn tạo rễ cho chồi in vitro tức là tái tạo cây

hoàn chỉnh. Đây là khâu cuối cùng của quá trình nuôi cấy in vitro, nó ảnh hƣởng rất

lớn đến quá trình đƣ cây r môi trƣờng tự nhiên sau này.

Bảng 4.6. So sánh sự sinh trƣởng, phát triển và tạo cây hoàn chỉnh của chồi tái

sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng nano bạc với HgCl2,

Ca(ClO)2, AgNO3

Khối Khối lƣợng Chiều Đƣờng Chiều Chất khử lƣợng tƣơi khô cao Số lá/cây kính lá Số rễ dài rễ trùng (g) (g) (cm) (cm) (cm)

1,149ns* 0,052ns 3,43ns 10ns 1,03ns 23,67ns 1,40ns HgCl2

1,137ns 0,055ns 3,46ns 10ns 0,97ns 23,67 ns 1,50ns Ca(ClO)2

1,122ns 0,053ns 3,53ns 9,67ns 1,03ns 25,00ns 1,47ns AgNO3

Nano bạc 1,121 ns 0,054ns 3,43ns 10ns 0,97ns 22,33ns 1,47ns

Ghi chú: (*) Ký hiệu (NS) trong cùng một cột thể hiện sự không khác biệt do

p>0,05 trong phép thử LSD.

Khác với gi i đoạn tái sinh chồi, hình thái cây ở các nghiệm thức trong giai

đoạn tạo cây hoàn chỉnh phát triển tƣơng đối đồng đều (bảng 4.6 và hình 4.5).

Sau 30 ngày nuôi cấy ở gi i đoạn này, qu n sát thông thƣờng không thấy có

điểm khác biệt (hình 4.5a, b, c, d). Bên cạnh đó, số liệu thu đƣợc ở các chỉ tiêu về

số lá, chiều cao cây, số rễ, chiều dài rễ giữa các nghiệm thức c ng cho thấy không

có sự khác biệt theo ý nghĩ thống kê.

Hình 4.4. Mẫu cấy african violet khử trùng bằng nano bạc, HgCl2, Ca(ClO)2 và

AgNO3 trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh sau 30 ngày nuôi cấy

(a) Cây african violet in vitro tái sinh từ mẫu lá khử trùng bằng HgCl2, (b) Cây

african violet in vitro tái sinh từ mẫu lá khử trùng bằng Ca(ClO)2, (c) Cây african

violet in vitro tái sinh từ mẫu lá khử trùng bằng AgNO3, (d) Cây african violet in

vitro tái sinh từ mẫu lá khử trùng bằng nano bạc.

Trong quá trình sinh trƣởng, nano kim loại đã đƣợc chuyển hóa và sử dụng để

hỗ trợ cho các quá trình tr o đổi chất (Larue et al., 2014). Các hạt nano có hiệu quả

cao về động lực và tƣơng tác rất cao so với các dạng kim loại khác bởi vì tính chất

lý hó đặc thù. Trong hệ thống sinh học và trong môi trƣờng tự nhiên, các hạt nano

sẽ tƣơng tác với các thành phần khác và bị th y đổi về mặt lý hóa, nhƣ bị bao bọc

bởi các tác nhân hữu cơ tự nhiên hoặc các phân tử sinh học, bị phân rã, hoặc bị oxi

hóa khử (Lowry et al., 2012). Đặc biệt, các hạt nano kim loại nhƣ bạc, đồng,

kẽm,… có thể bị phân rã, giải phóng ion kim loại và các dạng dẫn xuất hóa học

khác khi phản ứng với các tác nhân vô cơ (nhƣ lƣu huỳnh và phốt pho) hay hữu cơ

trong môi trƣờng và cơ thể sống (Dimkpa et al., 2012; Levard et al., 2012).

Hạt nano còn có thể chịu những tƣơng tác vật lý với các dạng ion vô cơ, phân

tử sinh học và vật liệu hữu cơ, kết quả là th y đổi trạng thái hóa học bề mặt (Nel et

al., 2009; Zhang et al., 2009). Do đó, tính chất và hiệu quả của các hạt nano không

những phụ thuộc nhiều vào sự chuyển hóa củ chúng trong môi trƣờng bảo quản, sử

dụng. Đã có những nghiên cứu sơ khởi về sinh chuyển hóa của hạt nano trong thực

vật nhƣ báo cáo của Lopez-Moreno và đồng tác giả (2010) cho thấy n no ZnO đã chuyển hóa thành Zn2+ và ZnNO3 trong rễ cây đậu tƣơng ở gi i đoạn nảy mầm

(Lopez-Moreno et al., 2010). Trong thực vật, hạt nano có thể chịu tác động của

nhiều dạng chuyển hóa bởi những hợp chất từ thực vật (Bais et al., 2006).

Với kết quả thu đƣợc trong gi i đoạn tạo cây hoàn chỉnh, có thể đặt giả thiết:

Sau một khoảng thời gian nhất định, các nano bạc đã đƣợc tích trữ sẽ dần đƣợc sử

dụng hết, vì thế hình thái cây con tạo thành của các nghiệm thức ở gi i đoạn tiếp

theo không có xuất hiện sự khác biệt.

4.3. Nội dung 3: So sánh sự sinh trƣởng và phát triển của cây african violet in

vitro có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với các chất khử trùng

thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3] ở giai đoạn vƣờn ƣơm

Hiệu quả khử trùng và kích thích mẫu cấy trong gi i đoạn vào mẫu b n đầu

của nano bạc so với các chất khử trùng thông dụng đã đƣợc chứng minh; tuy nhiên,

để củng cố thêm khả năng th y thế của nano bạc so với các chất khử trùng thông

dụng, các cây african violet đƣợc trồng thử nghiệm ở gi i đoạn ex vitro.

Kết quả ghi nhận đƣợc cho thấy, sau 4 tuần ở gi i đoạn vƣờn ƣơm, các chỉ tiêu

theo dõi của nghiệm thức nano bạc nhƣ số lá (10 lá), số rễ (23,67 rễ), chiều dài rễ

(1,5 cm), chiều cao cây (3,46 cm) hoàn toàn không có sự khác biệt giữa các cây của

các nghiệm thức khác (bảng 4.7). Kết quả này tƣơng tự nhƣ ở gi i đoạn tạo cây

hoàn chỉnh của thí nghiệm trƣớc đó.

Bảng 4.7. So sánh sự thích nghi, sinh trƣởng của cây african violet in vitro có

nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3

sau 4 tuần ở điều kiện ex vitro

Chất khử Tỷ lệ sống sót Chiều cao Đƣờng kính lá Chiều dài rễ Số lá/cây Số rễ/cây trùng (%) (cm) (cm) (cm)

100ns 5,40ns 10,00ns 1,03ns 1,97ns 24,00ns HgCl2

100ns 5,40ns 10,00ns 0,97ns 1,97ns 23,00ns Ca(ClO)2

100ns 5,43ns 10,33ns 0,90ns 1,97ns 24,00ns AgNO3

Nano bạc 100ns 5,47ns 10,00ns 0,97ns 1,97ns 22,00ns

Ghi chú: (*) Ký hiệu (NS) trong cùng một cột thể hiện sự không khác biệt do

p>0,05 trong phép thử LSD.

Hình 4.5. Cây con tái sinh từ mẫu cấy lá cây african violet khử trùng bằng

nano bạc với HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3

Ghi chú: [từ trái qua phải, HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3, nano bạc] (a1) Cây african

violet trồng ở điều kiện vườn ươm, (a2) Cây african violet sau 30 ngày trồng tại

vươn ươm ở các nghiệm thức chất khử trùng khác nhau,

[từ trái qua phải, cuống lá, mặt dưới lá, mặt trên lá] (b1) Hình thái các cơ quan

của cây african violet mới trồng, (b2) Hình thái các cơ quan của cây african violet

trồng được 30 ngày ngoài vườn ươm.

Hình 4.6. African violet ra hoa sau 4 tháng trồng ngoài vƣờn ƣơm

Các cây in vitro khi mới đƣợc chuyển s ng môi trƣờng vƣờn ƣơm cần một giai

đoạn để thích nghi với môi trƣờng mới. Trƣờng hợp không thích nghi đƣợc, các

chồi sẽ dần héo úa và chết đi, hoặc sống mà không tạo thêm h y tăng trƣởng thêm

rễ đƣợc trên môi trƣờng đất.

Trong thí nghiệm này, tuy chỉ mới 30 ngày sau khi trồng cây r vƣờn ƣơm,

nhƣng có thể kết luận các cây có sự thích nghi, sinh trƣởng và phát triển tốt, quan

sát thấy các con có sự sinh trƣởng và phát triển hoàn toàn bình thƣờng, không có sự

khác biệt giữa các mẫu cấy khử trùng bằng nano bạc so với các mẫu cấy còn lại

(hình 4.6). Các lá có xu hƣớng vƣơn ra, tỏa tròn, tán phủ kín gốc (hình 4.6a2) so với

các cây khi mới trồng (hình 4.6a1).

Sau 4 tháng, một số cây đã có hoa (Hình 4.6). Song song đó, có thể nhận thấy

sự th y đổi đáng kể về kích thƣớc và màu sắc của các bộ phận trên cây. Cuống lá

cây tròn, ngắn, đậm màu hơn, khác so với đặc điểm sinh trƣởng của cây in vitro

(hình 4.6b1, b2).

Trong lá, hoa, của cây african violet có chứa sắc tố anthocyanin. Khi cây sinh

trƣởng và phát triển tốt ở điều kiện tự nhiên sẽ tổng hợp nhiều sắc tố (Khokhar et

al., 1982), qu đó, có thể thấy rõ sự thích nghi, sinh trƣởng và phát triển của các cây

con african violet. Điều này một lần nữa chứng minh nano bạc có khả năng khử

trùng mà không có bất kỳ tác động bất lợi nào lên đặc tính sinh trƣởng của cây con.

Kết quả này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu củ Abdi và đồng tác giả (2008).

Trong khi đó, kết quả này khác với kết quả của Aghdaei và đồng tác giả

(2012) khi sử dụng nano bạc trong vi nhân giống Tecomella undulata (Roxb.) Seem

đã hạn chế đƣợc hiện tƣợng rụng lá gây ra bởi ethylene, tăng hệ số nhân chồi, chiều

cao và tỷ lệ sống sót khi r vƣờn ƣơm. Trong nghiên cứu của mình, Savithramma và

đồng tác giả đã nhận thấy, nano bạc kích thích sự nảy mầm, phát triển ở cây

Boswellia ovaliofoliolata. R zz q và các đồng tác giả (2016) c ng đã nhận thấy tác

động tích cực của nano bạc lên sự tăng trƣởng, năng suất lúa mì khi bón nano bạc

vào đất ở nồng độ thấp.

Bên cạnh đó, còn có rất nhiều báo cáo về sự ảnh hƣởng của nano bạc đến giai

đoạn vƣờn ƣờm. Do nano bạc ức chế tổng hợp ethylene trong nuôi cấy mô bằng

cách ức chế hoạt động SAM hoặc làm mất liên kết ethylene và ngăn ngừa các tín

hiệu ức chế của ethylene lên thực vật bao gồm các tác động tiêu cực nhƣ rụng lá,

giảm hàm lƣợng chlorophyll khiến cây khó thích nghi với điều kiện ex vitro dẫn đến

cây chết dần hoặc không tạo rễ. (Nel et al., 2009). Trong nghiên cứu này, những cây

con có nguồn gốc từ mẫu cấy khử trùng nano bạc hoàn toàn sinh trƣởng tốt và

không có sự khác biệt với cây con in vitro thông thƣờng.

Chƣơng 5

KẾT LUẬN

VÀ

KIẾN NGHỊ

CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1. Kết luận

5.1.1. Kết quả đạt đƣợc

Có thể nhận thấy, thông số khử trùng của các chất khử trùng hoàn toàn không

giống nhau. Thông số khử trùng tốt nhất của nano bạc là 0,05% trong 15 phút.

Trong khi thông số khử trùng tốt nhất của HgCl2 là 0,1% trong thời gian 5 phút,

Ca(ClO)2 là 10% trong 10 phút và AgNO3 là 1% trong 20 phút.

Trong đề tài này, chúng tôi đã khảo sát và so sánh khả năng khử trùng của

nano bạc với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3]. Kết quả

chứng minh nano bạc có khả năng khử trùng mẫu cấy nhƣ một chất khử trùng độc

lập. Ngoài ra, so với các chất khử trùng thông dụng [HgCl2, Ca(ClO)2, AgNO3],

nano bạc cho tỷ lệ khử trùng thành công cao nhất ở cả mẫu lá (71,67%) và cuống lá

(63,33%) mà không gây ra bất kỳ tác động bất lợi nào đến sự sinh trƣởng và phát

triển của mẫu cấy.

Các chất khử trùng khác nhau có ảnh hƣởng đến thời gian cảm ứng khác nhau

của mẫu cấy, các mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng AgNO3 và nano bạc có sự xuất hiện

của rễ tơ. Các cây con khử trùng từ các chất khử trùng khác nhau không có sự khác

biệt về kiểu hình ở gi i đoạn tạo cây hoàn chỉnh và chuyển r vƣờn ƣơm.

5.1.2. Quy trình khử trùng mẫu cấy african violet bằng nano bạc

Sau khi nghiên cứu và khảo sát, chúng tôi có đề xuất một quy trình khử trùng

mẫu cấy bằng nano bạc hiệu quả nhất để phục vụ công tác nhân giống african violet

theo hình 5.1:

Hình 5.1. Sơ đồ khử trùng mẫu cấy bằng nano bạc trong quy trình nhân giống cây african violet

5.2. Kiến nghị

Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, dòng chảy tế bào,… để đánh giá tác

động, tích l y, hấp thu và chuyển hóa của nano bạc trong quá trình khử trùng

mẫu.

Nghiên cứu ảnh hƣởng của nano bạc trong nhân giống in vitro cây african

violet.

Tiếp tục nghiên cứu khả năng khử trùng của nano bạc trên nhiều đối tƣợng

khác nhau và thiết lập khoảng giới hạn nồng độ chuẩn cho nano bạc trong khử

trùng mẫu cấy.

DANH MỤC

CÁC CÔNG TRÌNH

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH

1. Dƣơng Tấn Nhựt, Dƣơng Bảo Trinh, Hoàng Th nh Tùng, Nguyễn Phúc Huy, V

Thị Hiền, V Quốc Luận (2017). N no bạc: chất khử trùng mẫu mới trong nhân

giống vô tính cây african violet (Saintpaulia ionantha H.WendL.). Tạp chí công

nghệ sinh học.

TÀI LIỆU

THAM KHẢO

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Tài liệu tiếng Việt

[1]. Dƣơng Tấn Nhựt, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Lê Kim

Cƣơng, V Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, V Thị

Hiền, Trịnh Thị Hƣơng, Nguyễn Hồng Hoàng, Nguyễn Xuân Tuấn,

Nguyễn Thanh Sang, Nguyễn Việt Cƣờng, Đỗ Mạnh Cƣờng, Nguyễn

Hoài Châu, Ngô Quốc Bƣu (2014). Khảo sát ảnh hƣởng của nano bạc lên

sự sinh trƣởng và phát triển củ cây Cúc, Dâu tây, Đồng tiền nuôi cấy in

vitro. Tạp chí Công nghệ Sinh học. 12(1):103-111.

[2]. Dƣơng Tấn Nhựt, Phan Xuân Huyên, Nguyễn Hồng Việt, Nguyễn Văn

Bình, V Quốc Luận, Nguyễn Đuốc Huệ, Bùi Văn Lệ, Nguyễn Hồng V ,

Nguyễn Văn Phác, Hồng Ngọc Trâm, Ôn Kim Nguyên (2005). Phƣơng

pháp thủy canh trong việc nâng cao chất lƣợng cây hoa african violet phục

vụ ngƣời trồng hoa. Tạp chí Khoa học và Công nghệ. 43(2):52-56.

[3]. Nguyễn Thị Kim Luyến, Nguyễn Thị Hồng Anh, Trịnh Cẩm Tú, Bùi

Trang Việt, Bùi Văn Lệ (2008). Sự nuôi cấy mô phân sinh ngọn và nụ hoa

của cây tím Phi (Saintpaulia ionantha H. WendL.). Tạp chí Phát triển

Khoa học và Công nghệ. 11(7):25-31.

[4]. Phạm Tấn Trƣờng, Võ Thị Bạch Mai (2008). Nhân giống vô tính cây

Saintpaulia bằng phƣơng pháp in vitro. Tạp chí Phát triển Khoa học và

Công nghệ. 11(7):61-66.

[5]. Trần Công Khánh (1981). Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật. NXB

Đại học và Trung học chuyên nghiệp. HN:44-105.

[6]. Trần Trung Hiếu (2006). Nuôi cấy in vitro mô lớp mỏng tế bào lá

Saintpaulia ionantha H. WendL., để thăm dò sự chuyển gen bằng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Luận án thạc sĩ kho học chuyên

ngành vi sinh. Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia

Thành phố Hồ Chí Minh.

[7]. Trần Văn Minh (2004). Công nghệ sinh học – Giáo trình cao học – nghiên

cứu sinh. Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.

2. Tài liệu tiếng Anh

[8]. Abdi G (2012). Evaluation the potential of Nano silver for removal of

bacterial contaminants in valerian (Valeriana officinalis L.) tissue culture.

J Biol Environ. 6(17):199-205.

[9]. Abdi G, Salehi H, Khosh-Khui M (2008). Nano Silver: a novel

nanomaterial for removal of bacterial contaminants in valerian (Valeriana

officinalis L.) tissue culture. Acta Physiol Plant. 30(5):709-714.

[10]. Aghdaei M, Salehi H, Sarmast MK (2012). Effects of silvernanoparticles

on Tecomella undulata (Roxb.) Seem. micropropagation. Adv Hortic Sci.

26(1):21-24.

[11]. Bais HP, Sudha G, Suresh B, Ravishankar GA (2000). AgNO3 influences

in vitro root formation in Decalepisha miltonii Wight and Arn. Curr Sci.

79(6):894-898.

[12]. Bernard F, Moghadam NN, Mirzajani F (2015). The effect of colloidal

silver nanoparticles on the level of lignification and hyperhydricity

syndrome Thymus daenensis in vitro shoots: a possible involvement of

bonded poly mines”. In vitro Cell Dev Biol Plant. 51(5):546-553.

[13]. Bilkey PC, Cocking EC (1982). A non-enzymatic method for isolation of

protoplasts from callus of Saintpaulia ionantha (african violet). Plant

Physiol. 105(3):285-288.

[14]. Carpita NC, Gibeaut DM (1993). Structural models of primary cell walls

in owering plants: con – sistency of molecular structure with the physical

properties of the walls during growth. Plant J. 3(1):1-30.

[15]. Chaloupka K, Malam Y, Seifalian AM (2010). Nanosilver as a new

generation of nanoproduct in biomedical applications. Trends Biotechnol.

28(11):580-588.

[16]. Chau NH, Bang LA, Buu NQ, Dung TTN, Ha HT, Quang DV (2008).

Some results in manufacturing of nanosilver and investigation of its

application for disinfection. J Chem Chem Eng. 9(2):251-258.

[17]. Chi GL, Pua EC, Goh CJ (1991). Role of ethylene on de novoshoot

regeneration from cotyledonary explants of Brassica campestris L.

Pekinesis (Lour) Olsson in vitro. Plant Physiol. 96(1):178-183.

[18]. Corredor E, Testillano PS, Coronado M, Gonzalez-Melendi P, Fernandez-

Pacheco R, Marquina C, Ibarra MR, de la Fuente JM, Rubiales D, Perez-

de-Luque A, Risueno MC (2009). Nanoparticle penetration and transport

in living pumpkin pl nts: in situ subcellul r identiﬁc tion. BMC Plant

Biol. 23:9-45.

[19]. Dallon J (1987). Effects of spent mushroom compost on the production of

greenhouse-grown crops. Int Plant Pro Soc. 37:232-329.

[20]. Dean KM, Qin Y, Palmer AE (2012). Visualizing metal ions in cells: an

overview of analytical techniques, approaches, and probes. Biochim

Biophys Acta. 1823(9):1406-1415.

[21]. Du W, Sun Y, Ji R (2011). TiO2 and ZnO nanoparticles negatively afect

wheat growth and soil enzyme activiitiies in agricultural soil. J Environ

Monit. 13(4):822-828.

[22]. Duncan DB (1955). Multiple range and multiple F test. Biometrics.

11(1):1-42.

[23]. Evans PT, Malmberg RL (1989). Do polyamines have role in plant

development? Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 40:235-269.

[24]. Fakhrfeshani M, Bagheri A, Sharifi A (2012). Disinfecting effects of nano

silver fluids in Gerbera (Gerbera jamesonii) capitulum tissue culture. Adv

Hortic Sci. 6(17):121-127.

[25]. Galston AW (1983). Polyamines as modulators of plant development.

American Inst Sci. 33(6):382-388.

[26]. George EF (1993). Part 1-The Technology. Tiss Cult. Exegetics,

Basingstoke.

[27]. Gharati S, Zarghami R, Amiri M (2010). Evaluation of Nano silver

Application for Eliminate Contamination and Viability Cultured Segment

node of Persian Walnut in in vitro Condition. The 5st Conference of New

Idea in Agriculture, Islamic Azad University, Khorasgan, Iran.

[28]. Hakozaki M (1993). Effects of auxin and cytokinin on formation of callus

and shoot of in vitro culturing leaf explant in african violets (Saintpaulia

ionantha). Technische University. Germany.

[29]. Halevy A, Mayak S (1981). Senescence and post harvest physiology of cut

flowers-part 2. In J Janick ed Horticultural Reviews. Westport. CT. 3:59-

143.

[30]. Husen A, Siddiqi KS (2014). Phytosynthesis of nanoparticles: concept,

controversy and application. Nano Res Lett. 9(1):229.

[31]. Hussain S, Lane SD, Lane DN (1994). A preliminary evaluation of the use

of microbial culture filtrates for the control of contaminants in plant tissue

culture systems. Plant Cell Tiss Org Cult. 36(1):45-51

[32]. Ines M, Krunoslav D, Vesna T, Marija V, Ankica P, Zlatko C, Boris P,

Zorica J (2013). In vitro sterilization procedures for micropropagation of

Oblaciska sour cherry. J Agric Sci. 58(2):117-126.

[33]. Jungnickel F, Zaid S (1992). Micropropagation of african violets

(Saintpaulia sp. and cvs.). In Bajaj YPS ed Biotechnology in agriculture

and forestry. Springer. Berlin Heidelberg New York. 357-395.

[34]. K rgov SI, Korolev NI, St nisl vskiĭ OB, Kuznetsov IA (1986).

Interaction of immobilized DNA with silver ions. Mol Biol (Mosk).

20(6):1499-1505.

[35]. Khokhar JA, Humphreys JM, Short KC, Grout BWW (1982).

Anthocyanins in african violet. Adv Hort Sci. 17(5):810-811.

[36]. Kim JS, Kuk E, Yu KN, Kim J, Park SJ, Lee HJ, Kim SH, Park YK, Park

YH, Hwany CY, Kim YK, Lee SY, Jeong DH, Cho MH (2007).

Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomedicine. 3(1):95-101.

[37]. Kumar SV, Rajm MV (2004). Polyamine ethylene nexus: A potential

target for post harvest biotechnology. Ind J Biol. 3(2):299-304.

[38]. Kurepa J, Paunesku T, Vogt S, Arora H, Rabatic BM, Lu J, Wanzer MB,

Woloschak GE, Smalle JA (2010). Uptake and distribution of ultrasmall

anatase TiO2 Alizarin red S nanoconjugates in Arabidopsis thaliana. Nano

Lett. 10(7):2296-2302.

[39]. Larue C, Castillo-Michel H, Sobanska S, Cécillon L, Bureau S, Barthès V

(2014). Foliar exposure of the crop Lactuca sativa to silver nanoparticles:

evidence for internalization and changes in Ag speciation. J Hazard

Mater. 264:98-106.

[40]. Levard C, Hotze EM, Lowry GV (2012). Environmental transformations

of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environ Sci

Technol. 46(13):6900-6914.

[41]. Liu Q, Zhao Y, Wan Y (2010). Study of the inhibitory effect of water-

soluble fullerenes on plant growth at the cellular level. J Am Chem Soc.

4(10):5743-5748.

[42]. Lowry GV, Mclean JE, Latta DE (2012). CuO and ZnO nanoparticles:

phytotoxicity, metal speciation, and induction of oxidative stress in sand-

grow wheat. J Nanopart Res. 14(9):1-15.

[43]. Miyazaki JH, Yang SF (1987). The methionine salvage pathway in

relation to ethylene and polyamine biosynthesis. Physiol Plant. 69(2):366-

370.

[44]. Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol. 15(3):473-497.

[45]. Nasser M, Sepideh ZV, Sajjad K (2013). Plant in vitro culture goes nano:

nanosilver-mediated decontamination of ex vitro explants. J Nanomed

Nanotechnol. 4(2):161-164.

[46]. Navarro EAB, Behra R, Hartman NB, Filser J, Miao AJ, Quiagg A,

Santschi PH, Sigg L (2008). Environmental behavior and ecotoxicity of

engineered nano particles to algae, plants, and fungi. Ecotoxicology.

17(5):372-386.

[47]. Nel AE, Mädler L, Velegol D (2009). Understanding biophysicochemical

interactions at the nanobio interface. Nat Mater. 8(7):543-557.

[48]. Rodriguez FI, Esch JJ, Hall AE, Binder BM, Schaller GE, Bleecker AB

(1999). A copper cofactor for the ethylene receptor ETR1 from

Arabidopsis. Sci. 283(5404):996-998.

[49]. Rostami AA, Shahsavar A (2009). Nano – Silver particles eliminate the in

vitro contaminations of olive 'Mission' explants. Asian J Plant Sci.

8(7):505-509.

[50]. Russell AD, Hugo WB (1994). Antimicrobial activity and action of silver.

Prog Med Chem. 31:351-371

[51]. Saber S, Ali B, Marzieh A, Shahriar H, Mohammad MA (2014). The

effects of different concentrations of Nano – Silver on elimination of

Bacterial contaminations and phenolic exudation of Rose (Rosa hybrida

L.). Int J Farm All Sci. 3(1):50-54.

[52]. Salama HMH (2012). Effects of silver nanoparticles in some crop plants,

common bean (Phaseolus vulgaris L.) and corn (Zea mays L.). Int Res J

Biotechnol. 3(10):190-197.

[53]. Sarmast MK, Salehi H, Khosh-Khui M (2011). Nano silver treatment is

effective in reducing bacterial contamination of Araucaria excelsa R. Br.

var. glauca explants. Acta Biol Hung. 62(4):477-484.

[54]. Seif SM, Sorooshzadeh AH, Rezazadeh S, Naghdibadi HA (2011). Effect

of nano-silver and silver nitrate on seed yield of borage. J Med Plant Res

5(2):171-175.

[55]. Sharma A, Kumar V, Giridhar P, Ravishankar GA (2008). Induction of in

vitro flowering in Capsicum frutescens under the influence of silver nitrate

and cobalt chloride and pollen transformation. Electron J Biotechnol.

11(2):84-89.

[56]. Shizuka O (1993). Scanning electron microscopy of shoot differentiation

in vitro from leaf explants of the african violet. Plant Cell Tiss Org Cult.

36(2):157-162.

[57]. Siddhartha S, Tanmay B, Arnab R, Gajendra, Ramachandrarao P,

Debabrata D (2007). Characterization of enhanced antibacterial effects of

novel silver nanoparticles. Nanotechnology. 18(22):225103-225111.

[58]. Sondi I, Salopek-Sondi B (2004). Silver nanoparticles as antimicrobial

agent: a case study as a model for gram-negative bacteria. J Colloid

Interface Sci. 275(1):177-182.

[59]. Songstad DD, Ducan DR, Widholm JM (1988). Effect of 1-

aminocycopropane-1-carboxilic acid silver nitrate and norbornadiene on

plant regeneration from maize callus cultures. Plant Cell Rep. 7(4):262-

265.

[60]. Speranza A, Leopold K, Maier M (2010). Pd-nanoparticles cause

increased toxicity to kiwifruit ppollen coompared to soluble Pb(II).

Environ Pollut. 158(3):837-882.

[61]. Street HE (1975). Tissue culture and plant science. Biol Plant. 17(6):457.

[62]. Syua YY, Hungb JH, Chenb JC, Chuang HW (2014). Impacts of size and

shape of silver nanoparticles on Arabidopsis plant growth and gene

expression. Plant Physiol Biochem. 83:57-64.

[63]. Tabor CW, Tabor H (1984). Polyamines. Annu Rev Plant Biol. 53(1):749-

790.

[64]. Van Den BD, Van Den SD, Van MM, Caplan A (1994). A group of

chromosomal proteins is specifically released by spermine and loses

DNA-binding activity upon phosphorylation. Plant Physiol. 106(2):559-

566.

[65]. Walden R, Cordeiro A, Tiburcio AF (1997). Polyamines: small molecules

triggering pathways in plant growth and development. Plant physiol.

113(4):1009-1013.

[66]. Wang S, Kurepa J, Smalle JA (2011). Ultra-small TiO2 nanoparticles

disrupt microtubular networks in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Environ.

34(5):811-820.

[67]. WHO (2000). Air Quality Guidelines for Europe, 2nd ed. World Health

Organization Regional Office for Europe. Copenhagen.

[68]. Wild E, Jones KC (2009). Novel method for the direct visualization of in

vivo nanomaterials and chemical interactions in plants. Environ Sci

Technol. 43(14):5290-5294.

[69]. Zhao XQX, Mattews DE, Schaller GE (2002). Effect of ethylene pathway

mutations upon expression of the ethylene receptor ETR1 from

Arabidopsis. Plant Physiol. 130(4):1983-1991.

PHỤ LỤC

1. Thành phần môi trƣờng khoáng MS (Murashige and Skoog, 1962)

Khoáng đa lƣợng Hàm lƣợng (mg/l)

1900 1 KNO3

1650 2 NH4NO3

440 3 CaCl2.H2O

370 4 MgSO4.7H2O

170 5 KH2PO4

Khoáng vi lƣợng Hàm lƣợng (mg/l)

22,3 1 MnSO4. 4H2O

6,2 2 H3BO3

0,025 3 CoCl2.6H2O

0,025 4 CuSO4.5H2O

27,8 5 FeSO4.7H2O

37,2 6 Na2EDTA.2H2O

0,83 KI 7

0,25 8 Na2MoO4.2H2O

8,6 9 ZnSO4.7H2O

Hàm lƣợng (mg/l) Vitamin

100 Myo-inositol 1

0,5 Nicotinic aAcid 2

0,5 Pyridoxine HCl 3

0,1 Thiamine HCl 4

119 240 359

F-Ratio 448.59

P-Value 0.0000

Sum of Squares Df 85264.2 383.333 85647.5

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

2. Xử lý số liệu

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

One-Way ANOVA - Ty_Le_Thanh_Cong by Nghiem_Thuc of Mau Cuong La Dependent variable: Ty_Le_Thanh_Cong (%) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 360 Number of levels: 120 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for Ty_Le_Thanh_Cong. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of Ty_Le_Thanh_Cong for the 120 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for Ty_Le_Thanh_Cong by Nghiem_Thuc Mean Square Source 716.506 Between groups 1.59722 Within groups Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of Ty_Le_Thanh_Cong into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 448.595, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean Ty_Le_Thanh_Cong from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for Ty_Le_Thanh_Cong by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent DMRT Nghiem_Thuc b(4-5) d(3-3) d(4-1) b(5-1) d(3-4) d(3-6) a(1-4) d(5-2) d(5-5) a(5-4) d(5-6) d(4-2) b(5-2) a(3-3) a(3-4) a(3-5) a(3-6) a(4-1) a(1-5) a(4-3) a(1-2) b(5-4) a(2-6) a(1-1)

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

d(5-1) a(3-1) a(1-3) d(4-6) a(5-6) b(1-1) b(1-2) b(1-3) b(1-4) b(1-5) b(1-6) b(2-1) b(2-2) b(2-3) b(2-4) a(2-4) b(2-6) b(3-1) a(2-5) b(3-3) a(4-5) d(5-4) b(3-6) a(4-6) b(4-2) a(5-1) a(1-6) a(5-2) b(4-6) a(5-3) a(2-1) b(5-3) a(5-5) b(5-5) b(5-6) c(1-1) c(1-2) c(1-3) c(1-4) c(1-5) c(1-6) c(2-1) c(2-2) c(2-3) c(2-4) c(2-5) c(2-6) c(3-1) c(3-2) c(3-3) c(3-4) c(3-5) c(3-6) c(4-1) c(4-2) c(4-3) a(4-2) b(2-5) c(4-6)

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X XX XX XX XX X X X X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 16.6667 18.3333 18.3333 23.3333 23.3333 25.0 31.6667 46.6667 48.3333 50.0 51.6667 51.6667 53.3333 56.6667 61.6667 63.3333

c(5-1) c(5-2) c(5-3) b(3-2) a(4-4) c(5-6) d(1-1) d(1-2) d(1-3) d(1-4) d(1-5) d(1-6) d(2-1) d(2-2) d(2-3) d(2-4) d(2-5) d(2-6) d(3-1) d(3-2) b(4-1) b(4-4) d(5-3) a(2-3) d(3-5) b(3-5) a(3-2) b(3-4) d(4-5) a(2-2) b(4-3) c(5-5) c(4-4) c(5-4) c(4-5) d(4-3) d(4-4)

119 240 359

F-Ratio 2544.66

P-Value 0.0000

Mean Square 6184.94 2.43056

Sum of Squares Df 736008. 583.333 736592.

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

One-Way ANOVA - Ty_Le_Chet by Nghiem_Thuc of Mau Cuong La Dependent variable: Ty_Le_Chet (%) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 360 Number of levels: 120 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for Ty_Le_Chet. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of Ty_Le_Chet for the 120 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for Ty_Le_Chet by Nghiem_Thuc Source Between groups Within groups Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of Ty_Le_Chet into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 2544.66, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean Ty_Le_Chet from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for Ty_Le_Chet by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent DMRT Nghiem_Thuc b(3-2) d(1-2) c(1-2) c(1-1) c(1-5) c(4-1) c(1-3) d(3-3) c(2-1) c(1-4) b(1-3) c(3-3) c(5-2) c(5-3) b(2-2) a(1-2) b(2-3) d(5-1) c(2-2) d(3-4) c(2-4) b(2-5) c(2-3) c(2-5) c(5-1) a(1-3) b(3-3)

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X XX XX XX XX XX X X X X X X X X X X X X X XX X X X X X

d(1-1) d(4-2) b(1-1) b(1-2) c(4-2) b(1-4) b(1-5) c(4-3) b(2-1) d(5-2) a(1-1) b(2-4) c(3-2) a(2-1) b(3-1) c(3-4) c(3-1) a(3-1) d(4-1) d(2-5) d(3-2) b(4-2) d(3-1) d(2-4) d(2-1) d(2-3) d(2-2) b(4-1) d(1-4) d(1-5) d(1-3) d(1-6) d(4-3) c(1-6) d(4-4) c(4-4) c(4-5) b(4-3) c(5-4) c(5-5) d(3-5) a(2-2) b(5-1) d(4-5) b(3-4) b(3-5) a(3-2) a(2-3) a(1-4) d(5-3) b(4-4) c(3-5) b(1-6) a(1-5) a(4-1) c(2-6) b(5-6) a(5-6) a(3-3)

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 21.6667 25.0 28.3333 33.3333 35.0 36.6667 38.3333 40.0 41.6667 43.3333 43.3333 46.6667 53.3333 65.0 73.3333 75.0 78.3333 78.3333 81.6667 83.3333 83.3333 86.6667 88.3333 90.0 93.3333 100.0 100.0 100.0

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

b(5-5) b(5-4) a(5-5) d(4-6) b(5-3) b(5-2) a(5-4) b(4-6) a(5-3) b(4-5) a(5-2) d(2-6) a(5-1) b(3-6) a(4-6) a(2-6) a(1-6) a(4-5) c(5-6) a(4-4) d(3-6) a(2-5) c(4-6) b(2-6) a(4-3) a(4-2) a(2-4) c(3-6) a(3-6) a(3-5) d(5-4) d(5-5) d(5-6) a(3-4)

119 240 359

F-Ratio 3456.17

P-Value 0.0000

Mean Square 6960.34 2.01389

Sum of Squares Df 828280. 483.333 828763.

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

One-Way ANOVA - Ty_Le_Nhiem by Nghiem_Thuc of Mau Cuong La Dependent variable: Ty_Le_Nhiem (%) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 360 Number of levels: 120 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for Ty_Le_Nhiem. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of Ty_Le_Nhiem for the 120 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for Ty_Le_Nhiem by Nghiem_Thuc Source Between groups Within groups Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of Ty_Le_Nhiem into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 3456.17, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean Ty_Le_Nhiem from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for Ty_Le_Nhiem by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent DMRT Nghiem_Thuc b(3-6) a(4-6) c(4-6) b(2-6) a(3-4) a(2-5) a(5-3) a(5-1) a(4-2) c(5-6) d(2-6) d(3-6) c(3-6) d(5-6) b(5-6) b(5-2) a(3-2) a(5-5) a(5-4) b(4-5) a(2-6) a(4-4) a(3-6) a(2-4) b(4-4) b(4-6)

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X XX XX XX XX XX X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

d(5-5) d(4-6) a(3-3) a(3-5) b(5-3) d(5-4) b(5-4) d(4-5) a(5-6) b(5-5) d(5-3) a(5-2) a(4-5) a(1-6) a(4-3) d(4-4) b(3-4) b(3-5) a(2-3) c(2-6) c(5-5) c(4-5) a(2-2) c(5-4) a(4-1) a(1-5) b(4-3) c(4-4) b(1-6) d(4-3) c(3-5) a(1-4) d(3-5) b(5-1) c(1-6) d(1-6) c(1-3) c(1-2) b(1-1) c(1-1) d(5-2) d(5-1) a(2-1) d(4-2) d(4-1) d(3-4) d(3-3) d(3-2) a(3-1) d(3-1) d(2-4) b(4-2) d(2-3) d(2-2) d(2-1) a(1-3) b(4-1) d(1-4) d(1-3)

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 3.33333 3.33333 3.33333 3.33333 6.66667 6.66667 6.66667 8.33333 10.0 10.0 11.6667 11.6667 13.3333 13.3333 13.3333 16.6667 21.6667 33.3333 53.3333 71.6667 78.3333 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.00 100.0 100.0

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

d(1-2) d(1-1) b(3-3) b(3-2) c(5-3) c(5-2) b(3-1) c(5-1) d(1-5) b(2-5) c(4-3) c(4-2) b(2-4) c(4-1) d(2-5) b(2-3) c(3-4) b(2-2) c(3-3) c(3-2) b(2-1) c(3-1) c(2-5) c(2-4) b(1-5) c(2-3) c(2-2) b(1-4) c(2-1) b(1-3) c(1-5) c(1-4) b(1-2) a(1-2) a(1-1)

119 240 359

F-Ratio 496.56

P-Value 0.0000

Sum of Squares Df 106691. 433.333 107124.

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

One-Way ANOVA - Ty_Le_Thanh_Cong by Nghiem_Thuc of Mau La Dependent variable: Ty_Le_Thanh_Cong (%) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 360 Number of levels: 120 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for Ty_Le_Thanh_Cong. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of Ty_Le_Thanh_Cong for the 120 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for Ty_Le_Thanh_Cong by Nghiem_Thuc Mean Square Source 896.563 Between groups 1.80556 Within groups Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of Ty_Le_Thanh_Cong into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 496.558, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean Ty_Le_Thanh_Cong from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for Ty_Le_Thanh_Cong by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent DMRT Nghiem_Thuc D(3-4) D(3-2) D(4-1) D(4-2) B(4-5) D(3-3) A(1-2) D(5-2) D(5-1) B(5-1) D(5-6) B(5-4) D(3-6) A(3-3) A(3-4) A(3-5) A(3-6) A(4-1) A(1-5) A(4-3) D(4-6) A(5-4) A(2-6) A(1-6) D(5-4) A(3-1)

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

A(1-1) A(1-3) A(5-6) B(1-1) B(1-2) B(1-3) B(1-4) B(1-5) B(1-6) B(2-1) B(2-2) B(2-3) B(2-4) A(2-4) B(2-6) B(3-1) A(2-5) B(3-3) A(4-5) B(5-2) B(3-6) A(4-6) B(4-2) A(5-1) D(5-5) A(5-2) B(4-6) A(5-3) A(2-1) B(5-3) A(5-5) B(5-5) B(5-6) C(1-1) C(1-2) C(1-3) C(1-4) C(1-5) C(1-6) C(2-1) C(2-2) C(2-3) C(2-4) C(2-5) C(2-6) C(3-1) C(3-2) C(3-3) C(3-4) C(3-5) C(3-6) C(4-1) C(4-2) C(4-3) B(2-5) A(4-2) C(4-6) C(5-1) C(5-2)

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 13.3333 23.3333 23.3333 25.0 25.0 25.0 33.3333 45.0 46.6667 51.6667 53.3333 53.3333 56.6667 60.0 60.0 71.6667 75.0

C(5-3) B(3-2) A(4-4) C(5-6) D(1-1) D(1-2) D(1-3) D(1-4) D(1-5) D(1-6) D(2-1) D(2-2) D(2-3) D(2-4) D(2-5) D(2-6) D(3-1) B(4-1) A(1-4) A(3-2) B(4-4) A(2-3) D(5-3) D(3-5) B(3-5) B(3-4) C(5-5) C(5-4) C(4-5) C(4-4) A(2-2) D(4-3) B(4-3) B(4-1) D(4-4) D(4-5)

119 240 359

F-Ratio 2522.34

P-Value 0.0000

Mean Square 5955.53 2.36111

Sum of Squares Df 708708. 566.667 709274.

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

One-Way ANOVA - Ty_Le_Chet by Nghiem_Thuc of Mau La Dependent variable: Ty_Le_Chet (%) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 360 Number of levels: 120 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for Ty_Le_Chet. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of Ty_Le_Chet for the 120 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for Ty_Le_Chet by Nghiem_Thuc Source Between groups Within groups Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of Ty_Le_Chet into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 2522.34, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean Ty_Le_Chet from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for Ty_Le_Chet by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent DMRT Nghiem_Thuc C(1-1) D(1-3) C(1-4) C(1-3) C(1-2) B(3-3) D(5-2) C(3-1) C(2-3) C(2-2) C(1-5) B(1-3) C(5-2) D(4-2) C(3-4) A(1-2) B(2-5) C(4-3) C(2-4) C(2-5) C(3-3) B(2-3) D(3-4) D(2-5) A(1-3) C(2-1) C(5-3)

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X XX XX X X X XX XX X X X X X X X X X X X X X X X X X

D(1-2) B(3-2) B(1-1) B(1-2) C(4-2) B(1-4) B(1-5) C(5-1) B(2-1) D(3-3) A(1-1) B(2-4) C(3-2) A(2-1) B(3-1) C(4-1) B(2-2) A(3-1) D(4-1) D(5-1) D(3-2) B(4-2) D(3-1) D(2-4) D(2-1) D(2-3) D(2-2) D(1-5) D(1-1) B(4-1) D(1-4) D(1-6) D(4-3) B(5-1) C(1-6) D(4-4) D(3-5) B(4-3) D(4-5) C(4-4) C(4-5) C(3-5) A(2-2) C(5-4) B(3-4) A(1-4) C(5-5) B(3-5) A(1-5) B(1-6) D(5-3) A(4-1) B(4-4) A(2-3) A(3-2) C(2-6) B(5-6) A(5-6) A(3-3)

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 11.6667 11.6667 13.3333 18.3333 20.0 21.6667 23.3333 23.3333 35.0 36.6667 36.6667 38.3333 43.3333 46.6667 46.6667 50.0 51.6667 63.3333 66.6667 68.3333 71.6667 76.6667 76.6667 80.0 90.0 100.0 100.0 100.0

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

B(5-5) B(5-4) A(5-5) D(4-6) B(5-2) A(5-4) B(5-3) B(4-6) A(5-3) B(4-5) A(5-2) D(2-6) A(5-1) B(3-6) A(4-6) A(2-6) A(1-6) A(4-5) C(5-6) A(4-4) D(3-6) A(2-5) C(4-6) B(2-6) A(4-3) A(4-2) A(2-4) C(3-6) A(3-6) A(3-5) D(5-4) D(5-5) D(5-6) A(3-4)

119 240 359

F-Ratio 4031.28

P-Value 0.0000

Mean Square 6718.8 1.66667

Sum of Squares Df 799537. 400.0 799937.

Homogeneous Groups X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Count Mean 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

One-Way ANOVA - Ty_Le_Nhiem by Nghiem_Thuc of Mau La Dependent variable: Ty_Le_Nhiem (%) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 360 Number of levels: 120 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for Ty_Le_Nhiem. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of Ty_Le_Nhiem for the 120 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for Ty_Le_Nhiem by Nghiem_Thuc Source Between groups Within groups Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of Ty_Le_Nhiem into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 4031.28, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean Ty_Le_Nhiem from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for Ty_Le_Nhiem by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent DMRT Nghiem_Thuc B(5-5) A(4-6) A(4-3) C(5-6) A(5-5) B(3-6) A(4-2) D(4-6) A(5-1) A(4-4) A(1-4) A(2-3) A(2-5) D(5-6) D(5-5) C(3-6) A(3-4) B(5-6) A(5-3) A(1-6) D(2-6) A(4-5) A(3-6) A(2-4) B(4-4) B(4-6)

X X X X X X X X X X X X X X X X XX XX XX XX XX XX XX X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

B(4-5) C(4-6) A(3-3) A(3-5) B(2-6) D(5-4) B(5-4) B(5-2) B(5-3) A(5-6) D(3-6) A(5-4) A(5-2) A(2-6) D(4-5) C(5-5) D(5-3) A(3-2) D(4-4) C(5-4) A(2-2) C(2-6) C(4-5) C(4-4) B(4-3) B(3-4) B(3-5) A(4-1) D(4-3) B(1-6) A(1-5) D(3-5) C(3-5) C(1-6) B(5-1) D(1-6) C(1-3) C(1-2) B(1-1) C(1-1) D(5-2) D(5-1) A(2-1) D(4-2) D(4-1) D(3-4) D(3-3) D(3-2) A(3-1) B(4-1) D(3-1) D(2-4) B(4-2) D(2-3) D(2-2) D(2-1) A(1-3) D(1-4) D(1-3)

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 1.66667 5.0 6.66667 6.66667 8.33333 8.33333 8.33333 10.0 11.6667 13.3333 16.6667 20.0 23.3333 28.3333 31.6667 33.3333 36.6667 53.3333 63.3333 81.6667 86.6667 88.3333 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.00 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

D(1-2) D(1-1) B(3-3) B(3-2) C(5-3) C(5-2) B(3-1) C(5-1) D(1-5) B(2-5) C(4-3) C(4-2) B(2-4) C(4-1) D(2-5) B(2-3) C(3-4) B(2-2) C(3-3) C(3-2) B(2-1) C(3-1) C(2-5) C(2-4) B(1-5) C(2-3) C(2-2) B(1-4) C(2-1) B(1-3) C(1-5) C(1-4) B(1-2) A(1-2) A(1-1)

1.66146 0.00747608

P-Value 0.0000

F-Ratio 222.24

Homogeneous Groups X X X X

Count Mean 3 3 3 3

2.40567 2.72467 3.00567 4.11733

One-Way ANOVA - Khoi_Luong_Tuoi by Nghiem_Thuc of Tai Sinh Choi Dependent variable: Khoi_Luong_Tuoi (g) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 12 Number of levels: 4 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for Khoi_Luong_Tuoi. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of Khoi_Luong_Tuoi for the 4 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for Khoi_Luong_Tuoi by Nghiem_Thuc Sum of Squares Df Mean Square Source 3 4.98439 Between groups 8 0.0598087 Within groups 11 5.04419 Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of Khoi_Luong_Tuoi into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 222.237, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean Khoi_Luong_Tuoi from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for Khoi_Luong_Tuoi by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent LSD Nghiem_Thuc E3 E2 E1 E4

Sum of Squares Df Mean Square 3 0.03992 8 0.000122667 11 0.0400427

0.0133067 0.0000153333

P-Value 0.0000

F-Ratio 867.83

Homogeneous Groups X X X X

Count Mean 3 3 3 3

0.0953333 0.103333 0.187333 0.232667

One-Way ANOVA - Khoi_Luong_Kho by Nghiem_Thuc of Tai Sinh Choi Dependent variable: Khoi_Luong_Kho (g) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 12 Number of levels: 4 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for Khoi_Luong_Kho. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of Khoi_Luong_Kho for the 4 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for Khoi_Luong_Kho by Nghiem_Thuc Source Between groups Within groups Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of Khoi_Luong_Kho into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 867.826, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean Khoi_Luong_Kho from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for Khoi_Luong_Kho by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent LSD Nghiem_Thuc E1 E2 E3 E4

Sum of Squares Df Mean Square 3 4136.67 8 57.3333 11 4194.0

P-Value 0.0000

F-Ratio 192.40

1378.89 7.16667

Homogeneous Groups X X X X

Count Mean 3 3 3 3

6.0 9.66667 32.3333 52.0

One-Way ANOVA - So_Choi_Be_Hon_05_cm by Nghiem_Thuc of Tai Sinh Choi Dependent variable: So_Choi_Be_Hon_05_cm (choi) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 12 Number of levels: 4 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for So_Choi_Be_Hon_05_cm. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of So_Choi_Be_Hon_05_cm for the 4 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for So_Choi_Be_Hon_05_cm by Nghiem_Thuc Source Between groups Within groups Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of So_Choi_Be_Hon_05_cm into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 192.403, is a ratio of the between- group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean So_Choi_Be_Hon_05_cm from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for So_Choi_Be_Hon_05_cm by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent LSD Nghiem_Thuc E1 E2 E3 E4

Sum of Squares Df Mean Square 3 559.333 8 25.3333 11 584.667

P-Value 0.0000

F-Ratio 58.88

186.444 3.16667

Homogeneous Groups X X X X

Count Mean 3 3 3 3

24.3333 28.3333 36.0 42.0

One-Way ANOVA - So_Choi_Cao_Tu_05_cm_den_1_cm by Nghiem_Thuc of Tai Sinh Choi Dependent variable: So_Choi_Cao_Tu_05_cm_den_1_cm (choi) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 12 Number of levels: 4 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for So_Choi_Cao_Tu_05_cm_den_1_cm. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of So_Choi_Cao_Tu_05_cm_den_1_cm for the 4 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for So_Choi_Cao_Tu_05_cm_den_1_cm by Nghiem_Thuc Source Between groups Within groups Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of So_Choi_Cao_Tu_05_cm_den_1_cm into two components: a between- group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 58.8772, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean So_Choi_Cao_Tu_05_cm_den_1_cm from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for So_Choi_Cao_Tu_05_cm_den_1_cm by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent LSD Nghiem_Thuc E1 E2 E4 E3

P-Value 0.0000

F-Ratio 40.33

36.9722 0.916667

Homogeneous Groups X X X X

Count Mean 3 3 3 3

0.0 0.0 3.66667 7.33333

One-Way ANOVA - So_Choi_Cao_Tu_1_cm_Den_15_cm by Nghiem_Thuc of Tai Sinh Choi Dependent variable: So_Choi_Cao_Tu_1_cm_Den_15_cm (choi) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 12 Number of levels: 4 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for So_Choi_Cao_Tu_1_cm_Den_15_cm. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of So_Choi_Cao_Tu_1_cm_Den_15_cm for the 4 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for So_Choi_Cao_Tu_1_cm_Den_15_cm by Nghiem_Thuc Sum of Squares Df Mean Square Source 3 110.917 Between groups 8 7.33333 Within groups 11 118.25 Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of So_Choi_Cao_Tu_1_cm_Den_15_cm into two components: a between- group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 40.3333, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean So_Choi_Cao_Tu_1_cm_Den_15_cm from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for So_Choi_Cao_Tu_1_cm_Den_15_cm by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent LSD Nghiem_Thuc E4 E3 E2 E1

Sum of Squares Df Mean Square 3 5470.92 8 104.0 11 5574.92

P-Value 0.0000

F-Ratio 140.28

1823.64 13.0

Homogeneous Groups X X X X

Count Mean 3 3 3 3

37.6667 41.6667 74.3333 88.0

One-Way ANOVA - Tong_Choi by Nghiem_Thuc of Tai Sinh Choi Dependent variable: Tong_Choi (choi) Factor: Nghiem_Thuc Number of observations: 12 Number of levels: 4 The StatAdvisor This procedure performs a one-way analysis of variance for Tong_Choi. It constructs various tests and graphs to compare the mean values of Tong_Choi for the 4 different levels of Nghiem_Thuc. The F-test in the ANOVA table will test whether there are any significant differences amongst the means. If there are, the Multiple Range Tests will tell you which means are significantly different from which others. If you are worried about the presence of outliers, choose the Kruskal-Wallis Test which compares medians instead of means. The various plots will help you judge the practical significance of the results, as well as allow you to look for possible violations of the assumptions underlying the analysis of variance. ANOVA Table for Tong_Choi by Nghiem_Thuc Source Between groups Within groups Total (Corr.) The StatAdvisor The ANOVA table decomposes the variance of Tong_Choi into two components: a between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 140.28, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the mean Tong_Choi from one level of Nghiem_Thuc to another at the 95.0% confidence level. To determine which means are significantly different from which others, select Multiple Range Tests from the list of Tabular Options. Multiple Range Tests for Tong_Choi by Nghiem_Thuc Method: 95.0 percent LSD Nghiem_Thuc E1 E2 E3 E4

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Ảnh hưởng của nano bạc lên quá trình khử trùng mẫu trong vi nhân giống cây hoa african violet (Saintpaulia ionantha H. WendL.)

DƢƠNG BẢO TRINH

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC

LÊN QUÁ TRÌNH KHỬ TRÙNG MẪU

TRONG VI NHÂN GIỐNG

CÂY HOA AFRICAN VIOLET

(SAINTPAULIA IONANTHA H. WENDL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số ngành: 60420201

DƢƠNG BẢO TRINH

ẢNH HƯỞNG CỦA NANO BẠC

LÊN QUÁ TRÌNH KHỬ TRÙNG MẪU

TRONG VI NHÂN GIỐNG

CÂY HOA AFRICAN VIOLET

(SAINTPAULIA IONANTHA H. WENDL.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Dƣơng Tấn Nhựt

TRƢỜNG ĐH CÔNG NGHỆ TP. HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

PHÒNG QLKH – ĐTSĐH

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT

ABSTRACT

MỤC LỤC

Chƣơng 1

MỞ ĐẦU

Chƣơng 2

TỔNG QUAN

TÀI LIỆU

Chƣơng 3

VẬT LIỆU

VÀ

PHƢƠNG PHÁP

Chƣơng 4

KẾT QUẢ

VÀ

THẢO LUẬN

trùng lên sự cảm ứng của mẫu cấy

Bảng 4.4. Sự phát sinh hình thái khác nhau giữa nano bạc và chất khử trùng thông dụng sau 30 ngày nuôi cấy

Chƣơng 5

KẾT LUẬN

VÀ

KIẾN NGHỊ

DANH MỤC

CÁC CÔNG TRÌNH

TÀI LIỆU

THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Có thể bạn quan tâm

Bài giảng Virus: Chương 1 - Khái niệm cơ bản về vi rút

Luận án Tiến Sĩ: : Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của sản phẩm vi bao cao chiết từ cây Trâm vỏ đỏ (Syzygium zeylanicum (L.) DC.)

Báo cáo thực tập: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 (QUATEST 2)

Câu hỏi ôn tập môn Công nghệ sinh học nấm ăn và nấm dược liệu

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Công nghệ nông nghiệp năm 2025 - Sở GD&ĐT Cà Mau

Câu hỏi ôn tập kiểm tra học kì 2 môn Công nghệ chăn nuôi lớp 11 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Đề cương ôn tập học kì 2 môn Công nghệ nông nghiệp lớp 12 năm 2024-2025 - Trường THPT An Khánh

Virus Real-time PCR

Bài giảng Công nghệ sản xuất enzym - Lê Ngọc Khánh

Đề khảo sát giữa học kì 2 môn Khoa học tự nhiên lớp 9 năm 2024-2025 có đáp án - Trường THCS Xuân Tiến (Đề số 02)

Định danh chủng vi khuẩn Bacillus subtilis R1 phân lập từ rơm có hoạt tính phân huỷ huyết khối

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Công nghệ sinh học nano năm 2021-2022

Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử vi sinh vật - Trần Linh Thước

Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn lọc các chủng tảo Chlorella sp. được thu thập ở một số tỉnh Nam Bộ

Đề thi thử tốt nghiệp THPT môn Sinh học năm 2025 có đáp án - Trường THPT Xuân Lộc, Đồng Nai

Luận văn Thạc sĩ Công nghệ môi trường: Nghiên cứu áp dụng công nghệ sinh học theo mẻ (SBR) để xử lý nước thải sinh hoạt trong nhà cao tầng và khu dân cư quy mô tới 10000 người

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu đột biến và đa hình của một số gen ở trẻ em mắc bệnh teo đường mật bẩm sinh

Đề thi kết thúc học phần học kì 2 môn Công nghệ sinh học dinh dưỡng năm 2023-2024 có đáp án

Đề thi kết thúc học phần học kì 3 môn Quản lý chất lượng sản phẩm năm 2023-2024

Tài liêu mới

Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng thuật toán thích nghi và học tăng cường cấu trúc Actor - Critic điều khiển bám quỹ đạo cho robot di động đa hướng mecanum

Luận án Tiến sĩ: Cơ cấu bệnh tim mạch và chất lượng cuộc sống của người cao tuổi mắc suy tim, rung nhĩ điều trị tại Bệnh viện Thống Nhất, thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu hiện tượng nứt dăm đê sông vùng đồng bằng sông Hồng và dự báo khả năng bị nứt của một số đoạn đê

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu xây dựng giải pháp đảm bảo an toàn thông tin cho quá trình học liên kết dựa trên mật mã

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Phát triển năng lực đánh giá công nghệ cho học sinh trong dạy học môn Công nghệ 11 ở trường trung học phổ thông

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu phân loại chi cầu diệp – Bulbophyllum Thouars (Orchidaceae) ở vùng Tây Nguyên bằng phương pháp hình thái và phân tử

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm phân bố và dinh dưỡng của các loài lưỡng cư ở Vườn Quốc gia Bến En và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa